Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số dẫn chất thiazolidin -2,4-dion

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUỐC THẮNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THIAZOLIDIN-2,4-DION KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN QUỐC THẮNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THIAZOLIDIN-2,4-DION KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. Phan Thị Phương Dung 2. DS. Lâm Thị Hòa Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên với tất cả sự kính trọng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Hải Nam và cô giáo TS. Phan Thị Phƣơng Dung, các thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến DS. Lâm Thị Hòa cùng các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa Dược Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt 5 năm học vừa qua. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các cán bộ phòng Phân tích hữu cơ – Viện Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Phòng Hóa vật liệu – Khoa Hóa – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đặc biệt là bố mẹ tôi, người thân và bạn bè đã quan tâm, động viên tạo động lực cho trong cuộc sống và học tập. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Quốc Thắng MỤC LỤC CH NG T NG QU N ................................................................................... 2 Tác dụng sinh học của thiazolidindion ........................................................... 2 Độc tính tế bào ......................................................................................... 2 1.1.2. Tác dụng ức chế enzym histon deacetylase .............................................. 5 3 Một số tác dụng khác của thiazolidindion .............................................. 12 2 Một số phản ứng sử dụng trong tổng hợp dẫn chất thiazolidindion ............. 14 2 Phương pháp tổng hợp thiazolidin-2,4-dion............................................ 14 2 2 Phản ứng thế SN2 .................................................................................. 15 2 3 Phản ứng ngưng tụ ................................................................................ 15 CH NG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................................................... 17 2 Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................... 17 2 2 Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 17 2 3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 19 2 4 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 19 24 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết ........................................... 19 2 4 2 Xác định cấu trúc .................................................................................. 20 2 4 3 Thử tác dụng độc tính tế bào in vitro ..................................................... 20 2 4 4 Đánh giá mức độ giống thuốc của các dẫn chất tổng hợp được ............. 21 3 Hóa học ....................................................................................................... 22 3 Tổng hợp hóa học.................................................................................. 22 3 2 Kiểm tra độ tinh khiết............................................................................ 32 3 3 Xác định cấu trúc .................................................................................. 33 3 2 Thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất được tổng hợp .................. 38 3 3 Bàn luận ...................................................................................................... 39 33 Tổng hợp hóa học.................................................................................. 39 3 3 2 Tác dụng kháng tế bào ung thư .............................................................. 