Tài liệu Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện sớm và dự báo tiên lượng của ung thư tế bào gan nguyên phát trên bệnh nhân nhiễm virut viêm gan b (hbv)

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỆNH VIỆN TƯQĐ 108 CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC 10-06 BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG PHÁT HIỆN SỚM VÀ DỰ BÁO TIÊN LƯỢNG CỦA UNG THƯ TẾ BÀO GAN NGUYÊN PHÁT TRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUT VIÊM GAN B (HBV) Mã số KC.10.21 /06-10 Cơ quan chủ trì đề tài: BỆNH VIỆN TƯQĐ 108 Chủ nhiệm đề tài: TS. Lê Hữu Song 8708 Hà nội - 2010   ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư tế bào gan nguyên phát (viết tắt là UTG) hay là ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular Carcinoma, HCC) là bệnh lý thường gặp đứng hàng thứ 5 trên thế giới, có tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ 3 trong các tử vong liên quan đến ung thư [1], [2]. UTG thường được chẩn đoán xác định ở giai đoạn muộn khi có triệu chứng như biểu hiện mệt mỏi, đau bụng, gầy sút cân, thậm chí khi đã có khối khu trú sờ được trên thành bụng, khi có tổn thương tế bào gan hoặc muộn hơn khi không còn khả năng can thiệp phẫu thuật cũng như sử dụng các phương pháp trị liệu khác [3]. Nguyên nhân chẩn đoán UTG muộn là do sự hạn chế về các phương pháp phát hiện hiện nay. Các phương pháp chẩn đoán UTG đang được sử dụng tại các cơ sở y tế bao gồm: khám xét lâm sàng phát hiện thấy gan to, đau, gầy sút cân nhanh…, các xét nghiệm máu phát hiện dấu ấn ung thư AFP, siêu âm, X quang, nội soi, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner), cộng hưởng từ (Magnetic Resonany Imaging, MRI), sinh thiết gan chẩn đoán mô bệnh học ... Tuy nhiên, tất cả các phương pháp trên thường phát hiện được UTG ở giai đoạn muộn của bệnh. Khi đó các biện pháp can thiệp điều trị ít mang lại hiệu quả, thời gian sống của bệnh nhân sau khi chẩn đoán UTG chỉ kéo dài từ 6 tháng đến 1 năm. Vì vậy, nghiên cứu tìm hiểu các dấu ấn sinh học, các biện pháp chẩn đoán mới để phát hiện sớm và tiên lượng UTG là nhu cầu cần thiết hiện nay. Kết quả các nghiên cứu trước đây đã chứng minh nhiễm virut viêm gan B (HBV) là nguyên nhân chủ yếu gây UTG. Tuy nhiên không phải tất cả các bệnh nhân nhiễm HBV đều tiến triển thành UTG. Nhiễm HBV có thể gây viêm gan cấp tính tự hồi phục, hoặc tiến triển thành viêm gan mạn tính, xơ gan, viêm gan ác tính, hoặc trở thành người mang HBV mạn tính không triệu chứng [4]. Nguyên nhân nào dẫn đến sự khác biệt đó vẫn còn nhiều tranh luận. Liên quan đến UTG người ta thấy rất nhiều các bệnh nhân được phát hiện bệnh một cách 1 tình cờ, nghĩa là UTG thường xuất hiện trên các bệnh nhân trước đây hoàn toàn khỏe mạnh nhưng mang HBV mạn tính không triệu chứng. UTG cũng như tất cả các bệnh ung thư khác nói chung là hậu quả của biến đổi nhiều gene, tương tác qua lại của nhiều protein, DNA trong các tế bào. Do đặc điểm bộ gene và vòng đời của HBV có liên quan chặt chẽ đến sự hình thành UTG nên việc tìm ra các dấu ấn phân tử của HBV như đột biến gene, mức độ biểu hiện gene HBV và gene người là một trong những hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm [4]. Việt Nam là nước có người nhiễm HBV đứng hàng cao nhất thế giới, tỷ lệ HBsAg (+) ở người lớn khoẻ mạnh từ 10 – 20% có nơi lên tới 26% [5]. Như vậy, ước tính có hơn 10 triệu người đang mang HBV mạn tính ở nước ta và nguy cơ phát sinh UTG ở những người này là rất lớn. Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài này nhằm các mục tiêu sau: 1. Xác định tỷ lệ và mối liên quan giữa đột biến gene của HBV và bệnh nhân ung thư tế bào gan nguyên phát. 2. Xác định các phương pháp phát hiện sớm ung thư tế bào gan nguyên phát trên bệnh nhân nhiễm HBV. 2 Chương I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình dịch tễ bệnh ung thư gan trên thế giới Ung thư gan nguyên phát là ung thư phổ biến, đứng hàng thứ 5 trong số các bệnh ác tính và là nguyên nhân thứ 3 gây tử vong, chỉ sau ung thư phổi và dạ dày. Hàng năm có khoảng 500 000 - 1000 000 ca bệnh mới phát hiện, và tử vong khoảng 600 000 người [2]. Mặc dù hiện nay tỷ lệ mắc ung thư gan còn tương đối thấp, tuy nhiên số liệu có xu hướng tăng dần trên các nước phát triển [6]. Ung thư gan là nguyên nhân thứ tư gây tử vong trong số các ung thư, sau ung thư phổi, dạ dày và đại trực tràng. Nhưng đối với nam giới ung thư gan là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 3, còn nữ giới đứng hàng thứ 5 [7]. Ung thư gan thường tăng theo tuổi, tỷ lệ xuất hiện ung thư thường gặp nhất là sau tuổi 65. Mặc dù ung thư gan thường ít gặp ở tuổi dưới 50 ở Bắc Mỹ và Tây Âu, nhưng số liệu gần đây cũng cho thấy tuổi mắc ung thư có xu hướng trẻ hơn trong khoảng thời gian 2 thập kỷ qua [8]. Ung thư gan cũng thường xảy ra trên các bệnh nhân xơ gan. Tại các nước phương Tây tỷ lệ bệnh nhân ung thư gan trên nền xơ gặp trên 90%, trong khi đó tại các nước châu Á và châu Phi thì ung thư gan gặp nhiều hơn trên các bệnh nhân không có xơ gan [9]. 1.2. Tình hình dịch tể ung thư gan tại Việt nam Ung thư gan là một trong 5 loại ung thư thường gặp và Việt Nam là quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan đứng hàng thứ 3 trên thế giới. Đặc biệt, tỉ lệ nam mắc bệnh nhiều hơn nữ. Theo “Ghi nhận ung thư quần thể” tại Tp.HCM 2006, ung thư gan đứng hàng thứ 1 ở nam giới với tần suất là 3 24,2/100.000 dân và đứng hàng thứ 5 ở nữ giới với tần suất là 6,2 / 100.000 dân. Tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM, mỗi năm tiếp nhận khoảng 500 ca ung thư gan mới. Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam có đến 10.000 ca mắc bệnh mới, và trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu thế giới. Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn muộn nên việc chữa trị không còn hiệu quả [10], [11]. Do ung thư gan thường đa ổ và đa vị trí nên ngay trong những trường hợp ung thư gan khu trú có phẫu thuật, chỉ khoảng 30-40% bệnh nhân sống được thêm 5 năm, còn trung bình là khoảng 3 năm. Một nghiên cứu gần đây dựa trên các số liệu hiện có và sử dụng các thuật toán để tính toán tiên lượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính tăng từ 6.4 triệu người năm 1990 lên khoảng 8.4 triệu năm 2005 và tiên lượng đến năm 2025 là 8 triệu. Đó là kết quả của chương trình tiêm chủng để phòng nhiễm HBV. Trong khi đó tỷ lệ xơ gan và UTG do HBV lại có xu hướng tăng cao: năm 1990 là 21.900 đối với xơ gan, 9400 đối với UTG thì đến năm 2025 các số liệu tương ứng đó là 58.650 và 25.000. Tỷ lệ tử vong do HBV tăng từ 12.600 năm 1990 lên 40.000 ở năm 2025 [11]. 1.3. Các yếu tố nguy cơ gây ung thư gan Yếu tố nguy cơ chủ yếu nhất để tiến triển thành ung thư gan là xơ gan. Tuy nhiên tại Mỹ có hơn ¼ các trường hợp ung thư gan không tìm thấy các yếu tố nguy cơ. Các yếu tố nguy cơ tiến triển thành ung thư gan được biết khác là virut viêm gan B và C, chất độc như rượu và Aflatoxins, rối loạn chuyển hoá như đái tháo đường và gan nhiễm mỡ, bệnh nhiễm sắt sắc tố di truyền và liên quan các yếu tố miễn dịch như xơ gan mật nguyên phát và viêm gan tự miễn [8]. 4 Theo tổ chức y tế thế giới HBV là yếu tố thứ hai sau thuốc lá được cho là nguyên nhân gây ung thư ở người. Từ trước tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về nguy cơ ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HBV được tiến hành tại các nước Đông Á, nơi mà hầu hết bệnh nhân nhiễm HBV từ khi mới sinh ra [12]. 