Tài liệu Nghiên cứu triển khai sản xuất L-cystin ở quy mô pilot

B ộ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ********************** NGUVỄN THỊ THANH PHÚC NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI SẢN XUẤT L-CYSTIN ở QUY MÔ PILOT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ • • • Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Đại học Dược Hà Nội HÀ N Ộ I-2 0 1 1 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, Trưởng bộ môn Công Nghiệp Dược -Trưòmg Đại Học Dược Hà Nội, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt , dạy dỗ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Đồng thời,tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành TS. Nguyễn Văn Hân, DS. Nguyễn Văn Giang và anh Phan Tiến Thành cùng các thầy cô, anh chị thuộc bộ môn Công nghiệp dược, cũng như các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội này đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình và bạn bè là động lực lớn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cám ơn ! Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Phúc MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KỶ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ Trang ĐẶT VẤN ĐÈ.....................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................2 1.1. Tổng quan về keratin..............................................................................2 1.1.1. Khái niệm keratỉn............................................................................... 2 1.1.2. Cấu trúc của keratin........................................................................... 3 1.2. Tổng quan về L-cystin.............................................................................4 1.2.1. Khái niệm L-cystỉn..............................................................................4 1.2.2. Tỉnh chất vật lỷ................................................................................... 5 1.2.3. Tỉnh chất hóa học............................................................................... 5 1.2.4. Phương pháp điều chế........................................................................7 1.2.5. Các xác định L-cystỉn tạo thành........................................................9 1.2.6. Các phương pháp điều chế từ keratin..............................................12 1.2.7. Tác dụng sinh học và ứng dụng....................................................... 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ....... 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 16 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu....................................................................16 2.1.2. Hóa chất nghiên cứu......................................................................... 16 2.1.3. Thiết bị nghiên cứu........................................................................... 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 17 CHƯƠNG 3. KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u ................................................... 19 3.1. Phân tích và lựa chọn phương pháp.................................................... 19 3.1.1. Giai đoạn thủy phân..........................................................................19 3.1.2. Giai đoạn kết tủ a ...............................................................................20 3.2. Khảo sát các nguồn nguyên liệu keratin........................................... 