ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN XUÂN THÀNH
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH
HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG
SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Thái Nguyên, 2019
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN XUÂN THÀNH
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH
HÌNH ẢNH HUỲNH QUANG TẾ BÀO TRONG
SÀNG LỌC MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Ngành: Công nghệ sinh học
Mã số : 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1.TS. Đỗ Hữu Nghị
2.TS. Nguyễn Xuân Vũ
Thái Nguyên 2019
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu.
Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng và tuân thủ đúng quy tắc. Kết quả trình bày
trong luận văn được thu thập trong quá trình nghiên cứu là trung thực, chưa từng
được ai công bố trước đây.
Thái Nguyên, tháng 9 năm 2019
Tác giả
Nguyễn Xuân Thành
ii
LỜI CẢM ƠN
Luận văn này được thực hiện tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học
các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm KHCNVN) và có liên quan đến nội dung
nghiên cứu thuộc Đề tài "Phát triển kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh
quang nội hàm cao phục vụ sàng lọc, đánh giá các hợp chất có hoạt tính chống ung
thư mức độ tế bào và hướng đích phân tử" (VAST 04.05/18-19). Để hoàn thành
được luận văn này tôi đã nhận được sự động viên, giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá
nhân và tập thể.
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Đỗ Hữu Nghị và
TS. Nguyễn Xuân Vũ, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi rất tận tình trong
quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận
văn này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Hồng Nhung cán bộ tại phòng Sinh
học thực nghiệm (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm
KHCNVN) đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực
phẩm, các cán bộ trong Trường ĐH Nông Lâm- ĐH Thái Nguyên đã giúp đỡ, trang
bị kiến thức và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người thân đã giúp đỡ
động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn!
iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG......................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... vii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu. ..........................................................................................2
3. Đối tượng nghiên cứu. ........................................................................................2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn. ..............................................................2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 1
1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu....................................1
1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu ...............................................................2
1.2.1. Tổng quan về ung thư ...............................................................................2
1.2.2. Ung thư cổ tử cung ...................................................................................7
1.2.3. Sàng lọc các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ..........................9
1.2.4. Hoạt tính điều hòa chu kỳ tế bào (cell cycle) .........................................11
1.2.5. Hoạt tính điều hòa yếu tố nhân kappa B (NF-κB) .................................12
1.2.6. Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh
quang tế bào và đích phân tử ............................................................................15
Chương 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 22
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ................................................................22
2.2. Nội dung nghiên cứu......................................................................................22
2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ bộ và nghiên cứu tối ưu kỹ thuật
huỳnh quang tế bào. ..........................................................................................22
2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của chất thử và phân tích các tín
hiệu huỳnh quang đặc trưng. ............................................................................22
2.2.3.Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB. ......................22
2.3. Vật liệu. ..........................................................................................................22
2.3.1.Dòng tế bào ..............................................................................................22
2.3.2.Mẫu thử nghiệm.......................................................................................22
iv
2.3.3. Môi trường nuôi cấy tế bào ....................................................................23
2.3.4. Hóa chất và thiết bị. ................................................................................24
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................24
2.4.1. Nuôi cấy và hoạt hóa tế bào ...................................................................24
2.4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào – phương pháp MTT .....25
2.4.3. Kích hoạt yếu tố NF-κB .........................................................................27
2.4.4. Cố định tế bào .........................................................................................27
2.4.5. Nhuộm huỳnh quang tế bào và đích phân tử ..........................................28
2.4.6. Thu nhận và phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào trên hệ Olympus
scanR .................................................................................................................28
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 30
3.1. Sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư .......................................30
3.2. Đánh giá hoạt tính chống ung thư đích phân tử NF-κB trên dòng tế bào
HeLa ......................................................................................................................32
3.2.1. Kích thích chuyển vị NF-κB...................................................................32
3.2.2. Thu nhận hình ảnh huỳnh quang ............................................................33
