Tài liệu Nghiên cứu trích ly hoạt chất sinh học từ cây thuốc dòi (pouzolzia zeylanca l. benn)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG HUỲNH THỊ NGỌC NHẪN NGHIÊN CỨU TRÍCH LY HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ CÂY THUỐC DÒI (POUZOLZIA ZEYLANCA L. BENN) Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Cần thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TRÍCH LY HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ CÂY THUỐC DÒI (POUZOLZIA ZEYLANCA L. BENN) Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện PGs. Ts. Nguyễn Minh Thủy Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn MSSV: C1200650 Lớp: CB1208L1 Cần thơ, 2014 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ Luận văn đính kèm theo đây với đề tài “Khảo sát hoạt chất sinh học từ cây thuốc dòi (Pouzolzia Zeylanca L. Benn)” do sinh viên Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Cần Thơ, ngày ..... tháng 5 năm 2014 Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng PGs.Ts. NGUYỄN MINH THỦY SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn i Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Ngày 20/05/2014 Người hướng dẫn PGs.Ts. NGUYỄN MINH THỦY SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn Người viết HUỲNH THỊ NGỌC NHẪN ii Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Nhờ sự quan tâm, hướng dẫn của thầy cô và sự giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình. Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Cô Nguyễn Minh Thủy. Cô luôn quan tâm và nhiệt tình chỉ dẫn, Cô sẵn sàng hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cảm ơn chị Trần Thị Thùy Linh và bạn Lê Thị Ngọc Mỷ đã đồng hành cùng tôi trong quá trình nghiên cứu. Đồng cảm ơn anh Nguyễn Bảo Trương, anh Đinh Công Dinh và anh Nguyễn Ái Thạch đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình giảng dạy, đã tạo mọi điều kiện và giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Cảm ơn các bạn lớp Công nghệ thực phẩm liên thông khóa 38 đã cùng tôi vượt qua những khó khăn và tạo cho tôi nhiều động lực để hoàn thành đề tài luận văn với kết quả tốt nhất cũng như trong suốt khóa học. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện HUỲNH THỊ NGỌC NHẪN SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn iii Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iiii DANH SÁCH HÌNH................................................................................................viii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ viiii TÓM LƯỢC .............................................................................................................. ix CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ..............................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ..........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ..........................................................................................1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................2 2.1. Sơ lược về cây thuốc dòi ..................................................................................2 2.1.1. Mô tả thực vật .............................................................................................2 2.1.2. Phân bố sinh thái ........................................................................................2 2.1.3. Dược tính ....................................................................................................2 2.2. Trích ly..............................................................................................................3 2.2.1 Khái niệm trích ly ........................................................................................3 2.2.2 Một số yêu cầu cơ bản đối với các chất trích ly ra từ nguyên liệu thực vật 3 2.2.3 Phương pháp trích ly ...................................................................................4 2.2.3.1 Chọn dung môi ......................................................................................4 2.2.3.2 Cách trích và dụng cụ trích ...................................................................4 2.2.