Tài liệu Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------ Nguyễn Đình Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƢỢU VANG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------------ Nguyễn Đình Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN MALOLACTIC VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT RƢỢU VANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Trƣơng Hƣơng Lan GS.TS. Phạm Văn Ty Hà Nội – 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá triǹ h thực tập tốt nghiệp và hoàn thành luận văn , tôi đã nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân. Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trương Hương Lan Chủ nhiệm bộ môn thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm, người đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cặn kẽ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Phạm Văn Ty - Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thầy đã hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể cán bộ, nhân viên trong Phòng Thực phẩm và dinh dưỡng - Viện Công nghiệp thực phẩm đã quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Tôi cũng xin cảm ơn chân thành tới các thầy giáo, cô giáo, trong Khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những người thân đã ở bên tôi, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2014 Học viên Nguyễn Đình Dũng MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................3 1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang .......................................................................3 1.1.1 Vài nét về rượu vang ...................................................................................3 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang ..................................................................4 1.2 Vi khuẩn lactic .................................................................................................7 1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang .............10 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni .......................................................................11 1.3 Quá trình lên men malolactic .......................................................................12 1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic ..............................................12 1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic .................................................14 1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất lượng rượu vang ................................................................................................15 1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic ......................18 1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic ............................................................18 1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic ...............19 1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong sản xuất vang .....................................................................................................20 1.5 Các phƣơng pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao chất lƣợng rƣợu vang ..........................................................................................21 CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............25 2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất .......................................................25 2.1.1 Nguyên liệu ...............................................................................................25 2.1.2 Vi sinh vật ................................................................................................25 2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật ...............................................................25 2.1.4 Hóa chất ...................................................................................................26 2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị ......................................................................26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................26 2.2.1 Phương pháp công nghệ ...........................................................................26 2.2.2 Phương pháp vi sinh vật ...........................................................................27 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa ..................................................................28 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................31 