3.2.3. Thiết lập thông số phân tích hình ảnh ....................................................35
3.2.4. Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB .....................................................37
3.2.5. Thử nghiệm hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB trên tế bào HeLa .........42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 43
1. Kết luận .............................................................................................................43
2. Đề nghị ..............................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44
v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CHLB:
Công hòa liên bang
CTC:
Cổ tử cung
DMEM:
Dulbecco’s modified Eagle medium – Môi trường nuôi cấy tế bào
DMEM
DMSO:
Dimethyl Sunfoxide
EMEM:
Eagle’s Minium Essential Medium – Môi trường EMEM
GFP:
Green fluorescent protein – Protein huỳnh quang xanh
HBV:
Hepatitis B virus – Viêm gan B
HCTN:
Hợp chất tự nhiên
HCV:
Hepatitis C virus – Viêm gan C
Hela:
Human cervical cancer cells – Tế bào ung thư cổ tử cung
Hep-G2:
Hepatocellular carcinoma – Tế bào ung thư gan
HPV:
Human papilloma virus – Virus u nhú ở người
IC50:
Inhibitory concentration 50%- Nồng độ ức chế 50% cá thể
KHCNVN:
Khoa học và công nghệ Việt Nam
MTT:
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide
NF-κB:
Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells – Yếu
tố nhân kappa B
OD:
Optical density – Mật độ quang học
PBS:
Phosphate buffer saline – Đệm muối phosphate
TB:
Tế bào
Tp:
Thành phố
UTCTC:
Ung thư cổ tử cung
UTG:
Ung thư gan
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng một số
hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học .................................................. 23
Bảng 3.1: Hoạt tính gây độc tế bào của một số mẫu hợp chất thiên nhiên trên
dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa .......................................................... 30
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư ......................................................... 3
Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế
giới năm 2018 cả hai giới ............................................................................ 5
Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư ........................................................... 6
Hình 1.4: Tín hiệu đích phân tử NF-κB liên quan các bệnh viêm. ........................... 13
Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang .................................... 21
Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan ......................................... 26
Hình 3.1: Biểu đồ khả năng ức chế tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở các
nồng độ khác nhau của các mẫu tinh sạch có biểu hiện hoạt tính ............. 32
Hình 3.3: Tương quan nồng độ chất cảm ứng và sự chuyển vị NF-κB ở dòng tế
bào HeLa. Các chất tiền viêm cytokine: IL-1 (─●─) và TNFα (--▲--) ......... 33
Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak
chỉnh tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z ................................... 34
Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65
(GFP-p65), DNA nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh quang
(MERGE). Hình ảnh được ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh quang
Olympus scanˆR. ......................................................................................... 35
Hình 3.6: Lựa chọn thông số xác định viền và kích thước hình ảnh đối tượng
phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 ................... 36
Hình 3.7: Tạo thông số xác định đường viền đối với đối tượng phân tích
chính Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tương ứng
vùng tế bào chất “CytoI”, kênh GFP). Hình ảnh đường viền phân
tách tốt với khoảng cách (distance) = -1. ................................................... 37
Hình 3.8: Phân tích hình ảnh thực trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis
ver.2.7.2. Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB bởi IL-110 ng/mL trong 30 phút......... 38
Hình 3.9: Phân tích sự chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang của protein
p65 vùng tế bào chất và trong nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm
Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2 ........................................................... 39
viii
Hình 3.10: Xác định hệ số Z' đối với nhóm đối chứng (control) và tế bào HeLa
kích hoạt với cytokine (hình-bảng trên). Biểu đồ phân tán cường độ tín
hiệu vùng tế bào chất và trong nhân với đối chứng Control (-) và kích
hoạt với IL-1 (hình dưới). ............................................................................ 41
Hình 3.11: Hợp chất SHTN-Zer4 điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB)
của tế bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa trên sự
chuyển vị NF-κB (p65 gắn GFP). Nhân được xác định đồng thời với
nhuộm DAPI. ............................................................................................. 42
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Nguồn hợp chất thiên nhiên (sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan
tâm lớn trong nghiên cứu phát triển các sản phẩm mới có ích cho con người từ xa
xưa tới nay. Sự đa dạng sinh học và hóa học trong sinh giới đã đóng một vai trò
quan trọng trong lĩnh vực này. Tuy nhiên, vấn đề đáng quan tâm là làm thế nào để
phát hiện và khai thác các chất có hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên này một
cách có hiệu quả. Qua quá trình phát triển với việc áp dụng những công nghệ tiên
tiến, ngày nay nghiên cứu hóa học định hướng hoạt tính sinh học đã trở thành cơ sở
chính của sàng lọc hiệu năng cao (High Throughput Screening -HTS) ở nhiều nước
trên thế giới nhằm phát hiện các hợp chất tiềm năng. Các phương pháp thử nghiệm
sinh học trong sàng lọc hoạt tính trở thành công cụ mạnh mẽ cho việc tìm kiếm các
hợp chất tiềm năng cho nhiều mục đích sinh học khác nhau. Trong đó lĩnh vực mà
các hợp chất thiên nhiên vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các thuốc
chống ung thư. Điển hình như gần đây nghiên cứu các hợp chất từ sinh vật biển đã
có nhiều thành công trong lĩnh vực này với ít nhất 15 chất đã được chứng nhận bởi
FDA hoặc qua thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư.