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly .............................................5 2.2.4.1 Loại dung môi .......................................................................................5 2.2.4.2 Nồng độ dung môi ................................................................................5 2.2.4.3 Kích thước nguyên liệu .........................................................................5 2.2.4.4 Nhiệt độ trích ly ....................................................................................6 2.2.4.5 Tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu .....................................................6 2.2.4.6 Thời gian trích ly...................................................................................6 2.3 Hoạt chất sinh học .............................................................................................7 2.3.1 Hợp chất polyphenol ...................................................................................7 2.3.1.1 Tính chất của polyphenol ......................................................................7 2.3.1.2 Vai trò của các polyphenol ...................................................................7 SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn iv Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ 2.3.2 Hợp chất anthocyanin ..................................................................................8 2.3.2.1 Cấu trúc anthocyanin ............................................................................9 2.3.2.2 Tính chất của anthocyanin ..................................................................10 2.3.2.3 Công dụng của anthocyanin ................................................................12 2.3.3 Hợp chất tannin .........................................................................................13 2.3.3.1 Phân loại ..............................................................................................13 2.3.3.2 Tính chất của tannin ............................................................................16 2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của tannin .....................................19 2.3.3.4 Vai trò và ứng dụng của tannin ...........................................................20 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................21 3.1 Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................21 3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ................................................................21 3.1.2 Nguyên liệu ...............................................................................................21 3.1.3 Thiết bị và hóa chất ...................................................................................21 3.1.3.1 Dụng cụ và thiết bị ..............................................................................21 3.1.3.2 Hóa chất ..............................................................................................21 3.2 Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................21 3.2.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hưởng của bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu đến hàm lượng các hoạt chất sinh học hiện diện trong cây thuốc dòi.........22 3.2.2 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/ nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp xử lý đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học ...............................................................................................23 3.2.3 Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học trong dịch trích ly ........................24 3.2.4 Công thức tính hiệu suất trích ly các hoạt chất sinh học ...........................25 3.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................25 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................26 4.1 Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong các bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu .........................................................................................................................26 4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học .................27 4.