21 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ giai đoạn kết tủa đến hiệu suất sản phẩm......................................................................................................23 3.4. Điều chế L-cystin ử quy mô pilot........................................................25 3.5. Kết quả phân tích phổ........................................................................... 27 3.5.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại I R ..............................................27 3.5.2. Kết quả phân tích phổ khối MS........................................................ 28 3.5.2. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^H-NMR................29 3.6. Kiểm nghiệm L-cystin thu được theo một số tiêu chuẩn của dược điển A nh-B P 2007..............................................................................30 3.7. BÀN LUẬN.......................................................................................... 30 KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ...................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT BP Dược điển Anh (British Pharmacopoeia) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) IR Phổ hong ngoại (Infrared spectroscopy) KĨPT Khối lượng phân tử MS Phổ khối (Mass spectrometry) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) SKLM Sắc ký lóp mỏng Rf Thời gian lưu DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Kết quả khảo sát hiệu suất tạo L-cystin từ các nguồn keratin........22 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ giai đoạn kết tủa đến hiệu suất điều chế L-cystin.............................................................24 Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ khối của L-cystin điều chế được...............28 Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ ^H-NMR của L-cystin điều chế được....... 30 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1: cấu trúc keratin...................................................................................2 Hình 2: sắc ký đồ của hỗn họp acid am in......................................................11 Hình 3: Biểu đồ kết quả khảo sát hiệu suất L-cystin từ các nguồn keratin.... 23 Hình 4: Biểu đồ kết quả khảo sát ảnh hưỏng của nhiệt độ giai đoạn kết tủa đến hiệu suất điều chế L-cystin.......................................................25 Hình 5: Quy trình điều chế L-cystin ở quy mô pilot......................................26 ĐẶT VẤN ĐÈ L-cystin là một acid amin có trong tự nhiên, thuộc nhóm acid amin có chứa lưu huỳnh [2]. L- cystin chiếm một tỷ lệ lớn trong tóc, móng, sừng [8 ]. Được biết đến như một disulfide amino, L- cystin cấu thành từ hai phân tử L-cystein qua cầu nối disulfide. Tên khoa học là: L(-)-3,3’-Dithiobis(2amino-propanoic acid). L-cystin được dùng rộng rãi để bào chế các thuốc điều trị các bệnh lông, tóc, móng như tóc dễ gẫy, chẻ, rụng tóc, giúp cho sự mọc tóc và giúp tóc tăng trưởng. Ngoài ta, L-cystin còn được dùng để điều trị chứng ngứa và các bệnh lý về da như: sạm da, ban chàm, mề đay, mụn nhọt...[12]. L-cystin là nguyên liệu trung gian để bán tổng hợp nhiều dẫn xuất có ứng dụng trong lâm sàng như: L- cystein, S-carboxyl-methyl-cystein, N-acetyl-L-cystein... L-cystin có thể điều chế theo con đường tổng hợp hóa học hay tổng họfp vi sinh nhưng phương pháp chiết từ dịch thủy phân keratin là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, nguyên liệu dễ kiếm và có khả năng sản xuất ở quy mô công nghiệp cao. Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu điều chế L-cystin từ một số loại keratin như tóc, lông cừu [16,17]... Tại Việt Nam, các nghiên cứu điều chế Lcystin từ keratin đã được tiến hành và khảo sát ở quy mô phòng thí nghiệm [1,6,8,11]. Nhằm đưa việc sản xuất L-cystin ứng dụng vào sản xuất công nghiệp, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu triển khai sản xuất L-cystin ở quy mô pilot” với những mục tiêu sau: 1. Khảo sát một sổ yếu tổ ảnh hưởng đến hiệu suất điều chế L- cystỉn, lựa chọn nguyên liệu, hóa chất và quy trình sản xuất L-cystin ở quy mô pilot. 2. Tiến hành sản xuất L-cystin ở quy mô pilot và kiểm nghiệm sản phâm L-cystỉn thu được. CHƯC«VG 1: TỎNG QUAN ỉ.l. Tổng quan về keratiii 1.1.1. Khái niêm về Keratin Keratin là một protein có cấu trúc dạng sợi, rắn chắc, không tan trong nước, chiếm tỷ lệ cao trong tóc, sừng, móng, lông của hầu hết các động vật [3]. Ngoài vai trò giúp ổn định cấu trúc tế bào, keratin còn có tác dụng bảo vệ chống các tác nhân có hại từ môi trưòng bên ngoài. Keratin có hai dạng cấu trúc là a-keratin và |3-keratin: - a-keratin có trong lông tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng và móng guốc của động vật có vú. - P-keratin được tìm thấy ở móng vuốt vủa các loài bò sát, trong mai của các loài baba, rùa., và trong lông vũ, mỏ, móng vuốt của chim, gai của nhím [23'. Cấu trúc của p-keratin cứng hơn so với a-keratin. 1.1.2. Cẩu trúc của keratin H yd rogen b on d H yd ro gen bond — Hình 1: cấu trúc keratin A: cấu dạng xoắn a, B: cấu dạng xoắn p 1.1.2.1. Cấu dạng xoắn a ( hĩnh A) Là cấu dạng điển hình cho cấu trúc của a-keratin. Khoảng cách một chu kỳ xoắn là 0,54nm (gồm 3,5 gốc acid amin). Các nhóm R của nguyên tử cacbon a đều chĩa ra ngoài trung tâm xoắn. Cấu dạng xoắn a có những đặc điểm quan trọng sau đây: ^ Cấu trúc bền vững nhờ có các liên kết hydro tạo ra giữa H (thuộc nhóm -NH của mỗi liên kết peptid) với o (của nhóm -CO thuộc gốc acid amin thứ 4 trong chuỗi). Như vậy, mỗi liên kết peptid đều góp phần tạo ra sự bền vững tối đa cho phân tử keratin. Liên kết hydro nói trên làm giảm tính chất ưa nước của vùng xoắn a. ^ Là cấu dạng bền vững nhất của chuỗi polypeptide do có thể tạo xoắn a mà không cần nhiều năng lượng. 1.1.2.2. Cấu dạng gấp nếp p (hình B) Là điển hình cho cấu trúc của |3- keratin. Nó không bị cuộn lại như cấu dạng xoắn a mà gấp nếp và hầu như hoàn toàn duỗi thẳng hình ziczac. Các đặc điểm của cấu dạng gấp nếp P: Các chuỗi polypeptid cạnh nhau có thể song song (có cùng hướng từ Nđến C- tận) hay đối song (hướng ngược nhau). Hai cấu trúc này giống nhau mặc dù độ dài lặp lại của cấu trúc song song là 0,65nm ngắn hơn so với 0,70 nm của cấu trúc đối song. v' (xa ^ Khoảng cách giữa các acid amin cạnh nhau theo đường trục là 0,3 5nm hơn so với cấu trúc dạng xoắn a là 0,15nm). Các liên kết hydro tạo bởi -N H và -CO có thể nằm cùng chuỗi hay giữa các chuỗi polypeptid khác nhau. ^ Các gốc R của acid amin cạnh nhau nằm ở những vị trí gấp khúc ziczac. 1.2. Tổng quan về L- cystin. 1,2,1. Khái niệm L-cystìn L-cystin được Wollaston phát hiện vào năm 1810 [17]. Đen năm 1899, L- cystin được chiết ra từ dịch thủy phân sừng bởi K.A.H.Momer [20]. Các nghiên cứu về Hóa học và Sinh học được D.M Greenberg thực hiện vào năm 1951 [15]. Công thức cấu tạo [22]: \ OH NH, Tên khoa học: L(-)-3,3’-Dithiobis(2-amino-propanoic acid) Công thức phân tử: C6H 12O4N 2S2 Phân tử lượng: 240,30 Thành phần: c 29,99%; H 5,03%; N 11,66%; o 26,63%; s 26,69%. L- cystin có cấu trúc ổn định, là sản phẩm oxy hóa của L-cystein. Lcystin được cấu thành từ hai phân tử L-cystein nối với nhau bằng cầu nối disulfid. L-cystin có thể tạo thành L- cystein nhờ sự khử hóa. coo- coo- -H3N" H----c----HsN^ H2C----- SH H2C----SH Cystein Cystein C00- C 00 NH, -H H,c -H,N* H- -s- -s- ■CH, Cystin 1.3.2. Tính chất vật lỷ [23]: - L- cystin là dạng bột kết tinh màu trắng, - Thực tế không tan trong nước và alcol. Có thể hòa tan được trong dung dịch kiềm loãng, khả năng tan trong nước (g/1) ở nhiệt độ rO 50°c là 0,239; ở is'^c 25®c là 0,112; ở là 0,523; ở loo^'c là 1,142. - L-cystin có góc quay cực từ -215° đến -225® (dung dịch 5% trong dung dịchHCl IM) - Nhiệt độ nóng chảy khoảng 260-261 °c . 