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang 31 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận ......................31 3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập ........33 3.1.3 Xác định khả năng chịu SO2 của 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được36 3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng NT12 trên môi trƣờng rƣợu vang non ...............................................................37 3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic 42 3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu quá trình lên men malolactic O.oeni NT12..........................................................................................................44 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên men malolactic. ..................................................................................................44 3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic ......................47 3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang .49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................56 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân tích rượu vang đỏ trước và sau lên men malolactic .........................15 Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được ................31 Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập được ........34 Bảng 3.3 Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập được .........35 Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic và axít lactic trước và sau lên men Malolactic trên môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lượng K2S2O5. bổ sung etanol tới nồng độ 14%v/v ........................................................................................37 Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non ......................................38 Bảng 3.6 Hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non ......................................39 Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic .......................................................................................................40 Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic ..................................................................................................................41 Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 02 chủng .....43 Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi lên men rượu ....................................45 Bảng 3.11 Hàm lượng axít malic (g/l) được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian ...............................................................46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic trong quá trình lên men malolactic ..................................................................48 Bảng 3.13 Thành phần của rượu vang sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic .......49 Bảng 3.14 Thời gian lên men và hàm lượng axít malic, axít lactic sau quá trình lên men malolactic ở các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau .........................51 Bảng 3.15 Rượu etanol được tạo thành và hàm lượng đường sót sau quá trình lên men malolactic ..........................................................................................................52 Bảng 3.16 Sự tạo thành 1 số chất bay hơi được tạo thành sau quá trình lên men malolactic ..................................................................................................................53 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình dạng chuỗi của chủng O.oeni. ...........................................................10 Hình 1.2. Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình ...............13 Hình 1.3. Cơ chế của quá trình lên men malolactic ................................................133 Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic ..........................17 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho .27 Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non ............................38 Hình 3.2. So sánh hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non ............................39 Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic ........................................................................................41 Hình 3.4 So sánh hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn malolactic ...................................................................................................42 Hình 3.5 So sánh hàm