1.4. Một số hiểu biết về HBV Cơ chế gây ung thư trên bệnh nhân nhiễm HBV đã được nghiên cứu rất tích cực và kết quả đã khẳng định HBV là một nguyên nhân quan trọng chủ yếu gây UTG [13]. Để phản ánh rõ hơn vai trò của HBV trong UTG chúng tôi xin tóm tắt một số hiểu biết về HBV hiện nay. 1.4.1. Cấu trúc của HBV 1.4.1.1. Đặc điểm hình thái HBV là loại virus nhỏ thuộc họ Hepadnavirus. Đây là loại virus viêm gan duy nhất có nucleic acid nhân là DNA. Dưới kính hiển vi điện tử người ta thấy có 3 loại tiểu thể khác nhau của HBV: • Tiểu thể hình cầu nhỏ có đường kính 22nm. • Tiểu thể hình ống (hình que) có đường kính 20-22nm, dài từ 40400nm. • Tiểu thể hình cầu lớn (còn gọi là tiểu thể Dane) có đường kính là 42-45nm. Hai tiểu thể hình cầu và hình ống là phần vỏ thừa ra trong quá trình nhân lên của hạt virus hoàn chỉnh (Dane), đây cũng chính là các kháng nguyên bề mặt HBsAg của HBV. Các tiểu thể cầu nhỏ và hình ống có thể đứng riêng rẽ hoặc đứng với nhau thành từng cụm, chúng không phải là hạt virus hoàn chỉnh nên không có khả năng lây nhiễm. 5 A B Hình 1.1. Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV Tiểu thể Dane chính là hạt HBV hoàn chỉnh được cấu tạo như sau: Lớp vỏ ngoài cùng của hạt virus được cấu tạo bởi các protein bề mặt gọi chung là Hepatitis B surface protein (HBs). Lớp vỏ này bao bọc xung quanh một protein được đặt tên là protein lõi- Hepatitis B core protein (HBc) hay còn gọi là capsid. Lớp capsid này bao bọc xung quanh vòng DNA nhân và enzym phiên mã ngược polymerase của HBV (hình 1.2). Hình 1.2. Hạt virus hoàn chỉnh Hình 1.3. Hình ảnh hiển vi điện tử HBV (tiểu thể Dane) của HBV [14] 6 1.4.1.2. Đặc điểm di truyền Bộ gen của HBV là một phân tử DNA mạch kép dạng vòng không hoàn chỉnh, kích thước khoảng 3,2kb, được cấu tạo bởi hai chuỗi đơn ngược dấu và có chiều dài không bằng nhau. Chuỗi dài (chuỗi âm) nằm ngoài tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3,2Kb mang toàn bộ thông tin di truyền của HBV. Chuỗi ngắn (chuỗi dương) nằm trong có kích thước thay đổi chỉ chiếm khoảng 50-80% chuỗi dài. Hệ gen của HBV có bốn khung đọc mở (open-reading frame) ORF gối lên nhau hoàn toàn hoặc không hoàn toàn nhằm giảm thiểu chiều dài của bộ gen, bao gồm: gen lõi C, gen bề mặt S, gen X, gen polymerase P. Các gen này mã hóa cho toàn bộ các protein của virus. Sự bắt cặp bổ sung của các nucleotide trên vùng gối của hai sợi (âm và dương) được giới hạn bởi hai trình tự lặp trực tiếp DR1 và DR2 cho phép quá trình khép vòng của hệ gen xảy ra khi protein P (polymerase) liên kết đồng hóa trị với đầu 5’ của sợi âm (hình 1.4). ORF của gen S khá dài chứa ba codon khởi đầu ATG chia ORF này thành ba vùng Pre-S1, Pre-S2 và S mã hóa cho ba dạng protein bề mặt hay còn gọi là các kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của virus: kháng nguyên S nhỏ mã hóa bởi gen S (226 anino acid- a.a), kháng nguyên S trung bình mã hóa bởi gen Pre-S2/S (thêm 55 a.a so với kháng nguyên S nhỏ), kháng nguyên S lớn mã hóa bởi gen Pre-S1/Pre-S2/S (tùy thuộc vào từng kiểu huyết thanh (serotype) thêm 108 a.a hoặc 119 a.a so với kháng nguyên S trung bình). ORF của gen C mang hai bộ ba khởi đầu mã hóa hai loại protein: protein cấu trúc của lớp vỏ nucleocapside có vai trò quan trọng trong việc lắp gép hạt virus (kháng nguyên lõi- HBcAg); protein Pre- core là tiền thân của một loại kháng nguyên sớm được tiết ra bởi những tế bào bị xâm nhiễm (HBeAg). 