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học ...............................................................................................28 SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn v Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ 4.2.2 Ảnh hưởng biện pháp xử lý nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học .......................................................................................................28 4.2.3 Ảnh hưởng phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học ...............................................................................................................29 4.3 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học trong dịch trích .........................................................................30 4.3.1 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi hoạt chất polyphenol ..........................................................................................30 4.3.2 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly hoạt chất tannin ..................................................................................................31 4.3.3 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly hoạt chất anthocyanin .........................................................................................36 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN.........................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................42 PHỤ LỤC .................................................................................................................... I SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn vi Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Các anthocyanin quan trọng nhất trong tự nhiên (Rein, 2005) ...................9 Hình 2.2. Cấu trúc một số anthocyanin tự nhiên ......................................................10 Hình 2.3. Sự thay đổi màu sắc của anthocyanin theo pH .........................................11 Hình 2.4. Một số dạng của pyogallic tannin .............................................................14 Hình 2.5. Một số monomer đơn phân tử ...................................................................14 Hình 2.6. Acicd meta - digallic .................................................................................15 Hình 2.7. Acid chebulic và acid hexahydroxydiphenic hexahydroxydiphenic hexahydroxydiphenic hexahydroxydiphenic ............................................................15 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình trích ly .............................................................................22 Hình 4.1. Hiệu suất trích ly tannin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 10 phút) 32 Hình 4.2. Hiệu suất trích ly tannin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 20 phút) 33 Hình 4.3. Hiệu suất trích ly tannin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 30 phút) 33 Hình 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ (oC), thời gian (phút), pH dịch trích 3 đến hiệu suất thu hồi tannin (%) ..............................................................................................34 Hình 4.5. Tương quan giữa hiệu suất trích ly tannin lý thuyết và thực tế ................35 Hình 4.6. Hiệu suất trích ly anthocyanin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 10 phút) ..........................................................................................................................37 Hình 4.7. Hiệu suất trích ly anthocyanin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 20 phút) ..........................................................................................................................38 Hình 4.8. Hiệu suất trích ly anthocyanin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 30 phút) ..........................................................................................................................38 Hình 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ (oC) và thời gian (phút) ở pH dịch trích là 3 đến hiệu suất thu hồi anthocyanin (%) .............................................................................39 Hình 4.10. Tương quan giữa hiệu suất trích ly anthocyanin lý thuyết và thực tế .....40 Hình A1. Đường chuẩn acid gallic............................................................................. II SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn vii Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1. Màu sắc anthocyanin thay đổi theo pH ....................................................12 Bảng 4.1 Hàm lượng hoạt chất sinh học trong cây thuốc dòi theo bộ phận và đặc tính nguyên liệu .........................................................................................................26 Bảng 4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học ................27 Bảng 4.3. Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học ......................................................................................................28 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học ......................................................................................................29 Bảng 4.5. Ảnh hưởng phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học .....................................................................................................................29 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi hoạt chất polyphenol .................................................................................................30 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi hoạt chất tannin .........................................................................................................31 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly hoạt chất anthocyanin ................................................................................................36 SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn viii Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của (i) bộ phận cây (lá non, lá già, thân) và đặc tính nguyên liệu (nguyên liệu tươi, nguyên liệu khô) đến hàm lượng các hoạt chất sinh học polyphenol tổng, tannin, anthocyanin; (ii) tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi:nước (1:5, 1:10, 1:15, 1:20), biện pháp xử lý nguyên liệu (nguyên cây, cắt nhỏ) và phương pháp xử lý khuấy trộn (không khuấy trộn, khuấy trộn) đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học; (iii) pH (3÷6), nhiệt độ (70÷90oC) và thời gian trích ly (10÷30 phút) đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học. Kết quả nghiên cứu cho thấy các hoạt chất sinh học tập trung nhiều ở bộ phận lá của cây thuốc dòi và đặc biệt có hàm lượng cao khi nguyên liệu ở trạng thái tươi. Hàm lượng polyphenol (17,74%) và tannin (12,75%) tập trung nhiều ở bộ phận lá non của cây, riêng anthocyanin (0,36%) có nhiều trong lá già của cây. Ở tỷ lệ thuốc dòi:nước là 1:15, khi cắt nhỏ nguyên liệu kết hợp với phương pháp khuấy trộn cho hiệu suất trích ly các hoạt chất sinh học cao. Ở nhiệt độ 90oC, thời gian 30 phút và pH 3 cho hiệu suất thu hồi anthocyanin (87,3%) và tannin (64,96%) cao nhất. Hiệu suất thu hồi polyphenol cao khi trích ly ở nhiệt độ 90oC, thời gian 30 phút và dung môi pH 5 (72,14%). SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn ix Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ở nước ta, cây thuốc dòi phân bố rộng rãi khắp các tỉnh từ đồng bằng đến trung du và miền núi. Thuốc dòi là loại cây ưa ẩm, thường mọc lẫn với các loại cây cỏ trong vườn. Chúng là loại thân thảo mộc, sống quanh năm có vị ngọt, đắng nhạt, tính mát có tác dụng tiêu khát, trừ đờm,…Theo y học cổ truyền và các nghiên cứu hiện đại, cây thuốc dòi có tác dụng chữa trị: cảm ho, ho lâu ngày, viêm họng, bệnh về phổi, đau răng, tiêu viêm, rút mủ. Ngoài ra, cây thuốc dòi còn có thể kết hợp với những vị thuốc khác tạo ra vị thuốc chữa trị rất hữu hiệu chẳng hạn khi kết hợp giữa cây công chúa lá rộng (Canga latifolia) và cây thuốc dòi (Pouzolzia indica) có khả năng chống lại ung thư. Tuy nhiên, cây thuốc dòi chỉ được biết đến với vai trò là vị thuốc dân gian dễ tìm dùng chữa trị một số bệnh. Việc tách chiết hay khảo sát các hoạt tính sinh học trong cây thuốc dòi vẫn chưa được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm và thậm chí hiện nay cây được xem như là cỏ dại. Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và công nghệ, các biệt dược đi từ nguồn tổng hợp có tác dụng ức chế miễn dịch hiện đang được sử dụng rộng rãi nhưng chúng lại đắt tiền và có nhiều tác dụng phụ gây nguy hiểm. Vì vậy, xu hướng hiện nay là tìm các hoạt chất thiên nhiên từ các thảo mộc có tác dụng như thuốc tổng hợp nhưng lại ít độc và dễ dung nạp. Đặc biệt với xu hướng hiện đại hóa, xã hội rất chuộng những sản phẩm thực phẩm sinh học vừa đáp ứng nhu cầu ăn uống, vừa có tính năng phòng trị bệnh. Nhằm tận thu nguồn nguyên liệu dồi dào và nâng cao giá trị kinh tế của cây thuốc dòi, nghiên cứu trích ly các hoạt chất sinh học trong cây thuốc dòi để làm cơ sở cho quá trình chế biến nước uống sinh học từ loại nguyên liệu hữu dụng này. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly các hoạt chất sinh học trong cây thuốc dòi ở mức độ cao nhất. SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 1 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây thuốc dòi Tên thường gọi: Bọ mắm, thuốc dòi. Tên khoa học: Pouzolzia zeylanica (L) Benn hoặc Pouzolzia indica Gaud. Họ: Urticaceae (họ gai) 2.1.1 Mô tả thực vật Thuốc dòi là loài thảo mộc sống quanh năm, thân thẳng đứng hướng lên, đơn giản và có nhánh. Cây cao khoảng 12÷50cm. Thân rễ thường có mấu, cành cây thường ngắn có lông. Lá mọc so le thỉnh thoảng đối xứng, mép nguyên, hình mác – bầu dục, gốc tròn, đầu nhọn, dài 3÷9cm, rộng 1,5÷2,5cm, có 3 gân tỏa từ gốc, mặt trên đôi khi điểm những đốm trắng, mặt dưới có ít lông ở gân nổi rõ, cuống lá ngắn có lông trắng (Đỗ Huy Bích và cộng sự). Cụm hoa thường có cả hoa đực và hoa cái. Bầu nhụy có dạng elip hoặc hình thoi, đường kính bầu nhụy từ 0,8÷1mm. Quả có đường kính 1,5÷1,8mm, có lông măng không dễ thấy, trên quả có 9 đường gân hoặc có 4 cạnh, trên đỉnh quả có 2 nhánh như 2 răng nhọn. Quả có màu trắng sáng hoặc màu vàng tối hoặc màu nâu sáng, hình trứng. Cây thuốc dòi ra hoa từ tháng 7 – 8 và bắt đầu có quả từ tháng 8 – 10. 2.1.2 Phân bố sinh thái Thuốc dòi là cây ưa ẩm, hơi chịu bóng, thường mọc lẫn với các loại cây cỏ trong vườn, ven đường đi và nương rẫy. Ở Việt Nam thuốc dòi phân bố rộng rãi khắp các tỉnh từ đồng bằng đến trung du và cả vùng núi. Ngoài ra, còn thấy ở nhiều nước Châu Á khác như Trung Quốc, Lào, Campuchia, Ấn Độ, Thái Lan,… 2.1.3 Dược tính Cây thuốc dòi có vị ngọt, đắng nhạt, tính mát, có tác dụng tiêu khát, trừ đờm, lợi tiểu, tiêu viêm, rút mủ. Người ta thường dùng cả phần trên mặt đất lẫn phần dưới mặt đất của cây thuốc dòi. Theo y học cổ truyền và các nghiên cứu hiện đại, cây thuốc dòi thường được sử dụng trị:  Cảm ho hoặc ho lâu ngày, viêm họng, bệnh về phổi.  Lỵ, viêm ruột.  Nhiễm trùng đường tiết niệu, bí tiểu tiện.  Đau răng.  Nấm da cứng. SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 2 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ  Dùng ngoài trị đinh nhọt, sâu quảng, viêm mủ da, viêm vú, đụng giập.  Ở Ấn Độ, cây dùng trị giang mai, bệnh lậu và nọc độc rắn.  Ở Malaysia, dịch lá tươi sắc lá dùng uống như là lợi sữa khi có hiện tượng ngưng tiết sữa. Một số bài thuốc trong Đông y: - Chữa ho lao hay ho lâu ngày: Dùng 40g thuốc dòi sắc uống hoặc nấu cao lỏng pha với mật ong uống mỗi ngày vài lần, mỗi lần từ 15mL đến 20mL. - Chữa trị các bệnh viêm họng, đau răng: dùng lá cây thuốc dòi giã lấy nước uống. - Chữa tắc tia sữa, tiểu gắt, tiểu buốt: dùng 30÷40g cây sắc uống mỗi ngày. Ngày nay trong y học, cây thuốc dòi còn sử dụng kết hợp với những vị thuốc khác nhằm tạo ra những loại thuốc có công hiệu rõ rệt. Chẳng hạn như khi nấu thuốc dòi (Pouzolzia indica) với cây công chúa lá rộng (Canga latifolia) để uống có khả năng phòng chống ung thư. Ngoài ra, rễ cây thuốc dòi dùng giải độc, chống lại vi khuẩn, giải sốt và giúp thải ra mủ từ vết thương nhiễm trùng. Theo những kết quả nghiên cứu, dịch trích từ cây thuốc dòi bằng nước hoặc bằng dung dịch acid cho thấy khả năng chống lại những tác nhân gây hại cho da phụ nữ. Do đó, các dịch trích ly này thường cho thêm vào các loại mỹ phẩm bảo vệ da. 2.2 Trích ly 2.2.1 Khái niệm trích ly Quá trình tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp nhờ dung môi, trong đó dung môi này hòa tan chọn lọc một số chất trong hỗn hợp gọi là trích ly hay nói cách khác quá trình trích ly dựa trên cơ sở độ hòa tan không đồng nhất của các chất có trong hỗn hợp dung môi này hay dung môi khác. Trích ly là quá trình khuếch tán. Trích ly ở nhiệt độ phòng không có đảo trộn xảy ra do khuếch tán phân tử, khi đun nóng hoặc có khuấy trộn gọi là khuếch tán đối lưu (Tấn Minh Tâm, 1998). Hiệu số nồng độ các chất hòa tan ở hai pha tiếp xúc nhau là động lực của quá trình. Chất tan chuyển dời về phía có nồng độ nhỏ từ pha này sang pha khác (từ pha lỏng này sang pha lỏng khác hoặc từ pha rắn sang pha lỏng). Khi sự chênh lệch nồng độ lớn lượng chất trích ly tăng. 2.2.2 Một số yêu cầu cơ bản đối với các chất trích ly ra từ nguyên liệu thực vật Dù xuất phát từ loại nguyên liệu nào thì các sản phẩm trích ly ra muốn tồn tại trên thị trường cần đạt một số yêu cầu sau: - Hàm lượng hoạt chất cao và ổn định. SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 3 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ - Có tác dụng tốt cho đối tượng sử dụng. - Dễ sử dụng và bảo quản. 2.2.3 Phương pháp trích ly Phương pháp trích ly bao gồm: Chọn dung môi trích ly, dụng cụ trích ly và cách trích ly. 2.2.3.1 Chọn dung