41 KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 43 TÀI LIỆU TH M KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT: 13 1 C-NMR H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C nuclear magnetic resonance) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H nuclear magnetic resonance) CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử DCM Dicloromethan DMF N,N-dimethylformamid DMSO Dimethyl sunfoxid EtOH Ethanol HAT Histon acetyltranferase HDAC Histon deacetylase IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) HepG2 Tế bào ung thư gan MeOH Methanol MS Phổ khối lượng (Mass spectroscopy) PPAR-γ Peroxisom proliferator activated receptor gamma MTT Thuốc nhuộm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid PTP 1B Protein tyrosin phosphat 1B SAHA Acid suberoylanilid STT Số thứ tự SWL68 Tế bào gan bình thường SW620 Tế bào ung thư đại tràng TZD Thiazolidin-2,4-dion TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng STT Trang Bảng 1.1 Kết quả thử độc tính tế bào của các hợp chất TZD 3 Bảng 1.2 Giá trị IC50 của các TZD (µM) và giá trị logP 4 Bảng 3.1 Hiệu suất và các chỉ số hóa lý của các sản phẩm được tổng hợp 32 Bảng 3.2 Giá trị Rf và tonc của các sản phẩm cuối 4a-4d 33 Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất trung gian 34 Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các chất 34 Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các chất sản phẩm cuối 35 Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các sản phẩm cuối 36 Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các sản phẩm cuối 37 Bảng 3.8 Tác dụng kháng tế bào ung thư đại tràng (SW62 ) 39 Bảng 3.9 Đánh giá độ giống thuốc của dãy chất được tổng hợp 42 DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH VẼ HÌNH VẼ Tên hình STT Hình 1.1 Vai trò cân bằng động giữa HD C và H T đối với sự Trang 6 phiên mã Hình 1.2 Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 7 Hình 1.3 Cấu trúc một số hoạt chất ức chế HDAC 8 Hình 1.4 Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố 8 Hình 1.5 Cấu trúc của S H và trung tâm hoạt động của HDAC 9 Hình 1.6 Cấu trúc thiết kế và hợp chất ức chế HD C 10 Hình 1.7 Mô hình phân tử I và II tạo liên kết chelat với ion Zn2+ 10 trong protein Hình 1.8 Độc tính tế bào tại các nồng độ 11 Hình 1.9 Độc tính tế bào theo thời gian 12 Hình 1.10 Kết quả ức chế HD C của các chất sau 8h 12 Hình 1.11 Tác dụng của TZD trên PP R-γ 13 Hình 1.12 Một số TZD ức chế PTP1B mới được nghiên cứu 14 SƠ ĐỒ `STT Tên sơ đồ Trang 3.1 Quy trình tổng hợp các chất 22 3.2 Tổng hợp thiazolidin-2,4-dion 22 3.3 Tổng hợp dãy chất 2a-d 23 3.4 Tổng hợp dãy chất 3a-d 26 3.5 Tổng hợp dãy chất 4a-d 29 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thiazolidindion (TZD) và các dẫn chất đã được biết đến có tác dụng chống đái tháo đường nhờ hoạt hóa thụ thể peroxisom proliferator activated receptor gamma và ức chế protein tyrosin phosphat 1B [13,14]. Một số thuốc điều trị đái tháo đường týp 2 dựa trên khung TZD vẫn đang được sử dụng trên thị trường như Pioglitazon [2, 17]. Bên cạnh đó, các hợp chất TZD còn được nghiên cứu khai thác các tác dụng khác như tác dụng kháng khuẩn [6], kháng nấm [7,8], chống oxi hóa tế bào [18]. Đặc biệt trong thời gian gần đây, các nghiên cứu về dẫn chất của TZD thường hướng tới hoạt tính kháng trên các dòng tế bào ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư gan và một số dòng tế bào khác [12,26,28]. Các tác giả đã thiết kế công thức mới của TZD, trong đó nhóm TZD đóng vai trò ức chế enzym histon deacetylase (một enzym quan trọng trong quá trình hình thành các tế bào ung thư) [26]. Kết quả thu được rất khả quan khi so sánh với một số chất chống ung thư hiện hành. Từ các kết quả nghiên cứu trên, nhằm mục đích tìm kiếm thêm các dẫn chất thiazolidindion triển vọng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất thiazolidin-2,4-dion” với các mục tiêu sau: 1. Tổng hợp N-(2-(4-((2,4-dioxothiazolidin-5-yliden)methyl)phenoxy)ethyl) benzensulfonamid và một số dẫn chất. 2. Thử độc tính tế bào của các chất tổng hợp được. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tác dụng sinh học của thiazolidindion Thiazolidindion còn được gọi là glitazon là nhóm các dẫn chất có chứa gốc thiazolidin-2,4-dion: Các TZD đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như: tác dụng kháng khuẩn [6,7], chống nấm [7,8], chống oxy hóa [18], gây độc tế bào, chống ung thư [12,26,28], hoạt hóa thụ thể PPAR-γ, ức chế protein PTP1B [8,12,14]. Hiện nay, hướng nghiên cứu về hoạt tính của TZD đang được quan tâm nhiều là độc tính tế bào, ức chế HDAC, hoạt hóa PPAR-γ và ức chế PTP1B. 1.1.1.Độc tính tế bào Năm 2 , V Patil cùng cộng sự đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất mang nhóm TZD (I) và thử độc tính in vitro trên 7 dòng tế bào ung thư bao gồm: Hop62 (ung thư phổi), PC3 (ung thư tuyến tiền liệt), MCF7 (ung thư vú), HepG2 (ung thư gan), K562 (ung thư bạch cầu), Gurav (ung thư miệng) và KB (ung thư vòm họng). Nồng độ các chất thử nghiệm trong khoảng từ 10-4 tới 10-7 M, tiến hành song song với 2 mẫu thử, một mẫu không sử dụng chất ức chế và một mẫu sử dụng chất ức chế là doxorubicin [29]. Sau 48 giờ, đánh giá mức độ phát triển của mỗi dòng tế bào, xác định các nồng độ tại đó khả năng phát triển của tế bào bị ức chế 50% (GI50). Tính giá trị logarit nồng độ tại GI50, các giá trị âm thể hiện cho sự nhạy cảm của các dòng tế bào, các hợp chất có giá trị logGI50 < -4 được coi là có hoạt tính Y=R-NH Ib,Ic,Ie Y=R Ia,Id I 3 Bảng 1.1: Kết quả thử độc tính tế bào của các hợp chất TZD I Hợp chất R logGI50 K562 MCF7 Ia >-4,0 -4,53 >-4,0 Ib >-4,0 >-4,0 Ic -5,65 Id Ie Doxorubicin HepG2 Hop62 PC3 Gurav KB -6,72 -4,53 >-4,0 >-4,0 >-4,0 -6,73 >-4,0 >-4,0 >-4,0 >-4,0 >-4,0 -4,51 -5,65 -6,71 >-4,0 >-4,0 -4,53 >-4,0 -5,64 -4,53 >-4,0 >-4,0 -6,72 -6,71 >-4,0 >-4,0 -5,60 -6,73 -5,65 -5,59 -6,88 <-7,0 -6,97 -6,96 -6,97 <-7,0 GI50: nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào Nhận xét từ kết quả nghiên cứu cho thấy, hợp chất Ie có tác dụng ức chế tế bào ung thư mạnh nhất trong các chất được tổng hợp. Chất này ức chế 5 trong số 7 dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là K562, MCF7, PC3, Gurav và KB Chất Ic cho thấy tác dụng yếu hơn, khi ức chế được 4 trong số 7 dòng tế bào: K562, Hop62, PC3 và Gurav. Hợp chất Ia và Id cùng cho thấy tác dụng trên 3 dòng tế bào ung thư là MCF7, HOP62 và PC3 Riêng chất Ib chỉ ức chế được duy nhất dòng tế bào là Hop62. Tất cả các chất trên đều không có tác dụng trên dòng tế bào ung thư gan (HepG2) Có thể là do các enzym amidase trong tế bào gan đã chuyển hóa nhanh chóng các hợp chất, khiến cho chúng không thể hiện được tác dụng [29]. Tiếp tục theo hướng nghiên cứu này, . Shankar và cộng sự cũng đã tiến hành tổng hợp nhóm hợp chất có chứa khung TZD (II) và đánh giá độc tính trên các 4 dòng tế bào ung thư ở người: HeLa (ung thư cổ tử cung), HT-29 (ung thư trực tràng), 549 (ung thư phổi), MCF-7 (ung thư vú) Sự ức chế phát triển của các tế bào ung thư sau 24 giờ được ghi nhận qua giá trị IC50 (µM) [7]. Sử dụng phần mềm để tính logP (thể hiện sự cân bằng giữa các nhóm thân dầu và thân nước) của các hợp chất tổng hợp được, từ đó có thể suy luận được khả năng thấm qua màng tế bào II Bảng 1.2: Giá trị IC50 của các TZD (µM) và giá trị logP Chất Giá trị IC50 (μM) Ar HeLa HT29 A549 MCF-7 logP 72 88 90 100 3,05 38 30 42 48 3,86 34 32 36 38 3,22 68 72 78 100 3,50 48 48 55 58 3,08 30 32 36 30 2,68 IIa IIb IIc IId IIe IIf 5 Chất IIg IIh Giá trị IC50 (μM) Ar HeLa HT29 