lượng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 2 chủng................................................................................................................43 Hình 3.6 Hàm lượng axít malic được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian. .......................................................................46 Hình 3.7 So sánh sự tạo thành rượu etanol sau quá trình lên men malolactic ..........52 Hình 3.8 So sánh sự tạo thành 1 số chất bay hơi sau quá trình lên men malolactic .53 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AG Acid Grape - Nước nho axít CoA Coenzyme A CFU Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc HDL High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao LAB Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic MRS De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS NAD+ Nicotinamit Adenin Dinucleotide NADH Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen EO Chế phẩm Essential oenos OD Optical density - Mật độ quang MLF Melolactic fermentaeion - Lên men malolactic MỞ ĐẦU Rượu vang là đồ uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men dịch quả nói chung mà phổ biến nhất là từ quả nho. Do nho là loại quả có thành phần hoá học thích hợp cho nấm men phát triển và có hương thơm đáp ứng được những yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất lượng cao. Trải qua lịch sử hình thành và phát triển lâu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v là đồ uống có lợi cho sức khỏe của con người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa chuộng ở khắp nơi trên thế giới. Từ nhiều năm nay, rượu vang nho đã trở thành thức uống phổ biến ở nước ta. Thị trường rượu vang trong nước rất phát triển, tuy nhiên vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu cả về chất và lượng. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã tăng khoảng 25%/ năm. Trong đó, Ninh Thuận được biết đến là vùng trồng nho chính có sản lượng lớn nhất cả nước, hiện trồng chủ yếu là giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi hơn là để lên men rượu vì cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn. Do vậy, chất lượng rượu vang Việt Nam hiện nay chưa thật cao khi so sánh với rượu vang nhập khẩu do hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị lắng cặn…Với tiềm năng về thị trường lớn như ở nước ta, việc cải tiến công nghệ để sản xuất rượu vang nho là vấn đề đang rất được quan tâm. Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho đi sâu làm rõ các cơ chế như: sự chuyển hóa các thành phần trong nho thành các chất thơm trong rượu vang, tác động của điều kiện môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn malolactic trong quá trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu vang là quá trình lên men thực hiện chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn lactic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị làm rượu. Nấm men sử dụng hệ enzym của mình để chuyển hóa glucoza và một số đường khác thành rượu và các sản phẩm phụ khác (rượu bậc cao, este, các axít hữu cơ...), trong khi đó vi khuẩn lactic chuyển hóa axít malic thành axít lactic và CO2 bằng quá trình lên men malolactic. Lên men malolactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số loại vang 1 trắng, đây là một quá trình không thể thiếu trong việc làm biến đổi các thành phần hóa học, mang lại cho rượu vang những hương vị đặc trưng. Với điều kiện, công nghệ sản xuất rượu vang của Việt Nam hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa quá trình lên men malolactic là rất cần thiết. Điều này đã giúp các nhà sản xuất rượu vang kiểm soát quá trình sản xuất rượu vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra các sản phẩm hỏng hoặc có chất lượng không ổn định, đồng thời làm đa dạng các chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng. Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công nghệ sản xuất rượu vang nho chất lượng cao của Việt Nam giải quyết những vấn đề thực tiễn của ngành sản xuất rượu vang trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”. 2 CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang 1.1.1 Vài nét về rượu vang Rượu vang là thức uống có cồn được sản xuất bằng phương pháp lên men không chưng cất từ dịch nho. Nhờ tác nhân lên men (lên men một giai đoạn) hoặc nhờ nấm men và vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có hương vị đặc trưng, cũng như giá trị dinh dưỡng cao hơn hẳn các loại rượu khác. Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng la tinh là “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”, có nghĩa là cây nho. Trước tiên việc sản xuất rượu vang được tiến hành bằng cách ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên trong các hang đá. Người La Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ thế kỉ II, sau đó là vùng Champagne và Monselle Valley vào khoảng thế kỉ IV. Pháp bắt đầu xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII. Vào năm 1857, lần đầu tiên trong lịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về quá trình lên men, xác định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong quá trình lên men rượu và sự biến đổi hoá sinh trong quá trình lên men của nấm men [8]. Đến nay đã có hàng trăm loại rượu vang khác nhau đáp ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng. Phân loại rượu vang được dựa trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong các loại vang màu thì rượu vang đỏ có giá trị cao nhất. Ngày nay nguyên liệu chế biến rượu vang được mở rộng ra các loại nguyên liệu quả khác nhau, phong phú về màu sắc và chất lượng. Trải qua nhiều thế kỷ, rượu vang đã khẳng định vai trò của nó với sức khỏe con người. Louis Pasteur đã nhiều lần khẳng định: “Rượu vang là loại đồ uống rất vệ sinh và rất có lợi cho sức khoẻ”. Khoa học hiện nay đã phát hiện trong rượu vang đỏ có chứa chất trans-resveratrol là một chất chống oxi hóa, gặp trong vỏ của quả nho đỏ (vỏ mỗi quả chứa khoảng 2µg trans-resveratrol). Các polyphenol trong Chất này có tác dụng trung hòa các tác nhân oxi hóa, chẳng hạn các gốc tự do được tạo thành trong quá trình trao đổi chất bình thường của tế bào. Các gốc tự do này sẽ gây hư hại mô nếu không nhanh chóng được loại bỏ. Chính tác dụng nói trên của 3 trans-resveratrol đã góp phần làm giảm nguy cơ tử vong do bệnh nhồi máu cơ tim ở người [30]. 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12] Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia các kiểu lên men khác nhau. Có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO2. Thực chất đây là quá trình oxi hoá khử có mặt các enzyme của nấm men. Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhiệt [7]. Sự thay đổi nhiệt độ trong quá trình lên men có thể dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt tính của nấm men. Do vậy giữ nhiệt độ ổn định trong quá trình lên men là một yếu tố quan trọng giúp quá trình lên men được hoàn thành. Nấm men nhạy cảm nhất với nhiệt độ trong giai đoạn đầu phát triển và nhân lên và nó trở nên chống chịu tốt hơn trong giai đoạn sau. Do vậy đối với lên men rượu vang thì giai đoạn đầu của quá trình lên men nên duy trì ở nhiệt độ 18-22oC và sau đấy cho phép tăng dần lên [7, 12]. Nhiệt độ lên men ban đầu quá cao có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng ì ở cuối quá trình lên men. Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: - Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối. - Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2. Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài ethanol còn nhiều chất khác như este, rượu bậc cao, các axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel... Tỷ lệ các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều kiện của môi trường lên men. 4 Trong quá trình này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng CO2 dưới tác dụng xúc tác của enzyme do nấm men tạo ra theo con đường Enolpyruvat [7]. Nho đỏ Nghiền/chà tách cuống SO2 Cuống Sulfite hóa Ngâm Tách dịch nho rỉ Tách cặn Nấm men Hiệu chỉnh thành phần dich nho Hoạt hóa nấm men Lên men Vi khuẩn lactic Lên malolactic Cặn Ủ rượu Ổn định rượu Làm trong Rót sản phẩm Rượu Vang 5 Cặn Sơ đồ: 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất rƣợu vang đỏ trên thế giới. Trong quả nho và nhiều loại quả khác, hầu như chỉ có đường khử glucoza, fructoza. Vì vậy nếu sử dụng dịch lên men hoàn toàn từ dịch ép quả thì quá trình lên men rất thuận lợi. Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài etanol, còn có nhiều các hợp chất khác như este, rượu bậc cao, các axít hữu cơ, glyxerol... Este: Các este được cho là có ý nghĩa lớn nhất đối với sự hình thành hương vị rượu vang [40]. Mùi quả đặc trưng của vang chủ yếu nhờ vào một hỗn hợp của hexyl axetat, etyl caprilat. Este có mặt nhiều nhất trong rượu vang là etyl axetat. Nó được hình thành trong quá trình lên men và trong quá trình lưu giữ ở thùng gỗ sồi. Ngưỡng cảm nhận của etyl axetat là 160 mg/l [41]. Trên ngưỡng này, nó ảnh hưởng xấu đến hương vị của rượu nhưng ở nồng độ thấp hơn thì nó lại đóng góp tích cực vào giá trị cảm quan của vang. Rượu bậc cao: Rượu bậc cao được hình thành trong quá trình lên