Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Nghiên cứu tổng hợp tạp chất b của terazosin dùng trong kiểm nghiệm...

Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp tạp chất b của terazosin dùng trong kiểm nghiệm

.PDF
119
309
127

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -----  ------ TRẦN THỊ OANH Mã sinh viên: 1201452 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -----  ------ TRẦN THỊ OANH Mã sinh viên: 1201452 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP CHẤT B CỦA TERAZOSIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy Nơi thực hiện Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI, 2017 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian nghiên cứu, tìm hiểu và thực hiện đề tài với rất nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Với lòng biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy giảng viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược và Bộ môn Hóa Lý - trường Đại học Dược Hà Nội, đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, các anh chị, các bạn và các em trong nhóm kiểm nghiệm tại bộ môn Hóa Dược đã luôn động viên khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017 Sinh viên Trần Thị Oanh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………..1 Chương 1. TỔNG QUAN……………………………………………………2 1.1. Terazosin ..........................................................................................................2 1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin .........................................................2 1.1.2. Chỉ định của terazosin ...............................................................................2 1.1.3. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường ...................................2 1.2. Tạp chất B của terazosintheo USP 37 ..............................................................4 1.2.1. Một số thông tin chung về tạp chất B của terazosin .................................4 1.2.2. Quy định về giới hạn tạp chất B của terazosin trong nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin ............................................................................................4 1.2.3. Phương pháp xác định tạp chất B trongnguyên liệu terazosin theo USP 37 .........................................................................................................................4 1.3. Tổng quan về một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài ...5 1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ..................................................................5 1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ...................................................7 1.3.3. Phương pháp đo phổ hồng ngoại ............................................................11 1.3.4. Phương pháp phân tích khối phổ ............................................................12 1.3.5. Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ........................................12 1.3.6. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy .......................................................13 1.3.7. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng ...............................................14 1.4. Các phương pháp tinh chế các hợp chất hữu cơ ............................................14 1.4.1. Chiết ........................................................................................................14 1.4.2. Sắc ký cột ................................................................................................15 1.4.3. Kết tinh ....................................................................................................15 1.5. Các phương pháp tổng hợp dẫn chất phenol ..................................................16 1.5.1. Phương pháp 1 ........................................................................................16 1.5.2. Phương pháp 2 ........................................................................................16 1.5.3. Phương pháp 3 ........................................................................................16 1.5.4. Phương pháp 4 ........................................................................................17 1.5.5. Phương pháp 5 ........................................................................................17 1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới ........................................17 1.6.1. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..........................................................17 1.6.