7 ORF của gen X mã hóa cho kháng nguyên X (HBxAg), kháng nguyên này không tham gia vào cấu trúc của virus. Có rất nhiều ghi nhận về mối liên hệ giữa protein này với cơ chế sinh ung thư của tế bào gan bị nhiễm [15], [16], [17]. ORF của gen P chiếm 80% chiều dài bộ gen, mã hóa một enzym đa chức năng có kích thước 831a.a được gọi là protein P (polymerase hoặc Pol). Enzym này có trách nhiệm thực hiện các chức năng sau trong quá trình tái tạo virus: (i) đóng khung RNA tiền hệ gen của virus; (ii) “mồi” cho quá trình tổng hợp DNA; (iii) phiên mã ngược RNA tiền hệ gen thành DNA sợi đôi; (iv) có hoạt tính RNAse-H để biến tính RNA tiền hệ gen. Protein này cũng là mục tiêu lý tưởng cho các thành phần kháng virus được sử dụng trong điều trị viêm gan B mạn tính [18]. A B Hình 1.4. Cấu trúc bộ gen HBV tương ứng với các mRNA (A) và với các protein (B) Cấu trúc của gen polymerase HBV bao gồm 4 vùng bảo toàn đã được xác định thông qua so sánh với trình tự enzym phiên mã ngược của HIV và được xác nhận lại bởi các nghiên cứu di truyền và chức năng virus. Bốn vùng khác nhau trong protein P được thể hiện ở hình 1.5 [18]. 8 Hình 1.5. Gen S và P gối nhau trong cấu trúc gen HBV. Gen S mã hóa các protein vỏ (nhỏ- SHBsAg, trung bình- MHBsAg và lớn LHBsAg). Vùng háo nước lớn (Major Hydrophilic Region- MHR) từ a.a 101 đến 160. Yếu tố a nằm trong vùng này. Vị trí xúc tác của enzym phiên mã ngược của HBV (RT) tại vùng YMDD. ™ Protein tận cùng (Terminal protein) là một phần của polymerase đóng vai trò như đoạn mồi trong quá trình phiên mã ngược, do đó đây là nơi bắt đầu quá trình tổng hợp sợi âm [19]. Các đột biến điểm tại vùng này làm polymerase virus không thể đóng vòng RNA tiền hệ gen dẫn đến HBV mất khả năng tái tạo [18]. 9 ™ Vùng đệm (Spacer) không có hoạt tính enzym và không mang những vị trí kháng thuốc, cho đến nay chức năng của vùng này vẫn chưa được sáng tỏ. ™ Vùng RT/ polymerase là vùng chức năng nơi mà quá trình phiên mã ngược và tổng hợp sợi DNA thứ hai diễn ra. Vùng này được chia thành 7 miền nhỏ A, B, C, D, E, F, G. Vị trí tổng hợp nằm trong miền C xung quanh trình tự YMDD là một motif bảo toàn cao giữa các Hepadnavirus và Retrovirus và được coi là vùng nhận biết nucleotide của enzym virus. Các đột biến điểm gây nên hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra trong miền A, B và C. Trong miền C các đột biến điểm biến motif YMDD thành YIDD, YVDD, YRDD và YSDD là phổ biến nhất và rất có ý nghĩa trong lâm sàng. ™ Vùng RNAse-H có hoạt tính loại bỏ RNA khuôn. 1.4.2. Cơ chế nhân lên của HBV Sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ (với Human hepatitis B virus là người và tinh tinh; đối với Duck hepatitis B virus và Squirrel hepatitis virus là vịt, sóc, chồn…) và vượt qua hàng rào bảo vệ của hệ thống miễn dịch, HBV sẽ di chuyển tới tổ chức gan theo hệ thống tuần hoàn. Cơ chế thâm nhập của HBV vào trong tế bào gan cho tới nay vẫn chưa được làm rõ mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu công bố về phương thức gắn kết của đoạn Pre-S1 trên protein bề mặt của HBV với một số các thụ cảm thể trên bề mặt tế bào gan [20], [21], [22]. Quá trình nhân lên của HBV được tóm tắt như sau: Protein bề mặt của HBV có các vị trí gắn đặc hiệu với các thụ cảm thể trên bề mặt tế bào gan, nhờ đó virus xâm nhập được vào trong tế bào gan. Sau khi hòa màng, virus lột bỏ hết lớp vỏ ngoài và giải phóng lõi DNA vào trong nhân của tế bào gan. Tại đây, bộ gen của virus từ một vòng DNA kép không hoàn chỉnh được biến đổi thành cccDNA hoạt động như một khuôn phiên mã 10 tạo ra các mRNA của virus. Các mRNA này được vận chuyển qua màng nhân ra tế bào chất và được dịch mã tạo ra các protein virus: protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBcAg), HBeAg, Pol, protein HBx và một số protein khác chưa xác định. Ngay sau khi được tổng hợp, các protein này tự động “lắp ghép” với mRNA của virus. Từ mRNA, nhờ khả năng phiên mã ngược của protein Pol tổng hợp hai chuỗi đơn DNA của virus để tạo thành hạt HBV hoàn chỉnh rồi được “nảy chồi” để lắp ráp nốt các kháng nguyên bề mặt khi đi qua mạng lưới nội chất. HBV lúc này đã hoàn thiện sẽ thoát ra khỏi tế bào và đi vào hệ tuần hoàn rồi tiếp tục xâm nhiễm các tế bào gan khác để thực hiện chu trình nhân lên mới. Hình 1.6. Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [21] Trong suốt quá trình trên, một số HBV DNA mới được hình thành trong tế bào chất có thể quay trở lại nhân tế bào để tổng hợp cccDNA để từ đó lại hình thành nên các hạt virus hoàn chỉnh khác [20], [21]. Chu trình đó cứ tái 11 diễn nhiều lần trong suốt thời gian tồn tại của HBV trong cơ thể vật chủ. Người ta ước tính ở mỗi bệnh nhân mang HBV mạn tính mỗi ngày có khoảng 1011 hạt virus được tạo thành [18], [23]. Trong một số trường hợp, các sản phẩm protein như HBsAg có thể được tổng hợp dư thừa dẫn đến hiện tượng ở một số bệnh phẩm chúng ta thấy các tiểu thể kích thước nhỏ (32nm) hình cầu hoặc hình ống. Đây là một trong những nguyên nhân giải thích tại sao việc định lượng nồng độ HBsAg trong máu ít có giá trị trong việc đánh giá mức độ hoạt động của HBV. Tất cả các hạt HBV hoàn chỉnh cũng như các tiểu thể không hoàn chỉnh đều có trong máu và lưu hành trong hệ tuần hoàn. Trong quá trình nhân lên, do enzyme Pol của HBV không có hoạt tính tự đọc sửa dẫn đến hậu quả là tần suất đột biến xuất hiện rất cao, ước tính mỗi năm có từ 1,5 x 10-5 đến 5 x 10-5 vị trí nucleotide thay thế ở những người có HBeAg (+) [18], [23]. Sự thay đổi trên bộ gen của HBV xảy ra sau những đột biến rải rác và có thể là sự chọn lọc ưu thế đối với đáp ứng miễn dịch của vật chủ và các yếu tố khác như kháng thuốc điều trị [18]. Tỷ lệ xuất hiện các đột biến hoặc các đột biến cộng hợp trên HBV ở bệnh nhân có HBeAg (-) được ghi nhận là cao hơn các đối tượng khác. Theo Desmond kết quả này gợi mở khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ có thể có vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của HBV [23]. Trong một số trường hợp quá trình nhân lên của HBV không được thực hiện một cách tuần tự và chính xác như trên dẫn đến việc xuất hiện các đột biến gen và xa hơn nữa là sự xuất hiện của những kiểu gen HBV khác nhau [18]. 1.4.3. Cơ chế bệnh sinh của HBV Quá trình nhân lên của HBV không gây độc trực tiếp cho tế bào chủ. Thực tế này hoàn toàn phù hợp với những nghi nhận trên các bệnh nhân VGB không triệu chứng, mặc dù vẫn ghi nhận được sự nhân lên của virus nhưng hầu như không gây tổn thương gì cho tế bào gan của nhóm người bệnh này. 12 Ngày nay các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, chính cơ chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại các kháng nguyên của virus được biểu hiện trên bề mặt tế bào gan bị lây nhiễm là nguyên nhân làm tổn thương tế bào gan. Cơ chế này đã được minh chứng bởi dấu hiệu lâm sàng trên các bệnh nhân có sức đề kháng kém; khi bị nhiễm HBV, mức độ tổn thương gan cấp tính chỉ ở mức độ trung bình nhưng lại có tỷ lệ tiến triển sang thể mạn tính rất cao [18]. Hình 1.7. Cơ chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với HBV [21] Cơ chế đáp ứng miễn dịch đối với HBV và vai trò của nó đối với cơ chế bệnh sinh vẫn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ. Những nghiên cứu lâm sàng trên máu ngoại vi cho thấy cơ chế đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với các kháng nguyên của HBV diễn ra như sau (hình 1.7): Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan tạo ra vô số các hạt virus cũng như các các protein HBsAg. Cả hai cấu tử trên đều bị tế bào trình diện kháng nguyên bắt