men rượu và đạt tới nồng độ từ 150-550 mg/l [41]. Rượu bậc cao và các este của nó đóng vai trò quan trọng đến việc tạo hương cho rượu. Các rượu bậc cao chủ yếu là các isobutyl và các amyl alcohol. Ở nồng độ thấp hơn 300 mg/l, nó tạo hương rất tốt cho rượu nhưng ở nồng độ cao hơn, hương của nó không chấp nhận được. Các axít hữu cơ: Các axít hữu cơ có tác dụng làm bền và nâng cao giá trị cảm quan của rượu, đặc biệt là rượu vang trắng [31]. Đặc tính bảo quản của nó cũng làm tăng độ bền hóa lý và vi sinh vật của rượu vang. Các axít hữu cơ chủ yếu được hình thành trong quá trình lên men là axít lactic, axít sucxinic, axít axetic, ngoài ra còn có một lượng nhỏ axít butyric, axít formic và propionic,... nhưng nhiều hơn cả là axít lactic và axít axetic. Các axít hữu cơ có tác dụng làm giảm pH môi trường trong quá trình lên men. Chúng ít ảnh hưởng đến thành phần hương của rượu trừ axít axetic tạo ra mùi dấm chua. Không thể sản xuất ra rượu mà không có ít axít axetic nào. Hàm lượng trung bình của nó trong rượu vang bàn là nhỏ hơn 0,4g/l 6 trong khi ngưỡng phát hiện của nó là 3g/l. Nhiệt độ lên men malolactic cao thúc đẩy sự tạo thành axít bay hơi nhiều hơn [27]. Ngoài ra, các thành phần như aldehyt, glyxerol được tạo ra bởi nấm men trong quá trình lên men đều có tác dụng tạo nên hương thơm đặc trưng của rượu vang. Quá trình lên men rượu đã giải phóng 40 kcal năng lượng tự do trên một phân tử đường. Quá trình lên men thường chứa khoảng 180g đường/lít, do đó sự giải phóng nhiệt về lí thuyết sẽ làm cho nhiệt độ lên men tăng từ 20oC lên 45oC [32]. Như vậy, ban đầu là quá trình lên men rượu được nấm men Saccharomyces cerevissiae đảm nhận. Tiếp theo là hoạt động của các vi khuẩn Leuconostoc oenos, Lactobacillus, Pediococcus chuyển hoá đường sót trong rượu vang non và quan trọng hơn cả là quá trình lên men axít malic thành axít 1 actic và axít xitric thành axít axetic, axetoin, diaxetyl, butađiol 2-3, góp phần đáng kể vào sự hình thành hương vị đặc trưng của rượu vang, “Đây chính là quá trình lên men Malolactic”. Trong công nghệ sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi lên men chính, dịch lên men được gọi là “vang non” được tiến hành lắng gặn cặn và được chuyển sang bồn hay nồi lên men tiếp theo [4]. 1.2 Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là một bộ phận của hệ vi sinh vật tự nhiên trên quả nho, trong dịch đường và rượu vang. Vi khuẩn lactic là những tế bào Gram dương, dị dưỡng hoá năng hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính và axít lactic được xem là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất của chúng [4]. Chính pH axít, hàm lượng êtanol và các thành phần khác của rượu vang tạo ra áp lực chọn lọc đối với các vi khuẩn lactic. Chỉ có một số loài rất nhỏ có khả năng tự phát triển trong các loại dịch đường và rượu vang. Các loài thường gặp trong sản xuất rượu vang chủ yếu thuộc các giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus. Sự xuất hiện của các loại vi khuẩn lactic này trên bề mặt quả nho là rất nhỏ, khoảng 100 tế bào/g quả [43]. Mật độ quần thể vi khuẩn lactic phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện khí hậu trong những ngày cuối cùng của quá trình chín, độ chín và trạng thái vệ sinh của quả nho. Các quần thể vi sinh vật có mặt nhiều hơn trên vỏ quả nho chín 7 hoặc có tình trạng vệ sinh kém. Khi quá trình chín của quả nho kết thúc bởi một giai đoạn nóng và ít mưa kéo dài, thì các vi khuẩn lactic sẽ xuất hiện nhiều hơn trên bề mặt quả nho. Tuy nhiên, các loài vi sinh vật ban đầu này xuất hiện rất ít trong rượu vang mà phần lớn là các loại vi khuẩn nhiễm tạp từ các dụng cụ làm rượu trong các giai đoạn khác nhau diễn ra trong quá trình bơm dịch nước nho vào thùng lên men. Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong các loại rượu vang một số vi khuẩn tự nhiên từ quả nho, nhưng chủ yếu vẫn là các vi khuẩn có nguồn gốc từ các thiết bị trong hầm rượu. Tương tự như vậy đối với trường hợp của nấm men. Nấm men tự nhiên trên bề mặt quả tự phát triển sau các thao tác công nghệ khác nhau diễn ra tiếp sau quá trình thu hái và quá trình chuyển bơm dịch nước nho vào thùng lên men, cho tới tận khi dịch đường nước nho được cấy giống. Tuy nhiên, cũng có thể là có sự phát triển của các loại nấm men có nguồn gốc từ các vật liệu tiếp xúc với dịch nước nho. Do vậy, sau giai đoạn thu hoạch nho, các nấm men nhanh chóng phát triển và chiếm lĩnh hầm rượu. Trên thực tế, người ta vẫn chưa làm sáng tỏ được là con đường nào trong hai con đường gieo giống tự nhiên này là có vai trò quan trọng hơn. Trong suốt quá trình