A549 MCF-7 logP 62 78 80 90 2,05 60 80 72 84 1,88 80 94 76 90 2,54 IIi IC50: nồng độ mà tại đó 50% tế bào bị chết hoặc ức chế Từ kết quả nghiên cứu trên, nhận thấy hợp chất với nhóm thế là vòng benzen (IIa) và methylbenzen (IId) cho độc tính tế bào thấp với các giá trị IC50 cao từ 60100 µM Khi vòng benzen có thêm các nhóm thế halogen là brom (IIb) hoặc flo (IIc) hoạt tính tăng lên đáng kể với giá trị IC50 thu được trong khoảng 40-50 µM Hợp chất có tác dụng mạnh nhất là 3,4,5-trimethoxylbenzen (IIe) với các giá trị IC50 thấp nhất từ 30-36 μM. Ngoài ra, các hợp chất dị vòng chứa Nitơ (IIg, IIh) và oxy (IIi) cho các giá trị IC50 ở mức cao từ 60-90 μM. Giá trị logP của các dẫn chất vòng benzen (IIa-IIf) cao hơn so với các dẫn chất mang nhóm dị vòng (IIg-IIi), chứng tỏ tính thân dầu của các hợp chất IIa-IIf cao hơn so với các hợp chất IIg-IIi Tính thân dầu thấp là một trong những nguyên nhân chung khiến các chất khó thấm qua màng tế bào [7]. Các kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy các dẫn chất mang khung TZD có tác dụng trong việc ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư 1.1.2. Tác dụng ức chế enzym histon deacetylase 1.1.2.1. Khái niệm và cấu trúc enzym histon deacetylase Histon deacetylase là một nhóm các enzym xúc tác quá trình loại bỏ nhóm acetyl từ ε-N-acetyl lysin amino acid của phần histon [16]. Loại nhóm acetyl từ phần amin làm trung hòa điện tích dương của histon, dẫn đến giảm tương tác điện giữa histon với ADN. Khi tương tác điện này yếu, nhiễm sắc thể tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra, đặc tính của gen được biểu hiện thông qua các tính 6 trạng. Trong khi enzym histon acetyltranferase xúc tác quá trình acetyl hóa có tác dụng ngược lại. Trong tế bào, H T và HD C là 2 enzym điều hòa quá trình acetyl hóa từ đó quyết định sự biểu hiện gen [4]. Trạng thái bất hoạt Trạng thái hoạt động Hình 1.1: Vai trò cân bằng động giữa HDAC và HAT đối với sự phiên mã Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự ức chế phiên mã không thích hợp của HD C là cơ chế phổ biến tạo ra các protein gây ung thư Sự biến đổi trong cấu trúc chất nhiễm sắc có thể tác động lên quá trình biệt hóa tế bào bình thường, dẫn tới sự hình thành khối u. Ức chế hoạt động của enzym HD C là đích tác dụng của nhiều thuốc chống ung thư đang được nghiên cứu trong giai đoạn hiện nay [16,22]. Về căn bản, các HD C có cấu trúc trung tâm hoạt động khá giống nhau, chúng đều gồm các phần cơ bản sau : + Ion Zn2+: là coenzym của HDAC nằm ở trung tâm xúc tác của chúng Đây là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon bằng liên kết phối trí Thông thường các chất ức chế HD C liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HD C và độc tính tế bào càng mạnh [10]. + Kênh enzym: là nơi chứa đựng cơ chất và tham gia liên kết Van der Walls với cơ chất Kênh này được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất và tham gia phản ứng deacetyl hóa [20]. 7 Hình 1.2: Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 1.1.2.2. Một số chất ức chế HDAC đã được công bố Từ những phát hiện đầu tiên về tác dụng ức chế HDAC của natri butyrat đã có những đề tài lớn trong việc nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế HD C Đã có nhiều chất ức chế HD C được tìm ra, trong đó chất có tác dụng mạnh nhất được biết đến hiện nay là TS - một sản phẩm lên men của Streptomyces, nhưng việc sản xuất nó hiện nay là không khả thi [25] Cho đến thời điểm này, đã có hai chất ức chế HD C được FDA cấp phép lưu hành trên thị trường có tác dụng điều trị u lympho tế bào T dưới da: SAHA (Vorinostat, Zolina®) - chất có nguồn gốc tổng hợp, Romidepsin (Istodax®) - chất được phân lập từ Chromobacterium violaceum [32] Ngày nay có khoảng 15 chất ức chế HD C đang được nghiên cứu thử nghiệm