Công nghệ ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động được
phát triển nhằm truy suất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các mục đích
khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được các bước
thực nghiệm. Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có
thể quan sát các ảnh hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình tế bào từ
đó đưa ra các chuẩn đoán về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân
tay sinh học” (fingerprint). Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong
quá trình sống và phân chia của tế bào. Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi
huỳnh quang tế bào có thể được ứng dụng trong phân tích các tín hiệu tế bào (yếu tố
NF-κB, Wnd/fzd, akt, glucocorticoid receptor...), sinh lý tế bào (sự tăng sinh TB,
phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương
trình của TB - apoptosis), đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh
2
(miễn dịch, tim mạch, các bệnh truyền nhiễm...) và đánh giá chức năng phân tử
đích. Sử dụng kỹ thuật này trong đánh giá các chất tiềm năng giúp các nhà hóa học,
nhà dược học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời
gian, kinh phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung
cấp các thông tin về tác dụng dược lý của chất thử. Do vậy, kỹ thuật sàng lọc hiệu
năng cao dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào đang là nhân tố cốt lõi
trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại.
Nhằm tiếp cận và bước đầu ứng dụng kỹ thuật hiện đại trong sàng lọc đánh
giá các chất có hoạt tính sinh học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
"Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào
trong sàng lọc một số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học".
2. Mục tiêu nghiên cứu.
Mục tiêu đề tài luận văn là nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật phân tích
hình ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào trong sàng lọc các chất có hoạt tính chống ung
thư hướng đích phân tử (yếu tố nhân NF-κB) ở điều kiện trong nước.
3. Đối tượng nghiên cứu.
* Họat tính chống ung thư ở mức độ tế bào được sàng lọc trên dòng tế bào
ung thư cổ tử cung HeLa
* Đánh giá hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích chuyển vị protein nội
bào (yếu tố nhân NF-κB) sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào
với kính hiển vi huỳnh quang tự động.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.
Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các thử
nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn do các tương tác protein nội bào
xẩy ra nhanh và phức tạp. Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA
(electrophoretic mobility shift assay) thường được sử dụng để phát hiện liên kết đặc
hiệu NF-κB và DNA hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot. Một trong các yếu
điểm của phương pháp này là chúng không cung cấp đầy đủ thông tin trong mẫu
phân tích phức tạp và do đó thiếu độ tin cậy. Ví dụ, khi quan sát giảm 50 % độ
mạnh tín hiệu phát hiện được không đồng nghĩa với việc giảm 50 % trong 100 %
3
quần thể đó. Trong khi đó phân tích trắc lưu tế bào flow cytometry có thể cung cấp
nhiều dữ liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, tuy nhiên rõ ràng kỹ thuật này
không thể thu được các dữ liệu phân tích nội bào từ các tín hiệu huỳnh quang.
Những hạn chế này có thể được khắc phục bằng kỹ thuật phân tích hình ảnh tế bào
và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang. Do vậy chúng tôi nghiên
cứu kết hợp phương pháp miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh nội hàm
cao trên hệ thiết bị hiển vi tự dộng Olympus scanˆR với quy trình đơn giản hơn và
chi phí thấp, phù hợp với điều kiện trong nước. Hơn nữa, quy trình này đồng thời có
thể phát triển ứng dụng cho phân tích các phân tử đích protein khác với đặc tính
tương tự (chuyển vị nội bào tế bào chất - nhân), ví dụ như đối với NRF2 (nuclear
factor erythroid-related factor 2) - một yếu tố phiên mã liên quan đến stress oxy
hóa, ung thư và quá trình viêm.