sản xuất rượu vang, các vi khuẩn lactic phát triển, không chỉ về số lượng mà còn có cả sự thay đổi của các loài. Vi khuẩn phân lập được trên vỏ quả nho trước khi thu hoạch thuộc chủ yếu là các loài Lactobacillus plantarum, L. hilgardii và L. Casei. Loài Oenococcus oeni trước đây được gọi là Leuconostoc oenos xuất hiện muộn hơn nhưng lại là quan trọng nhất, rất hiếm khi chúng có mặt trên lá nho, quả nho và chỉ có số lượng rất ít. Trong thực tế, loài này rất ít xuất hiện ở giai đoạn đầu của quá trình lên men. Các loại trực khuẩn và cầu khuẩn xuất hiện trên quả nho thường xuyên hơn so với O.oeni. Trong số tất cả các loài này nói trên, loài cuối cùng O.oeni được coi là có khả năng chống chịu cao nhất đối với các điều kiện môi trường bất lợi của rượu vang như pH thấp, hàm lượng cồn và SO2 cao và do vậy chịu trách nhiệm chính cho quá trình lên men malolactic trong đa số các trường hợp[4]. Số lượng tế bào vi khuẩn lactic đạt 103 - 104 tế bào/ml sau quá trình ép nho [43]. Dịch nước nho ngay sau khi được đưa đến thùng lên men có chứa một hệ vi 8 sinh vật rất đa dạng, phần lớn bao gồm các loài Lactobacillus plantamm, L. casei, L. hilgardii, L. brevis, Pediococcus dcimnosLis, p. pentosaceus, Leuconostoc mensenteroides và Oenococcus oeni. Tuy nhiên, trong tình trạng vệ sinh kém hoặc trong các điều kiện vận chuyển hoặc mức độ sạch của các thiết bị trons, hầm rượu không cao, số lượng tế bào vi khuẩn lactic có thể lên tới 106 tế bào/ml. Bên cạnh đó, trong giai đoạn đầu của quá trình lên men rượu, các tế bào nấm men cũng có số lượng tương tự. Điều này rất có thể dẫn đến sự nguy cơ cạnh tranh pháp triển giữa vi khuẩn và nấm men. Hơn nữa pH của dịch nước nho chín kỹ thường rất cao tạo điểu kiện thuận lợi cho các vi khuẩn. Đây là tác nhân quyết định chính tới số lượng của quần thể các vi khuẩn và đối với sự phát triển của chúng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Trong quá trình sản xuất rượu vang, có lên men malolactic, quần thể vi khuẩn tự nhiên pháp triển trải qua rất nhiều pha khác nhau. Trong những ngày đầu tiên của quá trình lên men rượu, các loại vi khuẩn và nấm men tự phát triển. Nhưng các nấm men thích nghi với dịch đường của nho nhiều hơn, tự sinh sản rất nhanh đạt tới các quần thể rất lớn. Lafon- Lafourcade, 1983 đã bắt gặp, sự phát triển của các vi khuẩn lactic đồng thời với sự phát triển của các nấm men trong giai đoạn đầu của quá trình lên men nhưng nó chỉ dừng lại ở giới hạn từ 104 đến 105 tế bào vi khuẩn lactic/mL [43]. Sự phát triển này phụ thuộc vào các điều kiện hoá lý của môi trường và sự phát triển này còn cao hơn khi pH cao và hàm lượng SO2 thấp [29]. Sự phát triển của các vi khuẩn laclic trong giai đoạn đầu của quá trình lên men nrợu mang tính chuyển tiếp. Trong giai đoạn hoạt động mạnh nhất của quá trình lên men rượu và tới tận khi hàm lượng đường đã bị cạn kiệt, số lượng các vi khuẩn giảm xuống nhanh chóng, chỉ còn 102 - 103 tế bào/ml và thậm chí còn thấp hơn do sự cạnh tranh với các loại nấm men và các điều kiện môi trường. Trong quá trình lên men rượu, sự cạnh tranh của nhiều loài vi khuẩn khác nhau diễn ra liên tục và tới cuối quá trình lên men rượu thì chỉ có những loài chịu được với môi trường êtanol tốt hơn tồn tại được, đặc biệt là các vi khuẩn O.oeni [35]. Cuối quá trình lên men rượu, sẽ còn khoảng 102 - 103 tế bào/mL vi khuẩn O.oeni. Chính loài này sẽ tự sinh sản ngay sau đó và tạo ra hệ vi sinh vật chịu trách nhiệm lên men malolactic. 9 Cũng có thể có các đại diện của các loài khác còn sống sót với số lượng rất nhỏ sau quá trình lên men, chúng có thể phát triển nếu như rượu vang không được bảo vệ tốt và đây chính là nguyên nhân làm hỏng rượu vang. Liên quan tới quá trình chuyển hoá axít malic, loài O.oeμni này được khởi động ngay sau khi số lượng quán thể đủ lớn để khởi động (thường là 106 tế bào/mL). Sự phát triển này có thể kéo dài trong nhiều ngày hoặc nhiều tuần tuỳ theo các trường hợp. Lên men malolactic có thể hoàn thành ở cuối pha tĩnh hoặc đầu pha suy vong. Nhưng nếu có các điều kiện là thích hợp, lên men malolactic có thể kết thúc ở cuối pha phát triển. Cuối cùng, khi kết thúc lên men malolactic, cần phải Sulfit hoá rượu vang để loại bỏ hoàn toàn các vi khuẩn còn sống [14]. 