Tài liệu Nghiên cứu trích ly lipase từ nội tạng cá lóc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG DƯƠNG Ý THƠ NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần Thơ, 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG CÁ LÓC Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Ts. Trần Thanh Trúc Dương Ý Thơ MSSV: 2101960 Lớp Công nghệ thực phẩm khóa 36 Cần Thơ, 2013 LỜI CAM ĐOAN  Đề tài luận văn tốt nghiệp “Nghiên cứu trích ly lipase từ nội tạng cá lóc” là công trình nghiên cứu của sinh viên Dương Ý Thơ với sự hướng dẫn của Ts. Trần Thanh Trúc. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và do chính tác giả thực hiện. Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Giáo viên hướng dẫn Người cam đoan Dương Ý Thơ Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ  Nhờ sự tận tình giúp đỡ của thầy cô và các bạn, đề tài tốt nghiệp của em đã hoàn thành. Có được kết quả này, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến: Cô Trần Thanh Trúc và Thầy Nguyễn Văn Mười, những người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Mặc dù bận rộn với công việc giảng dạy nhưng thầy cô vẫn thường xuyên theo dõi, hướng dẫn và giúp đỡ em rất tận tình. Thầy cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã cho em những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường. Những kiến thức tích lũy được từ sự giảng dạy tận tình của quý thầy cô đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này. Cán bộ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt đề tài của mình. Anh Trần Thế Hiển – học viên Cao học ngành Công nghệ thực phẩm khóa 20, anh đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ em tận tình về kiến thức cũng như phương pháp học tập, nghiên cứu. Các anh chị Cao học Công nghệ thực phẩm khóa 18, khóa 19, các bạn sinh viên lớp Công nghệ thực phẩm khoá 36 đã nhiệt tình đóng góp ý kiến và động viên giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm. Cuối lời em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt những năm học tập tại trường. Kính chúc quý thầy cô và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành công. Em xin chân thành cảm ơn. Cần Thơ, ngày 08 tháng 12 năm 2013 Sinh viên thực hiện Dương Ý Thơ Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang i Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT  Đề tài được thực hiện nhằm mục đích xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá lóc. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài đã khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly, giá trị pH, thời gian và nhiệt độ trích ly đến quá trình thu nhận enzyme lipase. Hoạt tính enzyme được xác định theo phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,05 N với phenolphtalein là chất chỉ thị. Kết quả thí nghiệm cho thấy hiệu quả trích ly lipase đạt tốt nhất với hoạt tính lipase thu được là 5,94 ± 0,16 U/g CKNL khi sử dụng đệm phosphate với pH = 6 để trích ly ở tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly là 1: 4, thời gian trích ly là 3 giờ ở nhiệt độ trích ly 50C. Từ khoá: đệm phosphate, lipase, nhiệt độ trích ly, nội tạng cá lóc, thời gian trích ly Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang ii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................. ii LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................................ i TÓM TẮT ............................................................................................................................. ii MỤC LỤC ........................................................................................................................... iii DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................. v DANH SÁCH BẢNG........................................................................................................... vi CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................ 1 1.1 TỔNG QUAN .......................................................................................................... 1 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU ......................................................................... 