môi Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng dung môi và việc chọn dung môi thích hợp quyết định chất lượng và hiệu quả cho một phương pháp trích ly, nên yêu cầu chung của dung môi là: - Phải có tính hòa tan chọn lọc, tức là hòa tan tốt các chất cần tách mà không được hòa tan hoặc hòa tan ít các chất khác. - Không có tác dụng hóa học với các cấu tử của dung dịch. - Không phá hủy thiết bị. - Rẻ và dễ tìm. - Đối với trích ly lỏng – lỏng yêu cầu khối lượng riêng của dung môi khác xa với khối lượng riêng của dung dịch (Nguyễn Bin, 2008). - Không bị biến đổi thành phần khi bảo quản. - Dung môi phải được tách ra sau quá trình trích ly bằng phương pháp đun nóng, chưng cất hoặc sấy. Sau khi tách không để mùi vị lạ và không gây độc cho sản phẩm. 2.2.3.2 Cách trích và dụng cụ trích Có nhiều loại thiết bị trích ly: Gián đoạn một bậc hoặc nhiều bậc, liên tục, tổng hợp một số nhóm thiết bị, chúng còn khác nhau về hình dáng, khác nhau về cơ cấu vận chuyển vật liệu và dung môi trong thiết bị, cơ cấu khuấy đảo, mức độ phức tạp của thiết bị. Một thiết bị sử dụng để trích ly cần đảm bảo các yêu cầu sau: - Trích ly triệt để các cấu tử ra khỏi hỗn hợp. - Tổn thất trong bã nhỏ, nồng độ dung dịch cao, chất lượng tốt. - Cấu tạo đơn giản, không phức tạp, dễ lắp ráp sửa chữa, dễ thao tác. Trong thực tế người ta thường sử dụng hai phương pháp trích ly ở nhiệt độ thường và trích ly nóng.  Trích ly nhiệt độ thường Có hai phương pháp: trích ly ngấm kiệt và trích ly phân đoạn. Phương pháp trích ly ngấm kiệt cho kết quả tốt hơn trích ly phân đoạn do trích ly được nhiều hoạt chất và tốn ít dung môi, giảm sức lao động và tăng năng suất. SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 4 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ  Trích ly nóng Tùy thuộc vào loại dung môi được sử dụng người ta áp dụng các phương pháp trích ly khác nhau. Nếu dung môi là chất bay hơi thì áp dụng cách trích ly liên tục hoặc trích ly hồi lưu. Nếu dung môi là nước thì áp dụng cách sắc hoặc hãm phân đoạn. Dụng cụ trích ly thông dụng là bình soxhlet, trích ly hồi lưu thông dụng là bình sinh hàn. Ngoài ra còn có những phương pháp trích ly khác như: - Trích ly ở áp suất thấp trong chân không. - Trích ly ở áp suất cao. - Trích ly với tác dụng của siêu âm. - Trích ly với tác dụng của chất hoạt điện. 2.2.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 2.2.4.1 Loại dung môi Quá trình hình thành một dung dịch tùy thuộc vào đặc tính của chất tan và dung môi. Để hình thành một dung dịch trước hết phải có sự phá vỡ các cầu nối liên kết trong hợp chất tan và trong dung môi để từ đó hình thành dây liên kết mới giữa chất tan và dung môi. Chính vì thế, dung môi có thể sử dụng để trích ly một chất tan hoặc một nhóm chất tan nào đó ra khỏi nguyên liệu phải phù hợp với bản chất mà ta mong muốn trích ly, phù hợp với độ phân cực của chất muốn trích ly. Hay nói cách khác, dung môi khác nhau có hiệu suất trích ly khác nhau. Hiệu suất trích ly phản ánh một quá trình trích ly. Quá trình công nghệ trích ly tốt hiệu suất trích ly cao. 2.2.4.2 Nồng độ dung môi Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuếch tán. Vì vậy, sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha cũng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trích ly. Khi sử dụng dung môi có nồng độ quá thấp thì hiệu suất trích ly thấp do quá trình trích ly hoạt chất không hòa tan triệt để. Mặt khác, sử dụng dung môi nồng độ quá cao có thể gây biến đổi các chất làm ảnh hưởng xấu đến sản phẩm. Vì thế, việc xác định nồng độ dung môi sử dụng trong quá trình trích ly là yếu tố quan trọng cần xác định để đảm bảo hiệu suất trích ly và hiệu quả kinh tế của quá trình. 2.2.4.3 Kích thước nguyên liệu Với các loại nguyên liệu rắn, cần tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi. Điều này được thực hiện bằng cách nghiền nhỏ, thái nhỏ, băm nhỏ nguyên liệu. Làm nhỏ kích thước nguyên liệu giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu. SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 5 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ Kích thước càng nhỏ thì quá trình trích ly càng dễ và hiệu suất trích ly càng cao. Tuy nhiên nếu quá mịn sẽ bị lắng đọng trên lớp nguyên liệu, tắc ống dẫn hoặc bị dòng dung môi cuốn vào mixen làm dung dịch có nhiều cặn, làm phức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo, tốn chi phí (Lê Bạch Tuyết, 1996). Kích thước vật liệu quá lớn thì dung môi không đi vào