1.3.3. Tính chất hóa học: [4] Với cấu trúc có chứa cả hai nhóm -COOH và nhóm -NH2 nên L-cystin có những tính chất hóa học cơ bản của một acid amin, đồng thời L- cystin là acid amin có chứa lưu huỳnh nên dương tính với phản ứng Folh. • Phản ứng Ninhydrin Nguyên tẳc: Ninhydrin là chất oxy hóa mạnh, khi đun nóng có khả năng khử nhóm amin và nhóm carboxyl của a-amino acid tạo Ninhydrin khử, CO2, NH 3 và aldehyd. + H L R — ọ—coon- V + NH2 + CO2 Ninhydrin Ninhydrin khử Ninhydrin khử tác dụng với ninhydrin và NH 3 tạo ra sản phẩm có khả năng hỗ biến tạo hệ thống các nối đôi liên họp có màu tím có độ hấp thụ cực đại ở x = 570nm. Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin. 0 -N H 4 o o Màu xanh tím • Phản ứng với Pluorescamin Nguyên tắc: Tạo sản phẩm huỳnh quang với a- amin của acid amin, đây là phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng nghìn nano gram. rchO RCHCOOH L NH2 A c id am in • DBi XUÔ huúnh quang Phản ứng Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh Nguyên tắc\ L- cystin đun nóng trong môi trường kiềm sẽ phản ứng với muối chì tạo sulfiir chì PbS màu đen xám. Cơ chế phản ứng như sau: CH2— OH CH2— SH ■ + CH— NH2 LCO O H 4NaOH + H2O COOH J ^ Pb(CH 3COO)2 + Pb(0 H )2 + 2N32S CH — NH2 + 2 NaOH Pb(0 H )2 2NaOH + 2 CH 3COONa Pb(ONa)2 + 2 H2O Ne2S +Pb(ONa )2 + H 2O PbS H-4NaOH I.J.4. Các phương pháp điều chế L-cystin 1.3.4.1.Phương pháp tổng hợp hóa học Người ta có thể tổng hợp L- cystin từ serin hay từ acid arcrylic. Sau đây là một ví dụ cho việc sử dụng nguyên liệu ban đầu là dẫn xuất ester của serin [19]: I.PCI5 CH2CHCOOCH3 CH2CHCOOH 2. HCl OH NH2.HCI Cl NH2.HCI 8 CeHsCHzMgCI CgHsCHzSMgCI CH2CHCH2COOH C6H5SCH2CHCOOH + CgHsCHaSMgCI Cl NH2.HCI NH2 C6H5SCH2CHCOOH 1. Na trong NH^ 2. không khí L- cystin NH, iNn2 1.3.4.2. Phương pháp tổng hợp từ vỉ sinh vật K. Sano và các cộng sự người Nhật bản thực hiện điều chế L-cystein và L-cystin bằng con đường sinh tổng họrp. Bằng các chủng vi sinh vật khác nhau như Pseudomonas thiazolỉnophỉlum AJ 3854, Pseudomonas ovalỉs AJ 3865, Pseudomonas desmoỉytica AJ 3891, với các môi trường dinh dưỡng khác nhau và sử dụng tiền chất là acid 2-amino-thiazolin-4-carboxylic [24]. 1.3.4.3. Phương pháp thủy phân keratỉn Các phương pháp trên nói chung phải qua nhiều giai đoạn khá phức tạp và hiệu suất không cao. Vì thế người ta hướng tới một phương pháp đon giản hon nhiều là thủy phân keratin để thu lấy L- cystin [18]. Phương pháp này thực sự có ý nghĩa trong thời gian gần đây, khi nhu cầu về nguồn L- cystin ngày càng lớn và tính hiệu quả của quá trình thủy phân ngày càng nâng cao. keratin thuy phân pH - 5 ------------ ► acid am in---------- L-cystin Qua khảo sát, L- cystin có tỷ lệ cao trong keratin của lông, tóc, sừng, móng. Hàm lượng L- cystin trong một số nguyên liệu như sau [21]; Tóc 14,0% Lông lợn: 14,4% Sừng; 12,1% Len: 10,3 Do đó, các nguồn nguyên liệu keratin khác nhau chính là nguyên liệu để tách chiết L-cystin. vấn đề cần nghiên cứu trong quá trình thủy phân là các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất L-cystin như: nồng độ acid, lưọng acid sử dụng, thời gian thủy phân, nhiệt độ thủy phân... 1.3.5. Cách