3 2.1.1 Cá lóc....................................................................................................................... 3 2.1.2 Tình hình nuôi trồng cá lóc ...................................................................................... 4 2.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LIPASE ..................................................................... 5 2.1.1 Giới thiệu ................................................................................................................. 5 2.1.2 Đặc điểm cấu trúc của lipase.................................................................................... 6 2.2.3 Cơ chế phản ứng ...................................................................................................... 9 2.2.4 Tính đặc hiệu của enzyme lipase............................................................................. 11 2.2.5 Phân loại enzyme lipase ......................................................................................... 11 2.2.6 Một số tính chất của lipase ..................................................................................... 12 2.2.7 Các nguồn thu nhận ............................................................................................... 14 2.2.8 Cơ chế sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật ............................................................... 15 2.2.9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp lipase ................................................. 17 2.2.10 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme lipase ......................................... 18 2.2.11 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase ................................................ 20 2.2.12 Ứng dụng ............................................................................................................... 21 2.3 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY LIPASE TỪ NỘI TẠNG ................................................ 23 2.3.1 Định nghĩa ............................................................................................................. 23 2.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình trích ly enzyme.......................................................... 24 2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly của enzyme ........................................ 24 2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ............................................................ 25 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 27 3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ............................................................................. 27 3.1.1 Địa điểm, thời gian................................................................................................. 27 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị ..................................................................................................... 27 3.1.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm ............................................................................. 27 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................................... 28 3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu .................................................................................... 28 3.2.2 Phương pháp phân tích và đo đạc kết quả .............................................................. 28 3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả ................................................................... 29 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang iii Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 29 3.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát............................................................................ 29 3.3.2 Phân tích thành phần cơ bản của nguyên liệu ......................................................... 30 3.3.3 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc ..................................................................... 