nội phân tử, do diện tích tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu nhỏ nên gây sự hao hụt lớn về lượng chất trích ly ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly. Việc xác định kích thước vật liệu có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly. Việc lựa chọn kích cỡ vật liệu trong quá trình trích ly rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất, dễ áp dụng trong sản xuất thực tế. 2.2.4.4 Nhiệt độ trích ly Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi. Khi tăng nhiệt độ trích ly, các phân tử dung môi và chất tan xảy ra sự chuyển động hỗn độn làm tăng vận tốc khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi nhờ vậy mà hiệu suất trích ly tăng. Tuy nhiên, nhiệt độ là một yếu tố giới hạn. Nhiệt độ quá thấp thì thời gian trích ly dài gây ảnh hưởng hiệu suất trích ly, chi phí cao. Nhiệt độ quá cao thì sản phẩm cháy khét, các chất hòa tan bị biến đổi do xảy ra các phản ứng không cần thiết, ảnh hưởng lớn đến sản phẩm, chi phí cao cho phần cung cấp nhiệt. Vì vậy, cần xác định nhiệt độ trong quy trình trích ly để đảm bảo sản phẩm đạt hiệu quả về chất lượng và kinh tế. 2.2.4.5 Tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu Nếu tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu càng nhỏ thì quá trình trích ly xảy ra không triệt để, hiệu suất trích ly thấp. Nếu tỷ lệ này quá lớn gây hao tổn dung môi, tốn chi phí. Hiệu suất trích ly sẽ đạt cao nhất tại một tỷ lệ nhất định nào đó và không tăng hoặc tăng không đáng kể khi thêm dung môi. Do đó, khi tiến hành trích chất hòa tan nào đó từ nguyên liệu cần cân nhắc giữa chi phí tổn thất cho dung môi và hiệu suất thu được để đạt lợi nhuận cao. Đây cũng là giới hạn của quá trình trích ly. 2.2.4.6 Thời gian trích ly Khi thời gian tăng lượng chất trích ly tăng nhưng chỉ ở một giới hạn nhất định. Khi đã đạt được mức độ trích ly cao nhất kéo dài thời gian không mang lại hiệu quả kinh tế. SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 6 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ 2.3 Hoạt chất sinh học 2.3.1 Hợp chất polyphenol Polyphenol là hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng benzene, trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm hydroxyl. Dựa vào đặc trưng của cấu tạo hóa học người ta chia các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính: Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid gallic. Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid cafeic. Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6: Catechin, flavonoid. 2.3.1.1 Tính chất của polyphenol Các polyphenol có chứa gốc pyrocatechic hoặc pyrogallic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hóa – khử, phản ứng cộng và ngưng tụ. - Phản ứng oxy hóa – khử: dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase các polyphenol bị oxy hóa thành các quinone. - Phản ứng cộng: khi có mặt các acid amin các quinone tiến hành phản ứng cộng với acid amin tạo thành các orthoquinone tương ứng. - Phản ứng ngưng tụ: Các orthoquinone này dễ dàng ngưng tụ với nhau tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là flobafen. 2.3.1.2 Vai trò của các polyphenol Các hợp chất phenol là một trong những nhóm sản phẩm trao đổi chất bậc hai chủ yếu của thực vật, rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Polyphenol bảo vệ thực vật trước tia cực tím, chống lại sự oxy hóa, bảo vệ thực vật trước sự tấn công của vi sinh vật gây hại (như vi khuẩn gây thối rễ ở khoai tây). Sự có mặt của anthocyanin mang lại màu tím cho quả sim, nho, dâu tây, táo và một số màu trung gian của một số loại hoa. Bên cạnh đó, flavonoid cũng có vai trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, phát triển hoa quả, thúc đẩy sự sinh tồn của cây. Ong thích màu xanh, màu vàng; bướm thích màu hồng và màu trắng; ruồi thích màu trắng; chim sâu thích màu đỏ. Các màu này đều do hợp chất flavonoid tạo nên (Đái Duy Ban, 2008). Ngoài ra các polyphenol còn có tác dụng ức chế nấm, bình thường trong thực vật tác dụng đó thể hiện tương đối yếu nhưng nó sẽ tăng lên một cách mạnh mẽ trong quá trình polyphenol bị oxy hóa bởi enzyme. Tuy nhiên, đóng vai trò quan trọng trong hiện tượng miễn dịch thực vật này không phải chỉ một mình polyphenol mà là hệ polyphenol – polyphenoloxydase. Người ta đã chứng minh rằng trong nhiều cây bị tổn thương cơ học hay bị nhiễm trùng thì hàm lượng polyphenol và hoạt độ polyphenoloxydase đều tăng lên. Ở chỗ mô bị tổn