giữ và phân cắt thành các mảnh peptid. Các mảnh peptid được gắn trên các phân tử MHC-I, MHC-II trên bề mặt tế bào và được trình diện ra ngoài. Các thụ thể 13 trên tế bào bổ trợ trưởng thành CD4+ nhận biết các kháng nguyên của virus được trình diện trên phân tử MHC-II, kích hoạt Lympho T gây độc CD8+. Các thụ thể trên CD8+ nhận diện các kháng nguyên của virus được gắn với phân tử MHC-I, ghi nhớ chúng rồi thực hiện cơ chế đáp ứng miễn dịch theo hai con đường: (i) một mặt kích thích hệ miễn dịch sinh ra TNF α và interferon γ để ngăn cản sự nhân lên của virus xung quanh tế bào gan nhưng không tiêu diệt tế bào chủ này; (ii) mặt khác tìm kiếm các mảnh peptid gắn với MHC-I trên bề mặt tế bào gan để tiêu diệt, qua đó tiêu diệt luôn tế bào gan [21]. 1.4.4. Cơ sở của sự đa dạng bộ gen HBV Nhờ protein Pol của HBV là một enzym đa chức năng, vừa có hoạt tính của RNAnase vừa có hoạt tính DNAnase nên virus này có khả năng tái bản với tốc độ cao trong tế bào lây nhiễm. Tuy nhiên, protein này không có hoạt tính đọc sửa nên trong quá trình tái bản bộ gen virus xảy ra các đột biến với tỷ lệ cao, ước tính từ 1,4 đến 3,2 x 10-5 sự thay thế nucleotide tại mỗi vị trí trong một năm [21]. Tỷ lệ này thấp hơn một đến hai lần so với các virus mang enzym polymerase không có chức năng đọc sửa ở các RNA virus nhưng lại cao hơn các DNA virus khác tới bốn lần [18], [24]. Kết quả là, quần thể HBV có thể tiến hóa nhanh hơn hầu hết các DNA virus khác trong khả năng đáp ứng với các tác nhân môi trường, và sự xuất hiện của các đột biến dưới những áp lực của những tác nhân này có thể là những hiện tượng xảy ra thường xuyên. Gần đây, khi nghiên cứu quá trình tiến hóa của 8 bộ gen HBV kiểu gen B từ các bệnh nhân âm tính HBeAg (không điều trị) trong giai đoạn 25 năm, Osiowy (2006) đã ghi nhận được tỷ lệ thay thế nucleotide ước tính là 7,9 x 10-5 nucleotide/vị trí/năm. Điều thú vị là, khi nghiên cứu một bệnh nhân nhiễm HBV kiểu gen F có kháng thể kháng HBsAg trong giai đoạn 3 năm, một tỷ lệ lớn hơn đã được ghi nhận 2,7 x 10-3 [25]. 14 Ngoài cơ chế gây đột biến điểm do thiếu khả năng đọc sửa của protein Pol, còn có các cơ chế tiềm tàng khác làm phát sinh các biến thể bộ gen HBV như: chỉnh sửa DNA virus bởi cytidine deaminase của tế bào (xúc tác thay thế Guanine thành Adenine và Cytosine thành Thymine), hay thêm/bớt các đoạn trình tự trong hệ gen HBV do quá trình ghép nối RNA tiền hệ gen bởi enzym topoisomerase I trong tế bào [26]. Tất cả các nhân tố trên đều góp phần hình thành những biến dị di truyền và là nguyên nhân sâu xa tạo nên sự đa dạng của các chủng HBV. Những kiểu gen (genotype), kiểu gen phụ (subgenotype), kiểu huyết thanh phụ thuộc HBsAg (serotype) mặc dù cùng chung một nguồn gốc nhưng có lịch sử tiến hóa riêng rẽ để tạo nên sự ổn định về mặt di truyền. Chúng xuất hiện trong những quần thể người đặc trưng và di trú cùng với vật chủ tới các khu vực khác nhau tạo nên sự phân bố địa lý của các chủng HBV trên toàn thế giới. Hơn thế nữa, quá trình tái tổ hợp giữa các kiểu gen tạo ra các biến thể mới cũng góp phần tạo nên sự đa dạng di truyền của HBV [27]. Trong phạm trù biến dị di truyền, cần phải phân biệt rõ ràng giữa các kiểu gen HBV và đột biến đã được thiết lập. Các kiểu gen khác nhau là các dạng tương đối ổn định của virus, là kết quả của những thay đổi ngẫu nhiên được chọn lọc qua nhiều năm dưới những áp lực quần thể. Nói cách khác, khái niệm kiểu gen được áp dụng với các dạng có khả năng tái bản thành các bản sao mang trình tự hệ gen đạt được sự ổn định sau một thời gian dài [28]. Trong khi đó, các đột biến phát sinh ở từng cá thể dưới áp lực miễn dịch gây ra bởi điều kiện tự nhiên hoặc do các can thiệp y học. Chúng bao gồm các đột biến giúp virus thoát khỏi globulin miễn nhiễm HBIG (Hepatitis B immune globulin), tác dụng của vaccin, các loại thuốc kháng virus. Ở các bệnh nhân cấy ghép gan, quá trình điều trị lâu dài với hàm lượng HBIG cao trong hoàn cảnh nồng độ virus thấp và số lượng tế bào gan dễ tổn thương lớn là môi 15 trường nuôi dưỡng lý tưởng cho các đôt biến HBV xảy ra. Đối với các bệnh nhân HBV mạn tính, các đột biến xảy ra tự nhiên có thể được chọn lọc bởi đáp ứng miễn dịch của cơ thể người bệnh [29]. 