31 3.3.4 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi trích ly và pH đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc ..................................................................... 32 3.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc ............................................................................................ 33 3.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase được trích ly từ nội tạng cá lóc ............................................................................................ 35 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................. 36 4.1 Thành phần hoá lý cơ bản của nội tạng cá lóc ................................................................ 36 4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc ........................................................................................................................... 36 4.3 Ảnh hưởng của việc điều chỉnh pH ban đầu của dung môi trích ly đến hoạt tính enzyme lipase trích ly từ nội tạng cá lóc ........................................................................................... 38 4.4 Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc ............ 39 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase từ nội tạng cá lóc ............ 40 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 43 5.1 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 43 5.2 KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 44 PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ....................................................................... vii PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ ................................................................................. xiv Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang iv Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Cá lóc (Channa argus) ........................................................................................... 3 Hình 2.2: Cấu trúc tinh thể lipase Thermomyces lanuginose .................................................. 7 Hình 2.3: Hoạt tính bề mặt của lipase .................................................................................... 8 Hình 2.4: Trung tâm hoạt động lipase Thermomyces lanuginose ............................................ 9 Hình 2.5: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase ........................................... 9 Hình 2.6: Phản ứng thủy phân triacylglycerol theo từng bậc của enzyme lipase ................... 10 Hình 2.7: Cơ chế phản ứng thuỷ phân của lipase.................................................................. 10 Hình 3.1: Nguyên liệu trước và sau xử lý............................................................................. 28 Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ......................................................................... 29 Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ...................................................................................... 32 Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ...................................................................................... 33 Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ...................................................................................... 34 Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4 ...................................................................................... 35 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang v Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Ba nhóm phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase ..................................... 20 Bảng 2.2: Ứng dụng của lipase trong công nghiệp ............................................................... 21 Bảng 3.1: Phương pháp phân tích các chỉ tiêu ...................................................................... 28 Bảng 4.1: Thành phần hoá lý cơ bản của nội tạng cá lóc ...................................................... 