1
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu
Ung thư là nguyên nhân gây chết hàng đầu ở các nước có nền kinh tế phát
triển và thứ hai ở các nước đang phát triển. Gánh nặng ung thư ở các nước đang
phát triển tăng lên do hậu quả của lối sống không lành mạnh như hút thuốc lá, uống
rượu bia, ít vận động hay ô nhiễm thực phẩm và môi trường. Chúng ta đã biết thực
phẩm lành mạnh đóng vai trò quan trọng trong phòng và điều trị bệnh mãn tính
không lây trong đó có ung thư. Chính vì vậy, hiện nay các nhà khoa học không
ngừng nghiên cứu tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt các hợp chất
thiên nhiên có nguồn gốc thực vật, góp phần tích cực hỗ trợ điều trị bệnh ung thư.
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm và mưa nhiều nên có
một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Với nguồn thực vật phong phú
không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa
bệnh hết sức quý giá bao gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói
chung. Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên có
sẵn ở nước ta để hỗ trợ điều trị ung thư đã và đang được nhiều nhà khoa học và thầy
thuốc đầu tư tập trung nghiên cứu trong nhiều năm nay [1].
Trong khoa học đã khám phá và sử dụng được nhiều hợp chất thiên nhiên
(HCTN) có hoạt tính sinh học quý từ động, thực vật và vi sinh vật. Tuy nhiên, thế
giới sinh vật rất phong phú và đa dạng, vẫn còn nhiều loài sinh vật chưa được
nghiên cứu khai thác, đặc biệt là các sinh vật ở biển sâu [3]. Do vậy, nguồn HCTN
(sinh vật biển và đất liền) luôn chiếm được sự quan tâm lớn trong nghiên cứu phát
triển dược phẩm mới có ích cho con người từ xa xưa tới nay. Việc sàng lọc các hoạt
chất tự nhiên có hoạt tính sinh học để xác định các chất tiềm năng là vấn đề cần
quan tâm đầu tiên trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc. Trong đó, lĩnh vực
mà các HCTN và bán tổng hợp vẫn giữ vai trò quan trọng là trong khai thác các
thuốc chống ung thư.
2
Công nghệ ghi hình ảnh tế bào (TB) sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự
động được phát triển nhằm truy xuất được các kết quả phân tích kiểu hình cho các
mục đích khác nhau và có thể phát triển quy mô sàng lọc trong khi giảm thiểu được
các bước thực nghiệm ngày nay đang được các nhà khoa học quan tâm và được
nhiều phòng thí nghiệm trong điểm quốc gia đầu tư bài bản và hiện đại. Bằng việc
sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể quan sát các ảnh
hưởng lên chức năng sinh lý và thay đổi về kiểu hình TB từ đó đưa ra các chẩn đoán
về phương thức tác động của chất thử dựa vào “dấu vân tay sinh học” (fingerprint).
Đó thường là các quá trình đóng vai trò then chốt trong chu trình sống và phân chia
của TB. Thật vậy, kỹ thuật phân tích hình ảnh hiển vi huỳnh quang TB có thể được
ứng dụng trong phân tích các tín hiệu TB (yếu tố NF-KB, Wnd/fzd, akt,
glucocorticoid receptor,…), sinh lý TB (sự tăng sinh TB, phosphoryl hóa, ty thể,
chu kỳ TB, chuyển vị nội bào, quá trình chết theo chương trình của TB - apoptosis),
đánh giá độc tính in vitro của thuốc/chất thử, sinh lý bệnh (miễn dịch, tim mạch, các
bệnh truyền nhiễm,…) và đánh giá chức năng giúp các nhà hóa học, các nhà dược
học đánh giá chính xác hơn về hiệu quả của chất thử do đó tiết kiệm thời gian, kinh
phí cho các thử nghiệm tiếp theo trên động vật (in vivo) đồng thời cung cấp các
thông tin về tác dụng dược lý của chất thử. Đề tài luận văn được thực hiện tại phòng
Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các HCTN) – là đơn vị đầu tiên được trang bị
hệ thống sàng lọc phân tích nội hàm cao trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus
scan’R (Heidelberg, CHLB Đức) sử dụng cho mục đích sàng lọc, đánh giá các chất
hoạt tính sinh học. Do vậy, đề tài này xuất phát từ yêu cầu và tính cấp thiết của việc
phát triển các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học đạt trình độ tiên tiến, có
độ chính xác cao, mặt khác nội dung thực hiện của đề tài này bao gồm sàng lọc,
phân tích hoạt tính chống ung thư của một số mẫu hợp chất thiên nhiên ứng dụng kỹ
thuật sàng lọc/phân tích hình ảnh huỳnh quang TB.