1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm các vi sinh vật Gram dương và do vậy được nhuộm mầu bằng phép thử Gram có liên quan tới cấu tạo của thành tế bào. Các vi khuẩn Leuconostoc và Oenococcus (hình 1-2) có dạng hình cầu. Đó là các tế bào nhỏ (kích thước từ 0,5 - 1 μm) tròn hoặc hơi dài tạo ra các cặp hoặc chuỗi. Hình 1.1 Tế bào dạng chuỗi của chủng O.oeni. Tuỳ vào sự đa dạng của các sản phẩm trao đổi chất của các loại đường, các vi khuẩn lactic được phân biệt thành 2 nhóm: - Nhóm sinh axít lactic (> 85%) từ glucoza được gọi là lên men đồng hình như các loài thuộc giống Pediococcus và loài Lactobacillus mali. Các vi khuẩn này phân 10 huỷ glucoza thành pyruvat theo con đường đường phân truyền thống. Pyruvat tiếp theo bị khử thành axít D và/hoặc L - lactic phụ thuộc vào từng loài bởi các enzim lactate dehydrogenaza L và/hoặc D. Quá trình này cho phép ôxy hoá khử các phân tử NADH2+ thu được từ quá trình đường phân thành NAD+. - Nhóm mà bên cạnh axít lactic, còn sản xuất axít axêtic, ethanol và CO2, được gọi là lên men dị hình. Người ta phân biệt: + Các loài dị hình nghiêm ngặt như các loài thuộc giống Leuconostoc và một vài loài thuộc giống Lactobacillus (L. brevis, L. hilgardii...). Chúng không có enzim aldolaza của hai con đường (đường và pentoza -photphat) phân và do vậy không thể lên men các loại đường theo con đường lên men dị hình của các pentoza-photphat. + Các loài lên men dị hình tuỳ tiện như O.oeni, Lactobacillus casei và Lactobacillus plantarum có các enzym của cả hai con đường (đường phân và pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc vào điều kiện môi trường [14]. 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu vang nhưng O. oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất rượu vang. O. oeni có tên gọi trước đây là Leuconostoc oenos, là một loài hiếu khí tùy tiện và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4,8) được bổ sung nước cà chua hoặc nước nho [26]. Ở các vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt trong dịch hèm cũng như trong rượu vang non. Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ các loại đường), nitơ (từ các axit amin tự do hoặc các chuỗi peptit ngắn), các vitamin (axit nicotinic, thiamin và uracil) là toàn bộ nhu cầu cho sự sinh trưởng tối ưu của vi khuẩn này. O.oeni có khả năng chuyển hoá axít L-malic thành axít L-lactic, lên men fructoza, glucoza và trehaloza. Quá trình lên men glucoza tạo ra axít D-lactic, C02, axít axetic và etanol. Một số loài thuỷ phân arginin và một số khác lên men axít xitric khi có mặt các loại đường có thế lên men, nhưng các tính chất này bị mất đi sau một vài lần cấy liên tiếp [46]. Tế bào O. oeni có hình cầu và tồn tại ở dạng chuỗi khi sinh trưởng trên môi 11 trường rắn. Sự sinh trưởng tương đối chậm và có thể mất từ 5-7 ngày để hình thành các khuẩn lạc có thể quan sát được tại nhiệt độ từ 20-30°C. Mặc dù trước đây chúng được xếp vào cùng nhóm với các loài Lenconostoc, nhưng phân tích ADN đã chỉ ra chúng là một nhóm tách biệt hoàn toàn với loài Leuconostoc [46]. O. oeni được coi là ứng viên tốt nhất để tiến hành lên men malolactic nhờ sự thích nghi của chúng với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường, đặc biệt là điều kiện axít và hàm lượng cồn cao trong rượu. Rượu vang cấy các chủng O. oeni đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm soát toàn bộ quá trình lên men malolactic. Ngoài ra, việc lựa chọn một chủng o. oeni có thể cho phép các nhà sản xuất rượu đảm bảo về các tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng. Do vậy, rượu vang tạo ra đặc trưng. Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được lựa chọn, nhưng trong một số trường hợp thỉ một hỗn hợp các chủng có thể được sử dụng để cấy giống. Điều này không chỉ tạo ra các đặc tính được yêu thích hơn của rượu vang, mà còn tạo ra khả năng sống sót cao nhất của vi khuẩn nếu có một thực khuẩn thể trong rượu [26]. 1.3 Quá trình lên men malolactic 1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic Trong lên men rượu vang người ta gọi quá trình phân giải axit malic và xitric dưới tác dụng của enzym malolacticase của O. oeni là quá trình lên men lactic, một quá trình quan trọng bậc nhất trong giai đoạn lên men phụ của rượu vang và sâm panh [3, 42]. Vi khuẩn lactic tự nhiên luôn có mặt trên vỏ quả nho sau khi chín với số lượng từ 103 đến 104 CFU/ml và đi vào vang non theo dịch nước quả. Tuy nhiên, số lượng của chúng lúc này cũng bị giảm đáng kể do bị ức chế và tiêu diệt bởi S02 (khoảng 50 mg/ml) ở giai đoạn sunfit hoá và nồng độ cồn cao (khoảng 14-15° cồn) sinh ra sau quá trình lên men rượu. Do vậy, trong rượu vang non, các loại trực khuẩn và cầu khuẩn lactic bị tiêu diệt gần như hoàn toàn và chỉ còn sót lại số lượng ít ỏi các tế bào vi khuẩn O. oeni từ 102-103 CFU/ml. Tuy nhiêu, đây chính là tác nhân chính của một quá trình quan trọng nhất trong giai đoạn lên men phụ kéo dài đó là quá trình lên men malolactic. 12