xác định L-cystin tạo thành [7]: Sau khi thủy phân hoàn toàn keratin thu được L- cystin, người ta có thể dùng các phương pháp phân tích khác nhau để xác định L- cystin có trong dịch thủy phân: phương pháp Kendan, phương pháp Serensen, phương pháp sắc ký giấy, phương pháp sắc ký trao đổi ion... > Phưong pháp Kendan: Phương pháp Kendan dựa trên cơ sở dùng acid sulfuric đậm đặc để vô cơ hóa nguyên liệu, các chất hữu cơ bị đốt cháy thành CO2 và H 2O còn Nitơ được chuyển thành (NH 4)2S0 4 . Khi cho dung dịch NaOH tác dụng với (Nĩỉ 4)2S04 thì NH 3 sẽ giải phóng ra, cất kéo NH 3 theo hơi nước và chuyển tới bình đựng dung dịch H2SO4 N/50 chuẩn độ. Chuẩn độ H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH N/50, từ đó tính ra hàm lượng Nitơ toàn phần. Phương pháp này đánh giá được hàm lượng Nitơ toàn phần trong chế phẩm. Tuy nhiên, phưong pháp này khó phân biệt được lượng Nitơ trong Lcystin với lượng Nitơ nguồn gốc khác. > Phưong pháp Nitơ formón (phương pháp Serensen) Serensen đã dựa vào tính chất hóa học của các acid amiĩi để định lượng Nitơ của acid amin. Các acid amin đều có nhóm -COOH và -N H 2, cả 2 nhóm này đều yếu, quá trình điện ly kém, khi gặp dung dịch formón thì nhóm -NH2 chuyển thành nhóm metylenic -N=CH 2, làm mất tính kiềm của các acid amin, do vậy mà tính acid của nhóm -COOH mạnh hơn và có thể định lượng được bằng một chất kiềm mạnh với chỉ thị màu là phenolphtalein. Phương trình phản ứng: 10 O H -COOH + H R ----- c ----- COOH H ÑH2 R- H Hc; -COOH HoO N^^^CH2 H NaOH R ----- c ----- CO O Na N=CH 2 + HoO N----- CH2 Phương pháp này chọn lọc Nitơ amin nhưng có thể gây sai số do phát hiện điểm tương đương khó, mặt khác nếu không đủ formón để khóa nhóm NH 2 sẽ gây sai số thiếu. > Phương pháp Pepe -Steven Pepe-steven đã dựa vào khả năng tạo phức của acid amin với đồng bền vững trong môi trường kiềm có dung dịch đệm photphat. Hai tác giả đã đề nghị xác định hàm lượng Nitơ amin theo phuofng pháp định lượng ion gián tiếp (phương pháp thừa trừ) theo phưong trình phản ứng: H H O: 'Q 0 , R- -C- -COOH + + H2N- NH, + KI Na2S203 R N H2 Cul + I2 Na2S4Ơ6 + Nal HoN' Như vậy việc xác định hàm lượng Ni tơ amin được chuyển sang xác định hàm lượng I2, từ đó để tính ra hàm lượng suy ra hàm lượng acid amin trong sản phẩm. > Phương pháp sắc ký ;0 /pú.N -CCOOH + ' liên kết trong phức chất và 'R 11 So sánh Rf của mẫu thử với Rf của mẫu chuẩn trong cùng một điều kiện, từ đó suy ra acid amin có trong mẫu thử. Hệ dung môi sử dụng là nbutanohacid acetic:nước = 4:1:5. Hiện mầu bằng thuốc thử Ninhydrin. > Phương pháp tách các acid amin bằng sắc ký trao đổi ion: Dùng nhựa trao đổi ion để tách riêng các acid amin. Các nhựa thường được sử dụng trong sắc ký tách acid amin là: Dowex 2x8, Amberlite IRC120, Amberlite IRC-50, Wofatit Kps-200... Các acid amin thường được tách riêng biệt nhờ cột chứa cationit gắn Na"^, và anionit gắn OH'. ở môi trường pH khác nhau, các acid amin tách ra và hoà tan vào dung dịch rồi dịch chuyển theo dung dịch với tốc độ dịch chuyển khác nhau. Người ta hứng dung dịch này theo từng phần nhỏ, mỗi loại acid amin được phân bố theo những phần nhất định. Kỹ thuật sắc ký trao đổi ion có ý nghĩa rất lớn trong việc định tính, định lượng và tách từng acid amin riêng biệt ra khỏi hỗn hợp. Ngày nay, một trong những kỹ thuật sắc ký hiện đại là “Sắc ký lỏng hiệu năng cao” (HPLC) cho phép tách tốt hofn và tiết kiệm được nhiều thời gian hơn. Toàn bộ quy trình phân tích có thể tự động hóa trên máy phân tích. Diện tích dưới píc tương ứng với nồng độ của acid amin trong hỗn hợp. Ncrm. Prỉmesep 100 250 X 4.6 mm MoblỊe