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..........................................................18 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………………………...21 2.1. Nguyên liệu ....................................................................................................21 2.2. Thiết bị ...........................................................................................................21 2.3. Nôi dung nghiên cứu ......................................................................................22 2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................22 2.4.1. Phương pháp tổng hợp tạp chất B ...........................................................22 2.4.2. Phương pháp tinh chế sản phẩm thô .......................................................22 2.4.3. Khẳng định cấu trúc chất tổng hợp được ................................................23 2.4.4. Xác định giới hạn tạp chất ......................................................................23 2.4.5. Xác định hàm lượng IBT ........................................................................23 2.4.6. Xác định giới hạn tạp chất B trong nguyên liệu chứa terazosin .............23 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……………...24 3.1. Tổng hợp tạp chất B của terazosin .................................................................24 3.1.1. Nguyên tắc : ............................................................................................24 3.1.2. Quy trình tổng hợp chung: ......................................................................24 3.1.3. Cách đánh giá để lựa chọn điều kiện phản ứng thích hợp ......................25 3.1.4. Khảo sát giai đoạn diazo hóa ..................................................................25 3.1.5. Khảo sát giai đoạn thủy phân ..................................................................29 3.1.6. Quy trình tổng hợp tạp chất B của terazosin ...........................................32 3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm thô .......................................................32 3.2.1. Đo nhiệt độ nóng chảy ............................................................................32 3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm thô bằng TLC ...............................33 3.3. Tinh chế IBT thô ............................................................................................34 3.3.1. Chuẩn bị cột sắc ký .................................................................................34 3.3.2. Đưa mẫu lên cột ......................................................................................34 3.3.3. Tiến hành rửa giải ...................................................................................34 3.4. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế ................................................35 3.4.1. Đo nhiệt độ nóng chảy ............................................................................35 3.5. Khẳng định cấu trúc của sản phẩm tinh chế...................................................37 3.5.1. Đo phổ IR ................................................................................................37 3.5.2. Phổ khối MS ............................................................................................38 3.5.3. Phổ NMR ................................................................................................38 3.5.4. Kết quả phân tích nhiệt trọng lượng .......................................................39 3.6. Xác định giới hạn tạp chất liên quan và hàm lượng sản phẩm. .....................40 3.6.1. Xác định tạp chất liên quan bằng TLC ...................................................40 3.6.2. Xác định tạp chất liên quan bằng HPLC .................................................40 3.6.3. Bước đầu xác định hàm lượng hàm lượng IBT ......................................43 3.7. Sử dụng sản phẩm để kiểm tra giới hạn tạp B trong nguyên liệu terazosintheo USP 37...................................................................................................................45 3.7.1. Điều kiện sắc ký ......................................................................................45 3.7.2. Chuẩn bị dung dịch .................................................................................45 Chương 4. BÀN LUẬN…………………………………………………….49 4.1. Tổng hợp ........................................................................................................49 4.2. Phân lập sản phẩm thô....................................................................................49 4.3. Khảo sát các hệ sắc ký đánh giá mức độ tạp chất của sản phẩm thô và hệ sắc ký tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột. ............................................................49 4.4. Tinh chế ..........................................................................................................50 4.5. Đánh