1.4.5. Mối liên quan giữa nhiễm HBV với UTG 1.4.5.1. Vai trò của các protein HBV trong sinh bệnh học ung thư gan HBV có thể mã hoá cho các protein có vai trò quan trọng trong sự hình thành ung thư gan. Ví dụ như HBX là một gene không cấu trúc của HBV được nghiên cứu rất nhiều. Gene này có vai trò điều biến phiên mã đa chức năng cũng như kiểm soát đáp ứng với các áp lực gây tổn thương gene, thoái giáng protein, chết có chương trình và nhiều các con đường tín hiệu khác nhau. Mặc dù cơ chế đặc hiệu của nó vẫn chưa rõ nhưng HBX đóng một vai trò rất quan trọng trong việc hình thành các khối ung thư gan ác tính đã được chứng minh trong các nghiên cứu chuyển gene trên chuột [13]. Ngoài ra HBx protein đã được chứng minh là có khả năng gắn kết với protein ức chế khối u là P53 và ức chế chức năng của protein này [12]. 1.4.5.2. Kiểu gene HBV trong sinh bệnh học ung thư gan Các yếu tố thuộc về virut khác như kiểu gene HBV đã được chứng minh là có liên quan đến sinh bệnh học ung thư gan. Cho đến hiện nay 10 kiểu gene của HBV được xác định dựa trên sự khác biệt trên trình tự của bộ gene HBV, được ký hiệu từ A đến J [29]. Người ta thấy rằng, trên bệnh nhân mang kiểu gene C tỷ lệ dương tính của HBeAg cũng như mức độ nhân lên của HBV cũng cao hơn là ở nhóm mang kiểu gene B. Thời gian chuyển đảo huyết thanh ở nhóm có kiểu gene C lâu hơn so với kiểu gene B, tỷ lệ đột biến điểm tại vùng tiền nhân (Pre-Core) ở nhóm có kiểu gene C cũng cao hơn là nhóm có kiểu gene B. Những đột biến 16 này thường thấy ở nhóm bệnh nặng như xơ gan và ung thư gan hơn là ở nhóm bệnh nhân viêm gan cấp và viêm gan mạn tính. Trong khi đó những bệnh nhân trẻ dưới 50 tuổi mang kiểu gene B thường tiến triến thành ung thư gan nhanh hơn là kiểu gene C ở cùng độ tuổi [30]. Một nghiên cứu khác gần đây trên 375 bệnh nhân được thu thập tại một số bệnh viện khu vực Hà Nội chúng tôi thấy kiểu gene C đã được tìm thấy nhiều ở nhóm ung thư hơn là ở nhóm không ung thư [31]. 1.4.5.3. Hiện tượng tái tổ hợp kiểu gene và đồng/bội nhiễm hơn một kiểu gene trong bệnh do nhiễm HBV Nhờ có những kỹ thuật phân tích trình tự gene người ta đã phát hiện ra rằng HBV không phải chỉ có những kiểu gene đơn thuần như trên đã mô tả mà còn có sự tái tổ hợp kiểu gene (recombination), hay là sự pha trộn hơn một kiểu gene. Những nghiên cứu trước đây cho thấy rằng có sự tái tổ hợp giữa kiểu gene B và C; A và C là khá phổ biến. Người ta cho rằng vùng lõi (core) của kiểu gene C có vai trò rất quan trọng trong việc hình thành kiểu gene hỗn hợp này. Trong những nghiên cứu gần đây người ta và chúng tôi đã thấy rằng tỷ lệ đồng/bội nhiễm hơn một kiểu gene là không hiếm, từ 18,9%, đến 33,7% và 60% [31]. Thêm vào đó người ta thấy đồng/bội nhiễm kiểu gene cũng gặp ít hơn ở nhóm bệnh nhân bị viêm gan B cấp, mạn và người mang HBV không triệu chứng so với nhóm bệnh nhân bị xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan liên quan nhiễm HBV. 1.4.5.4. Vai trò của đột biến gene HBV và nồng độ HBV DNA trong ung thư gan Trong quá trình phát triển và nhân lên tự nhiên của virút có thể xuất hiện đột biến trên geneome của chúng. Người ta thấy rằng, đột biến trên 17 genome của HBV, đặc