36 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu và nước cất đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc ................................................................................................................. 37 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc......... 39 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt tính lipase thu nhận từ nội tạng cá lóc. 40 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt tính enzyme lipase từ nội tạng cá lóc ... 41 Ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng Trang vi Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TỔNG QUAN Trong những năm gần đây, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên quy mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase,… Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa học,… Có thể nói ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử (Ngô Tiến Hiển, 2010). Trong 20 năm cuối thế kỷ XX và các năm đầu của thế kỷ XXI có rất nhiều enzyme khác nhau đã được thương mại hóa và ứng dụng trong thực tiễn ở hầu hết các lĩnh vực của đời sống, Ở Việt Nam bước đầu đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng các enzyme trong chế biến nông sản, thực phẩm, nhất là trong lĩnh vực sản xuất bia, rượu, chế biến tinh bột (Ngô Tiến Hiển, 2010). Lipase (glycerol ester hydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme được ứng dụng trong nhiều ngành như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp hóa học, mỹ phẩm, da, trong y dược và trong các ngành công nghiệp khác do có khả năng xúc tác thủy phân triglyceride thành di, mono glyceride hoặc glycerol và các acid béo nhờ hoạt động trên bề mặt phân pha dầu nước. Trong công nghiệp dầu và chất béo, việc sử dụng lipase rất phổ biến. Có khoảng hơn 100 lipase khác nhau được dùng để chuyển đổi lipid thành các chất khác (Marae và Hammond, 1985). Hiện nay, Việt Nam sử dụng một lượng lớn lipase trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp tẩy rửa, hóa học và y học… song các chế phẩm enzyme được sử dụng phần lớn là do nhập khẩu với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Do vậy, mục đích của đề tài tập trung nghiên cứu thu nhận enzyme lipase từ nột tạng cá lóc bằng phương pháp trích ly nhằm thu được enzyme có hoạt tính cao nhất. 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định các thông số cơ bản của quá trình trích ly lipase có hiệu suất cao từ nội tạng cá lóc. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 1 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Trên cơ sở mục tiêu nghiên cứu đã được đặt ra, đề tài tiến hành các nội dung nghiên cứu chủ yếu sau:  Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (nước cất) sử dụng thích hợp cho quá trình trích ly đến hiệu quả thu nhận lipase  Ảnh hưởng của loại dung dịch đệm và pH sử dụng đến độ ổn định của lipase thu nhận  Sự thay đổi hoạt tính lipase thu nhận do tác động tương tác của nhiệt độ và thời gian trích ly. Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 2 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Cá lóc Cá lóc hay còn gọi là cá quả, cá chuối, cá sộp, cá xộp, cá tràu, cá đô tùy theo từng vùng, là loài cá thuộc họ Channidae. Họ này có hai chi là Channa có 26 loài ở châu Á, và Parachanna (Teugels và Daget, 1984) có 3 loài ở châu Phi. Ở Việt Nam chủ yếu là Channa maculata (có tài liệu gọi là Ophiocephalus maculatus/ Bostrychus maculatus) và Channa argus (hay còn gọi là Ophiocephalus argus, tức cá quả Trung Quốc) (Walter et al., 2004). Hệ thống phân loại cá lóc: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Phân lớp: Neopterygii Bộ: Perciformes Phân bộ: Channoidei Họ: Channidae (Nelson, 1994; trích dẫn bởi Walter et al., 2004) Theo truyển thống, cá lóc được xếp trong bộ Perciformes (Nelson, 1994), tuy nhiên gần đây người ta đã xem xét lại phát sinh chủng loài của cá và đề xuất tách họ này sang bộ Anabantiformes (Ricardo Betancur-R, 2013). Hình 2.1: Cá lóc (Channa argus) (Walter et al., 2004) Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 3 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Cá lóc có thể sống trong các môi trường