giá độ tinh khiết củaIBT bằng TLC và xác định nhiệt độ nóng chảy ..50 4.6. Khẳng định cấu trúc của IBT tinh chế ...........................................................50 4.7. Về xác định giới hạn tạp chất liên quan và hàm lượng của IBT bằng phương pháp HPLC ............................................................................................................51 4.8. Về sử dụng sản phẩm tinh chế được kiểm tra giới hạn tạp chất B trong nguyên liệu terazosin.............................................................................................52 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………53 5.1. KẾT LUẬN ....................................................................................................53 5.2. KIẾN NGHỊ ...................................................................................................53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CRS (Chemical reference standard) : Chất chuẩn đối chiếu DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa HPLC (High-performance liquid : Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography) IBT (Impurity B of terazosin) : Tạp chất B của terazosin IR (Infranred) : Hồng ngoại MS (Mass spectrum) : Phổ khối lượng NMR (Nulear magnetic resonance) : Cộng hưởng từ hạt nhân PA (Pure analysis) : Tinh khiết phân tích RSD (Relative standard deviation) : Độ lệch chuẩn tương đối TLC (Thin layer chromatography) : Sắc ký lớp mỏng TB : Trung bình USP (United States Pharmacopoeia) : Dược điển Mỹ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường ....................................3 Bảng 1.2. Dãy chất phenol thơm được tổng hợptừ dẫn chất halogenid của vòng thơm...........................................................................................................................19 Bảng 3.2. Hiệu suấtcủa các phản ứng tổng hợp khi thay đổi tỷ lệ mol acid sulfuric ...................................................................................................................................25 Bảng3.3. Hiệu suấtcủa các phản ứng tổng hợp khi thay đổi tỷ lệ mol NaNO2 ........27 Bảng 3.4. Hiệu suất của các phản ứng tổng hợp khi thay đổi thời gian diazo hóa...28 Bảng 3.5. Hiệu suất của các phản ứng tổng hợp khi thay đổi nhiệt độ thủy phân ...30 Bảng 3.6. Hiệu suất của phản ứng tổng hợp khảo sát thời gian thủy phân ..............31 Bảng 3.7. Hiệu suấtcủa quá trình tổng hợp ..............................................................32 Bảng 3.8. Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm thô .....................................................33 Bảng 3.9. Hiệu suất tinh chế IBT thô và toàn bộ quá trình tổng hợp và tinh chế IBT ...................................................................................................................................35 Bảng 3.10. Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm đã tinh chế .......................................36 Bảng 3.11. Kết quả phổ IR của sản phẩm ................................................................37 Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của sản phẩm ......................................38 Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của sản phẩm .....................................39 Bảng 3.14. Kết quả phân tích nhiệt trọng lượng của sản phẩm ................................40 Bảng 3.15. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký.............................41 Bảng 3.16. Giá trị thời gian lưu của các pic sắc ký ..................................................41 Bảng 3.17. Giá trị độ phân giải giữa hai pic liền kề .................................................42 Bảng 3.18. Diện tích pic của các tạp chất trong IBT ................................................42 Bảng 3.19. Giới hạn các tạp chất trong IBT .............................................................43 Bảng 3.20. Kết quả xác định hàm lượng IBT tinh chế .............................................44 Bảng 3.21. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký .........................................46 Bảng 3.22. Giá trị thời gian lưu của các pic sắc ký ..................................................47 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin ................................................................2 Hình 1.2. Một vài biệt dược chứa terazosin ..............................................................3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của IBT ........................................................................4 Hình 3.1. Giai đoạn 1 phản ứng tổng hợp IBTdự kiến ...........................................24 Hình 3.2. Giai đoạn 2 phản ứng tổng hợp IBTdự kiến............................................24 Hình 3.4. Sắc ký đồ của