thương bắt đầu tạo thành hợp SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 7 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ chất polyphenol mới và kèm theo sự ngưng tụ oxy hóa trong lớp bề mặt – sản phẩm ngưng tụ tạo thành lớp bảo vệ (Lê Ngọc Tú, 2003). Là vật liệu góp phần vào độ bền chức của thực vật và sự thẩm thấu của thành tế bào đối với nước và khí. Nhiều polyphenol có hoạt tính sinh tố P nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và chuẩn hóa tính thấm của vi ti huyết quản. Trong số đó catechin có hoạt tính vitamin P cao nhất (Lê Ngọc Tú, 2003). Các hợp chất polyphenol là những chất hoạt động giữ vai trò chủ đạo quyết định hương vị, màu sắc của nhiều sản phẩm thực phẩm và ở mức độ nhất định chúng tham gia vào quá trình tạo ra các cấu tử thơm mới đặc biệt cho sản phẩm. Các polyphenol trong trà mang lại vị chát cho trà. Các sản phẩm trà đen, trà đỏ, trà vàng, trà xanh,… với sắc nước hương thơm và vị đặc trưng rất khác nhau, phụ thuộc vào mức độ chiều hướng của phản ứng oxy hóa bởi enzyme và phi enzyme các polyphenol trong lá trà. L-epigallocatechin (L-EGC) và L-epigallocatechin gallate (L-EGCG) có khả năng tạo thành sản phẩm có màu đỏ tươi đặc trưng của trà đen (Đái Duy Ban, 2008). Ngoài ra polyphenol còn là chất bảo quản tự nhiên không gây độc hại cho các sản phẩm thực phẩm. Trong sản phẩm đồ hộp, để bảo vệ các màu sắc tự nhiên người ta cho thêm các chất chống oxy hóa như: thêm rutin để bảo vệ màu của anh đào và mận, thêm tannin để bảo vệ màu của dâu và anh đào (Lê Ngọc Tú, 2003). Các hợp chất phenol có khả năng chống oxy hóa mạnh, do đó giúp cơ thể ngăn ngừa stress oxy hóa, ngăn ngừa các bệnh ung thư, tim mạch, các bệnh về mắt, bệnh lão hóa sớm. Tannin có khả năng bình thường hóa hoạt động của hệ vi khuẩn có ích trong ruột, ngăn ngừa quá trình thối rữa, sinh hơi và rối loạn khác làm cản trở hoạt động của ruột (Đái Duy Ban, 2008). Đặc biệt, chất chống oxy hóa EGCG (epigallocatechin gallate) là loại polyphenol vô cùng mạnh, nó có công dụng ngăn ngừa các enzyme kích hoạt sự sao chép nhân bản tế bào ung thư. Hợp chất flavonoid có khả năng ngăn ngừa cholesterol xấu, chống tụ máu, chống xơ cứng động mạch. Catechin tạo vị đắng, có công dụng hữu hiệu trong việc tiêu diệt hầu hết những loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và giải trừ luôn những độc tố do tiết ra cụ thể là là độc tố veratoxin của Ecoli (http://www.mayhaiche.vn/article_d/c3-37/tra-xanh-doi-voi-suc-khoe-con-nguoi). 2.3.2 Hợp chất anthocyanin Các anthocyanin thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn nhất trong giới thực vật. Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthoccyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kysanesos – nghĩa là màu xanh. Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian. Các SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 8 Luận văn tốt nghiệp K38-LT Trường Đại học Cần Thơ anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon. Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau. Vì thế, hàm lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15–20 lần. 2.3.2.1 Cấu trúc anthocyanin Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khả năng hòa tan trong nước và chứa trong các không bào. Về bản chất, các anthocyanin là hợp chất glycoside của các dẫn suất polyhydroxyl và polymethoxyl của 2-phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium. Ngày nay, có 20 anthocyanidin khác nhau được biết đến nhưng chỉ có 6 trong số đó là phổ biến và quan trọng nhất. Các anthocyanidin quan trọng nhất là pelargonidin, cyanidin, delphinidin, peonidin, petunidin, và maldivin (hình 2.1). Những aglycon khác nhau ở số lượng của các nhóm hydroxyl và methoxyl trong vòng B của cation flavylium (Rein, 2005). Cyanidin Pelargonidin Malvidin Peonidin Delphinidin Petunidin Hình 2.1. Các anthocyanin quan trọng nhất trong tự nhiên (Rein, 2005) Trong tự nhiên, anthocyanin rất hiếm khi ở trạng thái tự do. Nhóm hydroxyl tự do ở vị trí C-3 làm cho phân tử anthocyanin trở nên không ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với anthocyanin tương ứng. Vì vậy, sự glycosyl hóa luôn diễn ra đầu tiên ở vị trí nhóm 3-hydroxyl. Nếu có thêm một phân tử đường nữa thì vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thường gặp nhất là ở C-5. Ngoài ra sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở vị trí C-7, C-3, C-5. SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 9