nước thiếu oxy, là loài cá nước ngọt. Chúng phân bố ở khu vực nhiệt đới như châu Á và châu Phi, đặc biệt là Trung Quốc, Triều Tiên, Sri Lanka, Việt Nam,… Ở những nơi này, cá lóc được coi là loài cá đặc sản. Cá sống chủ yếu ở độ sâu từ 0 đến 30 m trong các sông, suối, ao, hồ và trong các ao nuôi nhân tạo. Chúng sinh sống ở tầng nước giữa và thấp, hay tìm thấy trong các ao hồ có nhiều rong cỏ và nước đục. Cá lóc thường sinh sống ở những khu vực có nhiệt độ 7 ÷ 35C. Cá lóc có 40 ÷ 46 tia vây lưng, 28 ÷ 30 tia vây hậu môn, 41 ÷ 55 vảy đường bên. Đầu cá lóc Channa maculata có đường vân giống như chữ “nhất” và hai chữ “bát”, còn đầu cá Channa argus tương đối nhọn và dài giống như đầu rắn. Đầu của chúng bẹt so với thân, vảy tạo vân màu nâu xám xen lẫn với những chỗ màu xám nhạt. Lưng có màu đen ánh nâu. Cá lóc lớn tương đối nhanh. Con lớn nhất có thể dài đến 1 m, nặng đến 20 kg. Cá một tuổi thân dài khoảng 19 ÷ 39 cm, nặng 95 ÷ 760 g; cá hai tuổi thân dài 38,5 ÷ 40 cm, nặng 625 ÷ 1.395 g; cá ba tuổi thân dài 45 ÷ 59 cm, nặng 1,5 ÷ 2,0 kg (con đực và cái có sự chênh lệch lớn). Khi nhiệt độ trên 20C, cá lóc sinh trưởng khá nhanh, tuy nhiên, khi nhiệt độ xuống dưới 15C, chúng bắt đầu sinh trưởng chậm lại. Cá từ một năm tuổi trở lên đã có khả năng sinh sản. Mùa sinh sản thường là tháng 4 ÷ 7 hàng năm. Cá mới nở sử dụng dinh dưỡng từ noãn hoàng, khi noãn hoàng hết cá ăn các loài thức ăn bên ngoài như: luân trùng, trứng nước, động vật phù du… Khi trọng lượng nặng 0,5 kg chúng có thể ăn tới 20% trọng lượng cơ thể mỗi ngày. Trong điều kiện nuôi nhân tạo, chúng cũng ăn thức ăn chế biến (Trần Đắc Định và cộng sự, 2013). 2.1.2 Tình hình nuôi trồng cá lóc Chuyển đổi cơ cấu cây trồng vật nuôi là một trong những vấn đề trọng tâm đã và đang được chính quyền các cấp quan tâm. Trong những năm qua, với các trở ngại về việc xuất nhập khẩu cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long cùng với việc không kiểm soát được cung cầu đối với nguồn nguyên liệu này, giải pháp thay thế cá tra bằng cá lóc đã được áp dụng. Mặc dù vậy, với việc thả nuôi và mở rộng ào ạt cá lóc ở các tỉnh đã dẫn đến sự ứ đọng nguồn nguyên liệu này, cũng là nguyên nhân làm tăng nguy cơ tồn ứ đầu ra của cá lóc. Chuyên mục phóng sự của Đài truyền hình Trà Vinh ngày 26/11/2013 cũng đã cho thấy thực trạng của việc sụt giảm giá cá và sự ô nhiễm nguồn nước sinh hoạt từ việc mở rộng không kểm soát việc nuôi cá lóc. Nếu như năm 2012, toàn tỉnh Trà Vinh có 660 hộ thả nuôi cá lóc, thì hiện tại, theo thống kê sơ bộ, toàn tỉnh hiện có hơn 1.000 hộ thả nuôi, tăng gần gấp đôi so với cùng kỳ năm ngoái. Số hộ nuôi cá lóc tăng một cách nhanh chóng như vậy là do người dân thấy chỉ Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 4 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ sau 5 tháng nuôi trên diện tích 1.000 m2, người nuôi đã thu lợi nhuận hơn 100 triệu đồng với giá liên tục giữ ở mức 35.000 – 36.000 đồng/kg, trong khi trồng mía cả năm chỉ thu được khoảng 2 triệu đồng. Vì thế, nhiều hộ dân rủ nhau bỏ cây mía, lấy đất đào ao nuôi cá lóc. Điều này đang xảy ra rộng khắp ở các tỉnh trong khu vực đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt là Vĩnh Long, Đồng Tháp. Tuy nhiên, vì loại thuỷ sản này hiện chỉ tiêu thụ nội địa, nếu mở rộng diện tích tự phát như hiện nay thì cung sẽ vượt cầu; hơn nữa, hệ thống thuỷ lợi ở vùng nuôi cá lóc hiện chưa đáp ứng nổi diện tích nuôi ngày càng lớn, môi trường nước đang có dấu hiệu bị ô nhiễm nặng, khả năng bị nhiễm bệnh là rất lớn. (Hoàng Xuân, 2013; http://tepbac.com/news/full/7011/Nong-dan-do-xo-dao-ao-thaca-loc-tren-dat-lua.htm). Chính vì thế, nghiên cứu giải pháp sử dụng hiệu quả nguồn nguyên liệu này là vấn đề có tính cấp thiết, giúp giải quyết chủ động đầu ra cho cá lóc, đảm bảo giá cả và bình ổn đời sống cho người dân. Việc sử dụng nguyên liệu này trong chế biến khô cá lóc là một giải pháp phổ biến nhất được thực hiện (http://www.vasep.com.vn/TinTuc/51_28448/Dong-Thap-Che-bien-kho-ca-loc-bang-he-thong-say.htm). Điều này kéo theo tỷ lệ phụ phẩm từ cá lóc gia tăng. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tận dụng nguồn phụ phẩm này trong chế biến các chế phẩm sinh học, thực phẩm chức năng có ý nghĩa rất quan trọng. Nội tạng cá lóc cũng như các loài cá là nguồn nguyên liệu thuận tiện cho vi sinh vật phát triển, nhưng cũng là nguồn cung cấp nhiều enzyme quan trọng, điển hình là protease, lipase và cellulase (Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn, 2006). Việc sử dụng nội tạng cá lóc trong ly trích enzyme là hướng tích cực giúp tăng giá trị kinh tế của nguồn nguyên liệu này và giúp hạn chế chất thải vào môi trường. 2.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME LIPASE 2.1.1 Giới thiệu Lipase (glycerol ester hydrolase hay triacylglycerol acylhydrolase – EC 3.1.1.3), thuộc nhóm phụ enzyme thủy phân có Serine của họ enzyme thủy phân α/β, xúc tác thủy phân các nối ester của triacylglycerol tạo thành acylglycerol và acid béo tương ứng (Litthauer et al., 2002). Lipase hiện diện rộng rãi và tham gia vào sự chuyển hóa sinh học của lipid trong tự nhiên. Nét đặc trưng chuyên biệt giúp phân biệt lipase với các enzyme esterase khác là khả năng hoạt động tại bề mặt phân cách giữa pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất. Bên cạnh hoạt tính thủy phân lipid, enzyme lipase còn có hoạt tính thủy phân và tổng hợp ester. Lipase được tổng hợp bởi nhiều vi sinh vật và các sinh vật nhân chuẩn. Vi sinh vật sinh tổng hợp lipase bao gồm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và xạ khuẩn được tìm Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 5 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ thấy rộng rãi trong các môi trường như: nước thải công nghiệp, nhà máy chế biến dầu thực vật, sữa, đất lẫn dầu, hạt có dầu, thực phẩm thối rữa, than đá, suối nước nóng,... Hầu hết lipase thương mại có nguồn gốc từ vi khuẩn, được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp quan trọng (Kamini et al., 2000). Trong thị phần enzyme thế giới, lipase chiếm 5% và chỉ xếp sau protease và carbohydrase (Ghosh et al., 1996). Lipase có nhiều ứng dụng triển vọng trong các quy trình hóa hữu cơ, sản xuất chất tẩy, tổng hợp chất hoạt động bề mặt, công nghiệp hóa dầu ăn, công nghiệp sữa, công nghiệp nông hóa, sản xuất giấy, chất dinh dưỡng, mỹ phẩm, dược phẩm,... (Kamini et al., 2000). Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn thiếu những enzyme lipase có tính chất đặc hiệu cần thiết. 2.1.2 Đặc điểm cấu trúc của lipase 2.2.2.1 Cấu trúc phân tử Lipase thu nhận từ vi sinh vật là nguồn enzyme đầy tiềm năng và được nghiên cứu một cách sâu rộng. Nhìn chung, lipase có cấu trúc / với vị trí trung tâm là lưới hỗn hợp  chứa bộ ba xúc tác và có cấu trúc xoắn ngăn cản cơ chất tiếp xúc trung tâm hoạt động. Cấu trúc không gian (3D) của lipase từ nấm Rhizomucor miehei và lipase từ tuyến tụy của người đã được xác định vào năm 1990 (Zygmunt và Urszula, 1992; Winkler et al., 1990), từ đó đến nay có hơn 11 cấu trúc lipase nữa được xác định. Ngoại trừ lipase từ tuyến tụy của người, tất cả các lipase còn lại đều từ vi sinh vật (Zygmunt và Urszula, 1992). Rhizomucor miehei (Mucor miehei) sản xuất lipase ngoại bào có khả năng thuỷ phân rất nhiều cơ chất khác nhau. Trong quá trình sinh tổng hợp, cấu trúc phân tử của enzyme được gắn thêm một đoạn peptide tín hiệu (signal peptide) và một đoạn propeptide bên cạnh mạch enzyme chính bao gồm 269 amino acid có phân tử lượng là 29.472 Dalton. Có hai dạng đồng phân của enzyme là dạng A (pI = 3,9) và dạng B (pI = 4,3) phụ thuộc mức độ deglycosylation trong quá trình sau dịch mã. Cấu trúc của lipase Rhizomucor miehei là cấu trúc dạng / gồm vùng lưới  trung tâm có tám dải  liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lưỡng cực (N-terminal). Tất cả các cấu trúc xoắn đều nằm một bên lưới . Ba liên kết disulfide trong phân tử lipase, Cys29-Cys268; Cys40-Cys43 và Cys235-Cys244 có tác dụng làm cho toàn bộ cấu trúc của enzyme được ổn định. Vùng trung tâm hoạt động của enzyme có chứa bộ ba xúc tác Ser144, His257 và Asp203 nhưng lại bị che phủ bởi phần không phân cực của cấu trúc xoắn lưỡng cực “lid”. “Lid” là một đoạn oligopeptide kỵ nước mà enzyme esterase không có. Chính vì điều này đã giúp