phản ứng khảo sát tỷ lệ mol acid sulfuric ........................26 Hình 3.5. Sắc ký đồ của phản ứng khảo sát tỷ lệ mol natri nitrit .............................27 Hình 3.6. Sắc ký đồ của phản ứng khảo sát thời gian diazo hóa .............................29 Hình 3.7. Sắc ký đồ của phản ứng khảo sát nhiệt độ thủy phân..............................30 Hình 3.8. Sắc ký đồ của phản ứng khảo sát thời gian thủy phân ............................31 Hình 3.9. Sắc ký đồ khi đánh giá sản phẩm thô .......................................................33 Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát các phân đoạn tinh chế IBT qua cột ........................35 Hình 3.11. Sắc ký đồ sản phẩm tinh khiết ...............................................................37 Hình 3.12. Giản đồ nhiệt của sản phẩm tinh chế .....................................................39 Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng khi xác định hàm lượng IBT................................43 Hình 3.14. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếukhi xác định hàm lượng IBT .................44 Hình 3.15. Sắc ký đồ dung dịch thửkhi xác định hàm lượng IBT ..........................44 Hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu trắng khi kiểm tra giới hạn tạp B trong nguyên liệu terazosin ....................................................................................................................46 Hình 3.17. Sắc ký đồ dung dịch đối chiếukhi kiểm tra giới hạn tạp B trong nguyên liệu terazosin .............................................................................................................47 Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu terazosinkhi kiểm tra giới hạn tạp B trong nguyên liệu terazosin.................................................................................................47 ĐẶT VẤN ĐỀ Phì đại lành tính tuyến tiền liệt là một bệnh thường gặp ở đàn ông trung niên. Biện pháp phẫu thuật như mở tuyến tiền liệt đóng một vai trò quan trọng ở những bệnh nhân có triệu chứng. Tuy nhiên tỷ lệ phẫu thuật đã giảm kể từ khi thuốc chẹn kênh α-adrenergic và thuốc ức chế 5α-reductase trở nên phổ biến để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt [35], [40]. Một số nghiên cứu dịch tễ học đã đánh giá việc sử dụng thuốc chẹn kênh α-adrenergic trong điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và chứng minh rằng thuốc chẹn kênh α-adrenergic có khả năng giảm nhiều chi phí liên quan đến phẫu thuật [31], [34]. Thuốc chẹn kênh α-adrenergic terazosin hydroclorid được sử dụng rộng rãi cho bệnh nhân phì đại lành tính tuyến tiền liệt, đặc biệt là những người có kèm tăng huyết áp do thuốc làm giảm sự co thắt cơ trơn tuyến tiền liệt và làm giảm huyết áp [33]. Một trong những yếu tố ảnh hưởng tới hiệu quả điều trị bệnh chính là chất lượng của nguyên liệu làm thuốc và thành phẩm thuốc. Khi kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin, trong dược điển Mỹ quy định về giới hạn tạp chất B của terazosin. Tuy nhiên, hiện nay việc kiểm nghiệm ở nước ta còn gặp nhiều khó khăn do còn phụ thuộc vào nguồn tạp chất chuẩn nước ngoài với giá thành cao và thời gian đặt hàng lâu. Vì vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp tạp chất B của terazosin dùng trong kiểm nghiệm thuốc” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp tổng hợp và tinh chế tạp chất B của terazosin quy mô phòng thí nghiệm. 2. Xác định hàm ẩm, giới hạn tạp chất liên quan, bước đầu xác định hàm lượng của sản phẩm và sử dụng sản phẩm để xác định giới hạn tạp chất B trong nguyên liệu terazosin. 1 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Terazosin 1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin - Công thức phân tử: C19H25N5O4 - Phân tử lượng: 387,43 - Công thức cấu tạo: O N H3CO H3CO N N O N NH2 Hình 1.1.Công thức cấu tạo của terazosin - Tên khoa học: (RS)-6,7-dimethoxy-2-[4-(tetrahydrofuran-2-ylcarbonyl)piperazin-1yl]quinazolin-4-amin. - Tính chất: + Tinh thể màu trắng, không mùi, tan tốt trong methanol, nước, ít tan trong ethanol 96% và cloroform, không tan trong aceton và n-hexan. + Có khả năng hấp thụ UV và IR [42]. 1.1.2. Chỉ định của terazosin - Sử dụng đường uống để điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở người lớn. Có thể sử dụng cùng các thuốc lợi tiểu, thuốc điều trị tăng huyết áp khác hoặc sử dụng độc lập nếu các phác đồ điều trị không hiệu quả hoặc không phù hợp. Tác dụng hạ huyết áp hiệu quả nhất là trên huyết áp tâm trương. - Sử dụng để giảm triệu chứng trong phì đại lành tính tuyến tiền liệt [30], [32], [36], [38], [39], [41]. 1.1.3. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường Các thành phẩm chứa terazosin trên thị trường khá đa dạng về hãng sản xuất, dạng bào chế, hàm lượng hoạt chất (bảng 1.1 và hình 1.1). 