biệt là trên gene HBx, Pre-S sẽ làm tăng nguy cơ phát sinh ung thư tế bào gan nguyên phát. Một nghiên cứu trên 160 bệnh nhân nhiễm HBV tại Nhật Bản cho thấy có 23% bệnh nhân có đột biến tại vùng Pre-S. Trong đó đột biến mất đoạn tại vùng Pre-S trên bệnh nhân xơ gan và ung thư gan là 54% so với nhóm viêm gan mạn tính và người mang virut chỉ có 31% [32]. Từ trước tới nay người ta vẫn cho rằng nhiễm HBV mạn tính không triệu chứng là thể bệnh nhẹ, không có nguy cơ tiến triển nặng thành ung thư và xơ gan. Vì thế nên trước đây người ta đã dùng từ người lành mang trùng để chỉ những đối tượng này. Tuy nhiên, gần đây người ta lại thấy rằng mặc dù không có tổn thương gan, enzyme AST và ALT bình thường, nhưng trên những bệnh nhân này vẫn có tỷ lệ tiến triển thành ung thư gan là từ 15% đến 30% sau 13 năm theo dõi nếu như HBV DNA>105 copies/ml [33]. 1.4.5.5. Tương tác giữa bộ gene HBV với gene người Ngày càng có nhiều công trình nghiên cứu chứng minh sự tương tác qua lại giữa gene HBV với gene người dẫn đến biến đổi các dòng tín hiệu nội, ngoại bào. Đó là những dòng tín hiệu rất quan trọng liên quan đến sự hình thành ung thư [34], [18]. Trong số những gene người có biểu hiện rõ nhất là gene P53 và gene mã hoá thụ cảm thể cho androgene. Đối với gene ức chế khối u người ta đã thấy HBX của HBV có một đoạn tương đồng với gene P53. Khi HBX cài cắm vào bộ gene người thì sẽ gắn kết và làm bất hoạt gene P53. Dẫn đến làm thay đổi chết có chương trình của tế bào hoặc khối u không bị ức chế [35]. Ung thư gan do nhiễm HBV thường gặp trên các bệnh nhân nam hơn là bệnh nhân nữ. Bệnh nhân nam thường có nồng độ HBV DNA tăng cao hơn bệnh nhân nữ, mà HBV DNA là một yếu tố nguy cơ phát triển UTG. Nguyên nhân nào dẫn đến tình trạng đó đã được các nghiên cứu gần đây chứng minh. 18 Trên môi trường nuuôi cấy người ta chuyển gene HBV và gene mã hóa thụ cảm thể androgene vào trong tế bào gan HepG2 để đánh giá ảnh hưởng của dòng tín hiệu androgene lên quá trình sao dịch mã của HBV. Kết quả cho thấy thụ cảm thể androgene có thể làm tăng quá sinh sao mã thành HBV RNA sau khi hoạt hóa thụ thể này. Người ta cũng đã xác định được vùng tăng cường I (enhancer I) của HBV là nơi chịu trách nhiệm trong đáp ứng với sự hoạt hóa của thụ cảm thể androgene. Bằng công nghệ ngưng kết miễn dịch sợi nhiễm sắc và phương pháp liên kết trong ống nghiệm người ta đã chứng minh thụ cảm thể androgene đã liên kết trực tiếp với vùng tăng cường I theo cơ chế phụ thuộc chất gắn (ligand-dependent). Qua đó người ta đã xác định được 2 cấu trúc cơ bản trong khu vực vùng tăng cường này chịu trách nhiệm đáp ứng với thụ thể androgene. Khi gây đột biến khu vực này thì sẽ gây mất ảnh hưởng của thụ thể androgene. Những kết quả đó đã chứng minh dòng tín hiệu qua androgene có thể làm tăng mức độ sao mã của HBV thông qua sự gắn trực tiếp lên các vị trí đáp ứng androgene với vùng tăng cường I của HBV. Kết quả này có thể giải thích nguyên nhân làm cho nồng độ HBV DNA tăng cao hơn trên bệnh nhân nam và qua đó làm tăng nguy cơ của UTG [36]. Như vậy, ung thư gan là một trong những ung thư phổ biến nhất trên thế giới. Bên cạnh những yếu tố nguy cơ liên quan đến ung thư gan như xơ gan, nhiễm độc thì nhiễm HBV là một nguyên nhân quan trọng hàng đầu. Qua nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng ngày nay người ta đã chứng minh rất rõ vai trò của HBV trong bệnh sinh ung thư gan. 1.5. Các phương pháp chẩn đoán ung thư gan hiện nay Các phương pháp chẩn đoán UTG hiện nay gồm khám xét lâm sàng, các xét nghiệm máu phát hiện dấu ấn ung thư AFP, siêu âm, X quang, nội soi, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner), cộng hưởng từ (Magnetic Resonany 19