lipase hấp phụ được trên bề mặt phân chia pha dầu-nước và sau đó diễn ra sự tái sắp xếp cấu trúc enzyme, đoạn phân tử Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 6 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ “lid” sẽ cuộn vào trong để lộ vùng trung tâm hoạt động xúc tác thuỷ phân cơ chất. Vì thế, ta có thể nhận thấy rằng hoạt tính bề mặt của lipase chính là việc tạo thành cấu trúc bền vững trên bề mặt phân chia giữa hai pha dầu và nước (Zygmunt và Urszula, 1992). Lipase từ Geotrichum candidum cũng tồn tại dưới hai dạng đồng phân: dạng I (pI = 4,56) và dạng II (pI = 4,46) có cùng chiều dài mạch là 544 amino acid, phân tử lượng 59.085 Dalton và có từ hai đến ba vị trí N-glycosylation tương ứng với từng dạng đồng phân. Tuy nhiên, lipase I và II được mã hoá bởi hai đoạn gen khác nhau. Cấu trúc của enzyme cũng có dạng / với lưới hỗn hợp  hình thành bởi 11 dải trong đó có 7 dải song song với nhau. Những cấu trúc cuộn xoắn liên kết với các dải đều nằm ở hai bên vùng lưới . Hai liên kết disulfide được tìm thấy là Cys61-Cys105 và Cys276-Cys288. Bộ ba xúc tác là Ser217, His463 và Glu354 nằm trong vùng trung tâm hoạt động bị che khuất bởi hai cấu trúc xoắn  gần như song song với nhau. Một số cấu trúc phân tử của lipase thu nhận từ Candida rugosa, C. antarctica, Rhizopus delmar, Pseudomonas glumae và Ps. aeruginosa cũng được nghiên cứu. Song, sự khác biệt quan trọng về cấu trúc giữa lipase tuyến tuỵ và vi sinh vật chính là phần enzyme chứa đầu Carbon (C-terminal domain) được dùng để liên kết với colipase không có trong cấu trúc enzyme của vi sinh vật. Một điều cần phải lưu ý là không phải tất cả lipase đều có hoạt tính bề mặt. Ví dụ như lipase từ Pseudomonas aeruginosa thiếu cấu trúc xoắn “lid” bao phủ trung tâm hoạt động, do đó enzyme này không có hoạt tính bề mặt (Wong, 1995). Hình 2.2: Cấu trúc tinh thể lipase Thermomyces lanuginose Lưới , cấu trúc xoắn , trung tâm hoạt động và đoạn phân tử “lid” được thể hiện tương ứng trong màu xanh, vàng, đỏ (sticks) và đỏ. (Wong, 1995) Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 7 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 2.2.2.2 Trường Đại học Cần Thơ Hoạt tính bề mặt Nhờ vào kỹ thuật X quang mà cấu trúc tinh thể của một số lipase đã được xác định. Trong cấu trúc đó có một phân đoạn xoắn , được gọi là “lid”, đã che lấp trung tâm hoạt động làm cho enzyme không thể có hoạt tính xúc tác trong dung dịch nước hoặc trong dung môi hữu cơ. Nhưng nếu trong dung dịch xuất hiện bề mặt phân chia pha giữa dầu và nước thì sự hấp phụ enzyme này lên bề mặt đó sẽ làm thay đổi hình dạng enzyme dẫn đến việc mở rộng cửa rào “lid” tạo điều kiện cho sự tiếp xúc cơ chất với trung tâm hoạt động (Wong, 1995). Hình 2.3: Hoạt tính bề mặt của lipase E, enzyme trong pha nước; Ea, enzyme hấp phụ trên bề mặt; Ea*, enzyme được hoạt hoá; S, cơ chất; Ea*S, phức enzyme cơ chất; Ea*Ac, acylenzyme; P1, P2, sản phẩm thuỷ phân (Wong, 1995) 2.2.2.3 Trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động của lipase là những phân tử acid amin có vị trí xác định trên toàn bộ cấu trúc phân tử enzyme, bao gồm bộ ba xúc tác Serine, Histidine và Aspartate (có thể thay thế bằng Glutamate) (Wong, 1995). Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được hoạt hóa. Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid. Do đó, sự hiện diện của Serine ở tâm hoạt động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong chuỗi pentapeptide Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly (Lohse et al., 1997). Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 8 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 2.4: Trung tâm hoạt động lipase Thermomyces lanuginose Nguyên tử C màu xanh lá, O màu đỏ, N màu xanh dương, H màu trắng (Wong, 1995) 2.2.3 Cơ chế phản ứng Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân, phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester (gồm có phản ứng rượu hóa (alcoholysis) và thủy phân glicogen (glycolysis)), phản ứng trao đổi ester (gồm có phản ứng acid hóa (acidolysis) và trao đổi ester) và phản ứng amin hóa (aminolysis). Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều hướng của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng. Hình 2.5: Phản ứng thủy phân triacylglycerol của enzyme lipase (http://www.1cro.com/campbell/hottopics/hibernation/hibernation.html) Khi cung cấp đầy đủ nước, phản ứng thủy phân xảy ra (theo chiều thuận). Ngược lại, trong điều kiện thiếu nước, phản ứng ester hóa xảy ra và tổng hợp lại glyceride từ acid béo tự do và glycerol (theo chiều nghịch). Các phản ứng này xảy ra tại bề mặt phân cách giữa cơ chất và pha nước nên gây khó khăn cho việc phân tích động học và khảo sát hoạt tính của lipase. Lipase thủy phân triacylglycerols (TAG) theo từng bậc, tạo ra diacylglycerols (DAG), monoacylglycerols (MAG) và acid béo (FA), rồi cuối cùng thủy phân hoàn toàn tạo ra glycerol và acid béo tự do (Girousse, 2012). Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 9 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Hình 2.6: Phản ứng thủy phân triacylglycerol theo từng bậc của enzyme lipase (Girousse, 2012) Phản ứng thuỷ phân được thực hiện nhờ bộ ba xúc tác Serine, Histidine và Aspartate trải qua năm giai đoạn sau:  Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động  Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất tạo liên kết đồng hoá trị hình thành hợp chất trung gian. Giai đoạn này được hỗ trợ bởi hoạt tính xúc tác base của Histidine trong bộ ba xúc tác  Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxy của liên kết ester (R1OH)  Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động của Histidine, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu trúc tứ diện  Giải phóng acid carboxylic (R2COOH). Hình 2.7: Cơ chế phản ứng thuỷ phân của lipase (Wong, 1995) Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 10 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Trong số các phản ứng trên, được quan tâm nhiều nhất là phản ứng chuyển ester hóa, acid hóa (acidolysis) và rượu hóa (alcoholysis). Sự chuyển ester hóa là sự chuyển nhóm acyl giữa 2 ester, có thể là giữa hai triglyceride hoặc giữa một triglyceride và một acid béo. Acid hóa là sự chuyển nhóm acyl giữa một acid và một ester. Rượu hóa là phản ứng giữa rượu và ester. Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu – nước, nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của lipase (Sharma, 2001). Điều này có thể khắc phục theo hướng tăng diện tích ở bề mặt tiếp xúc giữa hai pha bằng cách tạo thể nhũ tương dầu bởi sự khuấy động mạnh với tác nhân nhũ hóa. Do đó, cần áp dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng diện tích tiếp xúc của các tế bào nhũ hóa. Lipase có ứng dụng thương mại thường là enzyme ngoại bào, được thu từ nhiều vi sinh vật khác nhau. Nhiều lipase hoạt động trong dung môi hữu cơ, xúc tác một số phản ứng có lợi gồm tạo ester, chuyển ester, gắn acyl chọn lọc vị trí của glycol và menthol, tổng hợp peptide và các hóa chất khác. Triển vọng là lipase sẽ trở thành một enzyme công nghiệp quan trọng như protease và carbohydrase hiện nay. 2.2.4 Tính đặc hiệu của enzyme lipase Trong tự nhiên, lipase có từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Chính sự đa dạng này đã ảnh hưởng đến tính đặc hiệu trong các phản ứng chúng xúc tác. Dựa vào tính đặc hiệu đối với các acid béo trong phân tử triglyceride, lipase vi sinh vật có thể được phân thành ba nhóm (John, 2000). Nhóm đầu tiên bao gồm những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceride, ví dụ như lipase từ Candida cylindracea và Staphylococcus aureus. Nhóm thứ hai được xem là quan trọng nhất bao gồm những enzyme xúc tác đặc hiệu vị trí 1, 3 trên phân tử triacylglycerol, trong đó thông dụng là lipase từ Aspergillus niger, Rhizopus delemar, Mucor miehei và Pseudomonas fragi. Nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác đặc hiệu một số acid béo nhất định, ví dụ lipase từ Geotrichum candidum chỉ thuỷ phân acid béo mạch dài hoặc acid béo không no dạng cis-9. 2.2.5 Phân loại enzyme lipase Theo Arpigny và Jaeger (1999), enzyme thủy phân lipid có nguồn gốc từ vi sinh vật được xếp làm 8 họ: Ngành Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng Trang 11