2 Bảng 1.1. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường STT Biệt dược Hàm lượng Hãng sản xuất Nước sản xuất 1 Hytrin Abbott Ấn Độ 2 Vicard-T 2 mg Abbott Ấn Độ 3 Teraz 1 mg,2 mg, Unichem 5 mg Laboratories 4 Olyster 5 Teradip 1 mg 6 Terakare 2 mg 7 Teralfa 2 mg,5 mg 8 Terapress 2 mg 9 Unoter 2 mg, 5 mg Pharmacia India Ấn Độ 10 Terazosin 10mg Apotex Mỹ 1mg, 2 mg, 5 mg 1 mg, 2 mg, Zydus Alidac 5mg Glenmark Pharmaceuticals Medley Pharmaceuticals Torrent Pharmaceuticals Intas Pharmaceuticals Hình 1.2. Một vài biệt dược chứa terazosin 3 Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ Ấn Độ 1.2. Tạp chất B của terazosintheo USP 37 1.2.1. Một số thông tin chung về tạp chất B của terazosin - Công thức phân tử: C19H24N4O5 - Phân tử lượng: 388,42 - Công thức cấu tạo: O N H3CO N N O N H3CO OH Hình 1.3. Công thức cấu tạo của IBT - Tên khoa học: 1-(4-Hydroxy-6,7-dimethoxy-2-quinazolinyl)-4-[(tetrahydro-2furanyl)carbonyl]piperazin. 1.2.2. Quy định về giới hạn tạp chất B của terazosin trong nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin - Trong chuyên luận terazosin hydroclorid của USP 37, giới hạn tạp chất B trong terazosin hydroclorid là không quá 0,1% [42]. - Trong chuyên luận viên nén terazosin của USP 37, giới hạn tạp chất B trong viên nén terazosin là không quá 0,2 % [42]. 1.2.3. Phương pháp xác định tạp chất B trong nguyên liệu terazosin theo USP 37 - Pha động: hỗn hợp đệm citrat pH 3,2 và acetonitril (1685:315). - Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan một lượng chính xác khoảng 100,0 mg terazosin chuẩn trong bình định mức 200 ml bằng pha động, trộn đều. - Dung dịch chuẩn gốc (1): Hòa tan một lượng chính xác tạp chuẩn B của terazosin trong methanol để được nồng độ 0,5 mg/ml. - Dung dịch chuẩn: Pha loãng 5 ml dung dịch chuẩn gốc và 4 ml dung dịch chuẩn gốc(1) thành 100 ml bằng hỗn hợp nước:acetonitril:methanol (60:30:10), trộn đều. Pha loãng 10 ml dung dịch trên thành 100 ml bằng pha động. 4 - Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 125,0 mg chế phẩm trong 25,0 ml hỗn hợp nước:acetonitril (1:1). - Cột: L7 (25cm x 4,6 mm; 5 μm) - Nhiệt độ phân tích: 30°C - Thể tích tiêm: 20 µl - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Detector: UV 254 nm - Thời gian chạy: 60 phút - Yêu cầu giới hạn tạp chất B: Không quá 0,1% [43]. 1.3. Tổng quan về một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 1.3.1.1. Nguyên tắc Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh mà trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấp phụ được lựa chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha độngvới những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động. 1.3.1.2. Đại lượng đặc trưng - Hệ số lưu trữ Rf đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách di chuyển của pha động: 5 𝑅𝑓 = 𝑑𝑅 𝑑𝑀 Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích(cm). dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, cm). Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1. - Hệ số lưu trữ tương đối Rr: 𝑅𝑟 = 𝑑 𝑅,𝑋 𝑑 𝑅,𝐶 Trong đó: dR,X là đường đi của chất phân tích (cm) dR, C là đường đi của chất chuẩn (cm) Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất. 1.3.1.3. Ứng dụng - Định tính: Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện. - Thử tinh khiết: Mức độ tinh khiết của hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ. - Định lượng: Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký. Một là tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp và định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp. Hai là định lượng trực tiếp trên bản mỏng [2], [3], [4]. 1.3.1.4. Một số ví dụ về xác định tạp chất không định danh bằng TLC Ví dụ 1: Xác định tạp chất liên quan trong viên nén ibuprofen [3] - Bản mỏng: silicagel GF254. - Dung môi khai triển: n-hexan:ethyl acetat:acid acetic khan (15:5:1) - Dung dịch thử: Chiết một lượng bột viên tương ứng khoảng 0,250 g ibuprofen với cloroform, chiết 3 lần, mỗi lần 10,0 ml cloroform, bay hơi dịch chiết còn khoảng 1 ml, thêm cloroform cho vừa đủ 5,0 ml. 6 - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng cloroform. - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt 5 ml mỗi dung dịch trên lên bản mỏng. Sau khi triển khai xong sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí và phun dung dịch kali permanganat 1% trong acid sulfuric loãng, sấy bản mỏng ở nhiệt độ 120oC trong khoảng 20 phút. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại khả kiến ở bước sóng 365 nm. Bất kỳ vết phụ nào xuất hiện trên sắc ký đồ của dung dịch thử không được đậm màu hơn vết chính của dung dịch đối chiếu. Ví dụ 2: Xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu cloroquin phosphat [28] - Bản mỏng: silicagel GF254. - Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 0,50 g mẫu thử trong nước, pha loãng thành 10,0 ml bằng dung môi hòa tan. - Dung dịch đối chiếu (a): Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử tới 100,0 ml với nước. - Dung dịch đối chiếu (b): Pha loãng 5,0 ml dung dịch đối chiếu (a) tới 10,0 ml với nước. - Phát hiện vết bằng soi đèn UV 254 nm. - Cách đánh giá kết quả: Bất kỳ vết nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử, ngoài vết chính, không đậm hơn vết trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a) (1,0%) và không nhiều hơn một vết đậm hơn vết sắc ký trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (b) (0,5%). 1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1.3.2.1. Nguyên tắc Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng hấp phụ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ. 1.3.2.2. Một số đại lượng đặc trưng của quá trình sắc ký 7 - Thời gian lưu tR: Là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ đạt cực đại của nó. - Hệ số dung lượng k’: 𝑘 ′ = 𝑡 𝑅′ 𝑡0 = 𝑡 𝑅 −𝑡0 𝑡0 = 𝑡𝑅 𝑡0 − 1 - Hệ số chọn lọc α: 𝛼= 𝑘′ 𝐵 𝑘′ 𝐴 = 𝑡 𝑅,𝐵 −𝑡0 𝑡 𝑅,𝐴 −𝑡0 (k’B> k’A) α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất thường chọn α nằm trong khoảng 1,05 đến 2. - Hiệu lực cột: Hiệu lực cột được đánh giá thông qua số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả định như một pha tĩnh có chiều cao H. 𝑡 𝑁 = 16[ 𝑅]2 hay𝑁 = 5,54[ 𝑊 𝑡𝑅 2 ] hay 𝑊1⁄ 𝐻 = 2 𝐿 𝑁 Trong đó L là chiều cao cột sắc ký. W là chiều rộng đáy pic. W1/2là chiều rộng đo ở ½ chiều cao pic. - Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ. 𝐴𝐹 = 𝑊1/20 2𝑎 Trong đó: W1/20: Là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic. a: Là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2. Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối. - Độ phân giải : Đặc trưng cho mức độ tách 2 chất khác nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức : 8 𝑅𝑆 = 2(𝑡 𝑅,𝐵 − 𝑡 𝑅,𝐴 ) 1,18(𝑡 𝑅,𝐵 − 𝑡 𝑅,𝐴 ) √𝑁 𝛼 − 1 𝑘′ 𝐵 = = ( )( ) 𝑊 𝐵 + 𝑊𝐴 𝑊1/2𝐵 + 𝑊1/2𝐴 4 𝛼 1 + 𝑘′ 𝐵 Trong đó: RS= 1,5 : Hai pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3%. RS= 1,0: Hai pic chưa tách hẳn nhau còn xen phủ nhau 0,4%. RS= 0,75: Hai pic chưa tách nhau. 1.3.2.3. Ứng dụng - Định tính: Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử. - Định lượng: Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 3 phương pháp định lượng được sử dụng : + Phương pháp chuẩn ngoại: Hai dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thửđược tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn đã biết nồng độ sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử. + Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng diện tích (hoặc chiều cao) pic. + Phương pháp chuẩn hóa diện tích: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. - Xác định giới hạn tạp chất: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Do đó, có thể tính được giới hạn của từng tạp chất trong mẫu thử hoặc giới hạn tổng tạp chất trong mẫu thử [3], [4], [6], [9], [18]. 9 1.3.2.4. Một số ví dụ về xác định tạp chất không định danh bằng HPLC Ví dụ 1: Xác định tạp chất liên quan trong viên nén tenoxicam [3] - Pha động: 0,12 g natri dodecyl sulfat trong 700,0 ml methanol, trộn với 100,00 ml dung dịch KH2PO4 0,05 M và điều chỉnh đến pH 2,8 bằng H3PO4. - Dung dịch (1): Lượng bột viên chứa khoảng 0,1 g tenoxicam trong 100,0 ml acetonitril 50 %, hút 5,0 ml dung dịch trên pha loãng thành 200 ml với pha động. - Dung dịch (2): Pha loãng 1 ml dung dịch (1) thành 200,0 ml với pha động . - Điều kiện sắc ký + Cột: C8 (25 cm x 4 mm; 10 µm) + Detector: UV 254 nm + Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút - Cách đánh giá kết quả: Trong sắc ký đồ của dung dịch (1), không được có bất kỳ pic phụ nào có diện tích lớn hơn pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch (2) (0,5%) và tổng diện tích của các pic phụ đó không được lớn hơn bốn lần diện tích của pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch (2) (2%). Ví dụ 2: Xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu niclosamid monohydrat [42] - Pha động: acetonitril:KH2PO4 2 g/l:Na2HPO4 1 g/l:tetrabutylamoni hydrosulfat 2 g/l (1:1:1:1) - Dung dịch thử: Hòa tan chính xác khoảng 50,0 mg chế phẩm trong methanol, pha loãng tới 50,0 ml với methanol. - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng acetonitril. Pha loãng 1,0 ml dung dịch trên thành 20,0 ml với acetonitril. - Điều kiện sắc ký: + Cột: 12,5 cm x 4 mm; 5 μm + Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Detector: UV 230 nm + Thời gian chạy: gấp hai lần thời gian lưu của niclosamid - Cách đánh giá kết quả: 10
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan

thumb
Lv duong quy...
95
1486
67

Tài liệu vừa đăng

Tài liệu xem nhiều nhất