1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu
1.2.1. Tổng quan về ung thư
Ung thư là một thuật ngữ được sử dụng cho các bệnh mà các tế bào bất thường
phân chia không kiểm soát và các thể xâm nhập vào các mô khác. Các TB ung thư
có thể lan tới các bộ phận khác của cơ thể thông qua hệ thống máu và hạch bạch
huyết. Có hơn 100 loại ung thư khác nhau đã được biết đến trong y văn thế giới, hầu
3
hết chúng được đặt tên dựa vào mô hoặc cơ quan mà chúng gây bệnh [11]. Mỗi loại
ung thư đều trải qua nhiều giai đoạn thứ tự thời gian: giai đoạn khởi phát, giai đoạn
tăng trưởng và thúc đẩy, giai đoạn lan tràn, giai đoạn tiến triển – xâm lấn - di căn. Từ
một tế bào, qua quá trình khởi phát dẫn đến những biến đổi mà không thể khồi phục kết
quả là hình thành ung thư. Nếu không có sự sửa chữa hoặc có nhưng không kết quả thì
cuối cùng ung thư sẽ có biểu hiện trên lâm sàng và dẫn đến tử vong.
Hình 1.1. Các giai đoạn tiến triển bệnh ung thư
Ngày nay, ung thư đã trở thành một mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng và
đang thu hút sự chú ý trên toàn thế giới. Nguyên nhân ung thư có thể gây ra theo
một trong ba yếu tố, đó là: chế độ ăn uống không lành mạnh, yếu tố di truyền và các
yếu tố môi trường. Người ta ước tính khoảng 95% các loại ung thư là do lối sống và
có thể mất khoảng 20 - 30 năm để phát triển thành ung thư. Con người hiện tại đang
phải đối mặt với tỷ lệ ung thư và tử vong do ung thư ngày càng tăng [20]. Trong
năm 2018, đã có khoảng 9,6 triệu người tử vong và hơn 18 triệu người bị ảnh hưởng
trực tiếp bởi các loại ung thư khác nhau trên quy mô thế giới theo số liệu
GLOBOCAN toàn cầu gần đây nhất của cơ cơ quan nghiên cứu Ung thư Quốc tế
[28]. Các số liệu thống kê cho thấy đàn ông thường bị ung thư phổi, gan, ruột kết,
trực tràng và ung thư tuyến tiền liệt, trong khi phụ nữ thường bị ung thư vú, ruột
già, trực tràng và ung thư dạ dày [6].
Tại Việt Nam, Bộ Y tế dự báo rằng thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ ung thư, bệnh tim
mạch và các bệnh không lây nhiễm khác do quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa,
cộng thêm các di chứng của chiến tranh vẫn tồn tại và đe dọa đến sức khỏe con
người mỗi ngày [7]. Theo thống kê của một số bệnh viện ung bướu ở Hà Nội, Hồ
Chí Minh và một số tỉnh khác trong năm 2008, có khoảng 100.000 đến 150.000
4
người mắc phải các loại ung thư khác nhau và trên 73% bệnh nhân (khoảng 70.000
bệnh nhân) tử vong cao nhất trên thế giới và con số này có xu hướng tăng trong
tương lai gần. Dự báo đến năm 2020 sẽ có khoảng 200.000 ca ung thư mới và
100.000 ca tử vong mỗi năm tại Việt Nam [31].