phase: Mecrsl/H2030/70. TFA gradient 0.,0Õ to 0 3% ỉn 25 rĩTin Flow rate; 1.0 mỉ/min Detector: ELSD GLU 24.0 v:al ASP CYSPH F &RG 210■10 Hình 2: 15 sắc ký đồ của hỗn hợp acid amin 12 1.3.6. Phương pháp điều chế L-cystin từ keratin 1.3.6.1. Phương pháp điều chế theo Vogel [16]: Nội dung phương pháp: Cân 500g tóc cho vào bình cầu ba cổ, thêm vào lOOOml hỗn họp acid clorhydric đặc và acid formic theo tỷ lệ 1:1. Đun cách dầu hồi lưu ở nhiệt độ 120°c cho đến khi phản ứng Biuret âm tính (khoảng 20 giờ). Tẩy màu bằng khoảng 12g than hoạt, lọc nóng và cô đặc dịch lọc, đến khi tạo thành sirô có khối lượng không đổi. Hòa tan phần sirô trong 250ml nước cất, thêm từ từ dung dịch natri acetat 50% cho đến khi dung dịch có pH khoảng từ 4-5. Để yên hỗn họp ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa tủa nhiều lần bằng 50ml nước cất ở khoảng 60°c. Tinh chế sản phẩm bằng cách hòa tan trong 750ml acid clorhydric IM và tẩy màu bằng 5g than hoạt. Nếu dịch lọc vẫn có màu vàng nhạt, tiếp tục tẩy màu bằng 5g than hoạt. Điều chỉnh dịch lọc đến pH=4-5 bằng natri acetat 50%. Đe yên hỗn hợp ở nhiệt độ phòng khoảng 5-6 giờ. Tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng 50ml nước cất 60°C.Khối lượng L-cystin thu được: 25g. Hiệu suất: 5%. Chú ý: Sản phẩm thô có thể chứa tyrosin. Một phần của nó được loại bằng than hoạt và rửa bằng nước nóng. Nhưng khi kết tinh lại có thể sản phẩm vẫn chứa tyrosin nếu thời gian kết tinh để quá 5-6 giờ. 1.3.6.2. Phương pháp điều chế theo Gortner và Hoffman [17]: Nội dung phương pháp: Gortner và Hoffman tiến hành thí nghiệm bằng dung dịch acid HCl 20% lượng acid sử dụng gấp 2-4 lần khối lưọng tóc. Sau khi thủy phân được hỗn hợp các acid amin, tiến hành kết tinh L-cystin bằng cách đưa về điểm đẳng điện ở pH=5. Để trong 3 ngày, tủa xuất hiện. Lọc lấy tủa, tiến hành tinh chế bằng dung dịch HCl IM và chất hấp phụ bề mặt. Kết quả thu được sản phẩm 13 thô. ở đây, hai tác giả không sử dụng acid HCl đặc vì theo các ông, dung dịch acid 20 % tương đối ổn định và ít gây nguy hiểm hơn so với acid đặc. Hiệu suất L-cystin thu được từ 4-5%. 1.3.6.3. Các phương pháp điều chế khác: Các tác giả này đã khảo sát phản ứng thuỷ phân tóc bằng acid HCl đặc theo những cách khác nhau, cụ thể như sau: > Theo tác giả Lê Thị Vinh [6 ]: Nội dung phương pháp : Trong bình cầu dung tích 1 lít cho 200g tóc khô sạch và một thể tích acid HCl 30% hoặc HCl 37% theo tỷ lệ acid/tóc bằng 2:1. Hỗn họp đun sôi với sinh hàn hồi lưu trực tiếp trên bếp điện trong thời gian 10 giờ. Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, dung dịch thuỷ phân được trung hoà từ từ với dung dịch NaOH 30% đến pH=5, thử phản ứng Biuret để xác định mức độ thuỷ phân. Tủa đen xuất hiện, để qua đêm, lọc và hoà tan trở lại trong acid HCl 5%. Lọc để loại họp chất chất không tan, rửa tủa bằng 50ml HCl 5% (chia 3 lần). Khử màu toàn bộ dung dịch lọc bằng cách đun sôi nóng với 20g than hoạt và lắc trong Igiờ. Lọc và rửa than bằng một ít HCl 5%. Trung hoà dịch lọc màu vàng nhạt bằng dung dịch NaOH 30% đến pH=5. Đe kết tủa trong 34 giờ, lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước nóng để loại tyrosin. Sản phẩm thu được là L-cystin, có thể tinh chế bằng một lần hòa tan và kết tủa nữa. Tủa được thử phản ứng Millón để xác định tạp chất tyrosin. Hiệu suất là: 5%. > Theo tác giả Bành Đức Lâm [ 1]: Nội dung phương pháp: Cho Ikg tóc vào bình thuỷ phân 4 lít (có thể chia vào 5 bình nhỏ 1 lít). Thêm 2 lít HCl 37%. Đậy kín. Ngâm trong thời gian 1 tuần. Tóc bị tan một phần tạo thành dịch huyền phù. Tiến hành thuỷ phân cách thuỷ dưới sinh hàn