trên lâm sàng để điều trị ung thư (hình SAHA 3). Romidepsin 8 TSA Acid valproic Hình 1.3: Cấu trúc một số hoạt chất ức chế HDAC Nhóm tổng hợp của bộ môn Hóa Dược Trường Đại học Dược Hà Nội cũng đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất có tác dụng ức chế HDAC dựa trên cấu trúc của SAHA. Các kết quả thu được về khả năng ức chế HD C cũng như độc tính tế bào trên một số dòng tế bào ung thư là rất khả quan [5,27]. n1:1-3 n:1-6 n2:1-2 Hình 1.4: Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố Theo một số tài liệu tham khảo, hiệu quả tác dụng của các chất ức chế HDAC dựa trên sự có mặt của 3 yếu tố chính [10] (hình 5): - Nhóm kết thúc có thể liên kết với Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các enzym HDAC như: acid hydroxamic, thiol, benzamid, mecaptoceton - Cầu nối: thường là các mạch hydrocarbon, nằm trong lòng enzym - Nhóm khoá hoạt động (capping group): thường là vòng thơm hoặc peptid vòng, thường nằm trên bề mặt của enzym. Dựa trên các hiểu biết về cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC, R. Mohan cùng cộng sự (2 ) đã nghiên cứu và thiết kế một số hợp chất của TZD (IIIa và IIIb) nhằm ức chế HD C trên dòng tế bào ung thư gan Khác với các hợp chất dựa trên cấu trúc của S H , tác giả sử dụng nhóm TZD là nhóm tạo phức với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của enzym (hình 6) [26]. 9 Chuỗi dài hẹp “túi” enzym Nhóm liên kết (acid hydroxamic) Khoảng trống Vùng hoạt động Vùng bề mặt protein Hình 1.5: Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC Nhóm khóa hoạt động Cầu nối Nhóm hút điện a Nhóm ức chế IIIa-b b Hình 1.6: Cấu trúc thiết ế và hợp chất ức chế HDAC Các chất thiết kế được nghiên cứu đánh giá tính tương tác với HD C thông qua docking bằng mô hình trên phầm mềm MOE (Molecular Operating 10 Environment). Kết quả docking cho thấy ái lực cao của hai chất được thiết kế đối với HDAC, thể hiện sự phù hợp về cấu trúc so với “túi” HD C Hình 1. : Mô h nh phân tử I và II tạo iên ết che at với ion Zn trong protein Tác dụng sinh học của 2 hợp chất mới tổng hợp được đánh giá qua độc tính tế bào và tác dụng ức chế enzym HDAC. Đánh giá độc tính tế bào của hai hợp chất được tổng hợp tiến hành trên 2 dòng tế bào: tế bào ung thư gan (HepG2) và tế bào gan bình thường (WRL68). Hai tiêu chí đánh giá là tác dụng phụ thuộc vào liều và tác dụng phụ thuộc vào thời gian. Sử dụng dòng tế bào WRL68 nhằm theo dõi ảnh hường của các TZD trên tế bào gan bình thường. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở hình 8 và Biểu đồ kết quả cho thấy ở nồng độ 9 µM sau 48 giờ, trên dòng tế bào HepG2: chất IIIa làm 42,3 % tế bào chết và ở IIIb là 57,27% Trên dòng tế bào WRL68, độc tính của hai chất gần tương đương nhau: 34,66% (IIIa) và 37,5% (IIIb) Độc tính đã xuất hiện trên cả 2 dòng tế bào, tuy nhiên vẫn có sự chọn lọc hơn trên dòng tế bào HepG2 11 % tế bào chết % tế bào chết % tế bào chết theo liều của IIIb % tế bào chết theo liều của IIIa Hình 1.8: Độc tính tế bào tại các nồng độ sau 48h Thí nghiệm tiếp theo theo dõi sự ức chế tế bào của 2 chất tại các thời điểm 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ và 2 giờ. Tại thời điểm kết thúc 2 giờ, chất IIIa ức chế 82,98% tế bào HepG2 và 92,34% tế bào WRL68, trong khi đó chất IIIb tương ứng chỉ là 69,45% HepG2 và 55,6% WRL68 Chất IIIa cho thấy hoạt tính ức chế mạnh hơn theo thời gian so với chất IIIb Tuy nhiên lại có điểm hạn chế khi tác dụng trên dòng tế bào WRL68 mạnh hơn trên dòng tế bào HepG2 % tế bào chết % tế bào chết % tế bào chết theo thời gian của IIIa % tế bào chết theo thời gian của IIIb Hình 1.9: Độc tính tế bào theo thời gian Tiếp tục đánh giá khả năng ức chế HDAC in vitro của các chất được tổng hợp trên dòng tế bào HepG2, đối chiếu và so sánh kết quả với hai chất ức chế