Những bệnh ung thư phổ biến nhất thế giới
5
Hình 1.2: Tỷ lệ mắc bệnh mới và tỷ lệ chết do các bệnh ung thư trên toàn thế giới
năm 2018 cả hai giới .
6
Ung thư là một bệnh di truyền vì hầu hết các loại ung thư phát sinh từ sự thay đổi
(đột biến) trong ADN (deoxyribonucleic acid) của TB bình thường. Ung thư bắt đầu
gây tổn hại tới một hoặc nhiều gen trong một TB đơn lẻ. Tổn thương này làm cho các
TB tăng sinh không kiểm soát được và tạo ra những TB bất thường. Ở giai đoạn này,
nếu hệ thống miễn dịch của cơ thể không tiêu diệt hay sửa chữa những TB bất thường
này, thì chúng sẽ phát triển và cuối cùng chuyển thành TB ung thư. Các đặc tính của
TB ung thư là chúng phân chia nhanh hơn các TB bình thường và hình thành khối u ác
tính, những khối u này sẽ xâm nhập các mô khỏe mạnh. Quá trình của một TB bình
thường trở thành khối ung thư thường mất nhiều năm để phát triển.
Hình 1.3: Sự phát triển của các tế bào ung thư
7
Trong nghiên cứu in vitro cũng đã phân lập được hơn 200 dòng tế bào ung thư
ở người và ngày càng được các phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm ứng dụng
cho việc sàng lọc để tìm kiếm các thuốc tiềm năng chống ung thư trong tương lai.
Trong đó có thể kể đến hai dòng ung thư phổ biến là dòng tế bào ung thư gan người
(HepG2) và dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở người (HeLa). Ngày nay, việc nghiên
cứu sàng lọc để tìm kiếm các hoạt chất chống lại ung thư đã và đang được quan tâm
hàng đầu từ các nhà khoa học theo hướng ức chế biểu hiện hoạt tính của một
enzyme tham gia vào quá trình phát triển và di căn khối u, hoặc ức chế sự hình
thành mạch và sự xâm nhập của các khối u nguyên phát ở mức độ tế bào, do đó có
thể được sử dụng để ức chế sự di căn của khối mô ung thư.
1.2.2. Ung thư cổ tử cung
Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là ung thư hình thành trong mô cổ tử cung
(CTC) được gây ra bởi việc nhiễm virus sinh nhú ở người (HPV). Hầu hết các
trường hợp UTCTC đều bắt đầu trong vùng chuyển tiếp giữa cổ trong và cổ ngoài,
các TB vùng chuyển tiếp bị tổn thương, nhiễm HPV và biến đổi dẫn dần, phát triển
thành các tổn thương tiền ung thư rồi UTCTC. UTCTC là bệnh ung thư tiến triền
chậm, giai đoạn đầu thường không có triệu chứng và có thể phát hiện thông qua các
phương pháp sàng lọc UTCTC [2].
UTCTC gồm hai loại chính là ung thư TB biểu mô vảy và ung thư TB tuyến,
khoảng 80% đến 90% UTCTC là ung thư TB biểu mô vảy phát triển trong TB vảy
bao phủ bề mặt vùng cổ ngoài CTC, thường bắt đầu ở vùng chuyển tiếp. Ung thư
TB tuyến CTC phát triển từ các TB trụ vùng cổ trong CTC. Có tỷ lệ rất nhỏ UTCTC
có các tổn thương của cả hai loại ung thư biểu mô TB vảy và TB tuyến gọi là ung
thư hỗn hợp [2].
1.2.2.1. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên Thế giới
UTCTC là loại ung thư hay gặp ở nữ giới. Bệnh tiến triển qua nhiều năm, ước
tính trên thế giới có khoảng 1,4 triệu phụ nữ mắc UTCTC và nhiều hơn gấp 2 - 5
lần (khoảng 7 triệu) phụ nữ có triệu chứng tiền lâm sàng cần được phát hiện và điều
trị. Theo kết quả của các ghi nhận ung thư trên thế giới, UTCTC đứng hàng thứ ba
trong các loại ung thư chung, đứng thứ hai trong các ung thư ở nữ giới sau ung thư
- Xem thêm -