Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp tạp chất a của terazosin dùng trong kiểm nghiệm

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ------ TRỊNH VĂN MẠNH Mã sinh viên: 1201375 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI -----  ------ TRỊNH VĂN MẠNH Mã sinh viên: 1201375 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP TẠP CHẤT A CỦA TERAZOSIN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dƣợc HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian nghiên cứu, tìm hiểu và thực hiện đề tài với rất nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Với lòng biết sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Đỗ Thị Thanh Thủy giảng viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược, Bộ môn Hóa Lý - trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin được cảm ơn các anh chị, các bạn và các em trong nhóm nghiên cứu kiểm nghiệm và tổng hợp tại bộ môn Hóa Dược đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, bố mẹ, các anh chị, bạn bè đã quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Trịnh Văn Mạnh MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Terazosin 2 1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin 2 1.1.2. Chỉ định 2 1.1.3. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường 3 1.2. Tạp chất A của terazosin theo USP 37 3 1.2.1. Thông tin chung về tạp chất A của terazosin 3 1.2.2. Nguyên nhân phát sinh tạp A 4 1.2.3. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin 4 1.3. Một số phương pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 6 1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 6 1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8 1.3.3. Phương pháp sắc ký cột 11 1.3.4. Phương pháp đo phổ hồng ngoại (IR) 12 1.3.5. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 13 1.3.6. Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 13 1.3.7. Phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) 14 1.4. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới 15 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15 1.4.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 17 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Nguyên liệu 18 2.2. Thiết bị 18 2.3. Nội dung nghiên cứu 19 2.4. Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1. Tổng hợp tạp chất A của terazosin 19 2.4.2. Tinh chế sản phẩm thô 20 2.4.3. Khẳng định cấu trúc của sản phẩm 21 2.4.4. Xác định giới hạn tạp chất 21 2.4.5. Xác định hàm ẩm của sản phẩm 22 2.4.6. Xác định hàm lượng sản phẩm 22 2.4.7. Xác định giới hạn tạp chất A trong nguyên liệu terazosin bằng phương pháp HPLC theo USP 37 22 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tổng hợp tạp chất A của terazosin 23 23 3.1.1. Khảo sát lựa chọn dung môi phản ứng 24 3.1.2. Khảo sát nhiệt độ phản ứng 24 3.1.3. Khảo sát tỷ lệ mol phản ứng 25 3.1.4. Khảo sát thời gian phản ứng 26 3.1.5. Quy trình tổng hợp tạp A của terazosin 27 3.1.6. Kiểm tra độ tinh khiết của IAT thô 28 3.1.7. Tinh chế tạp A của terazosin 29 3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và nhiệt độ nóng chảy 30 3.2.1. Xác định nhiệt độ nóng chảy 30 3.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC 31 3.3. Khẳng định cấu trúc sản phẩm 32 3.3.1. Định tính HCl kết hợp 32 3.3.2. Đo phổ IR của sản phẩm tạp A 32 3.3.3. Đo phổ khối của sản phẩm tạp A 33 3.3.4. Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm tạp A 33 3.4. Xác định hàm ẩm sản phẩm 35 3.5. Xác định giới hạn tạp chất sản phẩm tạp A 35 3.5.1. Xác định giới hạn tạp chất trong sản phẩm IAT bằng TLC 35 3.5.2. Xác định giới hạn tạp chất của sản phẩm IAT bằng phương pháp HPLC 36 3.6. Xác định hàm lượng sản phẩm 39 3.6.1. Xác định hàm lượng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích 39 3.6.2. Xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC 40 3.7. Sử dụng sản phẩm thu được làm chất đối chiếu để xác định giới hạn tạp chất A trong nguyên liệu terazosin bằng phương pháp HPLC theo USP 37 41 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 45 4.1. Quy trình tổng hợp 45 4.2. Quy trình tinh chế 46 4.3. Khẳng định cấu trúc của IAT tinh chế được 46 4.4. Xác định giới hạn tạp chất trong sản phẩm 47 4.5. Xác định hàm lượng sản phẩm 47 4.6. Sử dụng IAT làm chất chuẩn trong phòng thí nghiệm để xác định tạp chất trong terasosin 48 4.7. Tính mới và hiệu quả kinh tế CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 49 5.1. Kết luận 49 5.2. Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tiếng Anh PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACDQ BuOH :4-Amino-2-cloro-6,7dimethoxyquinazolin : n-Butanol CTCT CTPT : Công thức cấu tạo : Công thức phân tử DMF DMSO : N,N- Dimethylformamid : Dimethyl sulfoxid DCM IAM GC (Gas chromatography) : Diclomethan : Isoamyl ancol : Sắc ký khí HPLC (High performance liquid : Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography) HSQC (Heteronuclear multiple quantum correlation) IR (Infrared) IAT : Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết : Hồng ngoại : Impurity A of terazosin KTCL : iểm tra chất lượng MeCN MeOH MS (Mass spectrum) NMR (Nuclear magnetic resonance) PA (Pure analysis) RSD (Relative standard deviation) TB TEZ TLC TLTK TGA USP (United State pharmacopoeia) : Acetonitril : Methanol : Phổ khối lượng : Cộng hưởng từ hạt nhân : Tinh khiết phân tích : Độ lệch chuẩn tương đối : Trung bình : Terazosin : Sắc ký lớp mỏng : Tài liệu tham khảo : Phân tích nhiệt trọng lượng : Dược điển Mỹ DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin 2 Hình 1.2. Một số biệt dược của terazosin 3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin 4 Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp A của terazosin 4 Hình 1.5. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 1 15 Hình 1.6. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 2 16 Hình 1.7. Sơ đồ quy trình phản ứng theo phương pháp 3 16 Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp tạp A của terazosin 20 Hình 3.1. Nguyên tắc tổng hợp tạp A của terazosin 23 Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ mol phản ứng 26 Hình 3.3. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của IAT thô 29 Hình 3.4. Sắc ký đồ phân đoạn của quá trình tinh chế cột 30 Hình 3.5. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của IAT 31 Hình 3.6. Phổ HSQC của IAT 34 Hình 3.7. Giản đồ nhiệt TGA của IAT 35 Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu trắng 37 Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu thử IAT 37 Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu IAT 37 Hình 3.11. Sắc ký đồ mẫu trắng xác định giới hạn tạp chất A trong terazosin Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu xác định giới hạn tạp chất A trong terazosin Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu nguyên liệu terazosin 42 43 43 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường 3 Bảng 1.2. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin 5 Bảng 1.3. Danh sách một số công ty có thiết lập tạp chuẩn A 16 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi phản ứng 24 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng 25 Bảng 3.3. Hiệu suất phản ứng khi khảo sát các tỷ lệ mol phản ứng 25 Bảng 3.4. Hiệu suất phản ứng khi khảo sát thời gian tổng hợp 26 Bảng 3.5. Kết quả xác định hiệu suất tổng hợp sản phẩm thô 28 Bảng 3.6. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của IAT thô 28 Bảng 3.7. Bảng kết quả hiệu suất tinh chế và toàn bộ quá trình tổng hợp 30 Bảng 3.8. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy IAT tinh khiết 31 Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của IAT 32 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H-NMR 33 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 13C-NMR 34 Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm ẩm của IAT 35 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký Bảng 3.14. Một số các thông số của các pic tạp trên sắc ký đồ khi xác định giới hạn tạp chất của IAT bằng HPLC 36 Bảng 3.15. Kết quả xác định giới hạn tạp chất trong IAT bằng HPLC 39 Bảng 3.16. Kết quả xác định hàm lượng sản phẩm bằng chuẩn độ thể tích 40 Bảng 3.17. Kết quả xác định hàm lượng IAT bằng phương HPLC 40 Bảng 3.18. Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký 42 Bảng 3.19. Kết quả xác định giới hạn tạp chất A trong nguyên liệu terazosin 43 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, cùng với các bệnh khác, các bệnh tuổi già ở nam giới như phì đại lành tính tiền liệt tuyến và tăng huyết áp là vấn đề mà các nhà khoa học trong và ngoài nước đang quan tâm. Theo thống kê phì đại lành tính tiền liệt tuyến ảnh hưởng đến 50-90% số nam giới độ tuổi từ 50-85 tuổi [12], [30], [33]. Terazosin là một trong những thuốc thuộc nhóm chẹn thụ thể α1-adrenergic đóng vai trò quan trọng trong chữa bệnh tuổi già ở nam giới với hai tác dụng dược lí cơ bản là điều trị phì đại lành tính tiền liệt tuyến và tăng huyết áp [9], [14], [37]. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm thuốc là yêu cầu bắt buộc để đảm bảo chất lượng thuốc. Khi tiến hành kiểm tra chất lượng nguyên liệu terazosin hydroclorid cũng như các thành phẩm chứa terazosin hydroclorid, các dược điển đều quy định phải xác định giới hạn tạp chất A của terazosin [18], [22], [34], [35]. Trong quá trình xác định chỉ tiêu này phải sử dụng các dung dịch tạp chuẩn A của terazosin hydroclorid. Nhưng tạp chuẩn này hiện chưa có sẵn tại Việt Nam, mà phải đặt mua ở nước ngoài với giá thành cao và thời gian đặt hàng khá lâu. Do đó, công tác kiểm tra chất lương nguyên liệu và thành phẩm chứa terazosin hydroclorid tại Việt Nam gặp nhiều khó khăn. Nhận thấy được những khó khăn đó chúng tôi tiến hành tổng hợp và tinh chế tạp A của terazosin, để tiến tới thiết lập tạp chuẩn A của terazosin, góp phần chủ động trong công tác kiểm tra chất lượng thuốc. Đề tài “Nghiên cứu tổng hợp tạp chất A của terazosin dùng trong kiểm nghiệm” được thực hiện với 2 mục tiêu cơ bản: [16 1. Nghiên cứu được phương pháp tổng hợp và tinh chế tạp chất A của terazosin quy mô phòng thí nghiệm. 2. Xác định giới hạn tạp chất, độ ẩm, bước đầu hàm lượng sản phẩm và ứng dụng trong kiểm nghiệm nguyên liệu terazosin. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Terazosin 1.1.1. Một số thông tin chung về terazosin - CTPT: C19H25N5O4. - Phân tử lượng: 387,43. - CTCT: hình 1.1. Hình 1.1. Công thức cấu tạo của terazosin - Tên khoa học: (RS)-6,7-dimethoxy-2-[4-(tetrahydrofuran-2ylcarbonyl) piperazin-1-yl]quinazolin-4-amin. - Dạng dược dụng của terazosin được sử dụng là terazosin hydrochlorid ngậm hai phân tử nước (TEZ.HCl.2H2O). - Tính chất: tinh thể màu trắng, không mùi, tan tốt trong methanol, nước, ít tan trong ethanol 96% và cloroform, không tan trong aceton và n-hexan, có khả năng hấp thụ UV và IR [5]. 1.1.2. Chỉ định - Sử dụng đường uống để điều trị tăng huyết áp vừa và nhẹ ở người lớn [19], [20]. Terazosin được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ phê duyệt để sử dụng điều trị tăng huyết áp năm 1987 [33]. Có thể sử dụng terazosin cùng các thuốc lợi tiểu hay các thuốc điều trị tăng huyết áp khác hoặc sử dụng độc lập nếu các phác đồ khác không hiệu quả hoặc không phù hợp. Tác dụng hạ huyết áp hiệu quả nhất trên huyết áp tâm trương [30]. - Sử dụng để giảm triệu chứng trong phì đại lành tính tiền liệt tuyến [14], [17], [23], [24], [27], [31]. 2 1.1.3. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường Terazosin là một thuốc được sử dụng rộng rãi ở các nước Asean và trên thế giới. Với tác dụng điều trị tốt, terazosin được biết đến với nhiều biệt dược khác nhau nhưng chủ yếu là sử dụng đường uống dạng viên nén hoặc viên nang với hàm lượng 1, 2, 5 và 10 mg. Bảng 1.1. Một số thành phẩm chứa terazosin trên thị trường STT Biệt dược Hàm lượng (mg) Công ty 1 Hytrin 1, 2, 5, 10 Abbott 2 Terazosin 2, 5 Accord Healthcare Limited 3 Vicard-T 2 Abbott 4 Teradip 1 Glenmark Pharmaceuticals 5 Apo-Terazosin 2,10 Apotex 6 Terazosin hydrochlorid 2 Geneva Pharmaceuticals Hình 1.2. Một số biệt dược của terazosin 1.2. Tạp chất A của terazosin theo USP 37 1.2.1. Thông tin chung về tạp chất A của terazosin - CTPT: C14H19N5O2. 2HCl. - Phân tử lượng: 362,25. - CTCT: hình 1.3. 3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo tạp chất A của terazosin - Tên khoa học: 6,7-dimethoxy-2-(piperazin-1-yl)quinazolin-4-amin dihydrochlorid. 1.2.2. Nguyên nhân phát sinh tạp A Do ảnh hưởng của điều kiện môi trường, terazosin bị phân hủy tạo tạp chất A của nó [16], [28]: Hình 1.4. Sơ đồ phát sinh tạp A của terazosin 1.2.3. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin Xác định chỉ tiêu tạp chất liên quan của terazosin có thể sử dụng các phương pháp sau (bảng 1.2): 4 Bảng 1.2. Các phương pháp xác định giới hạn tạp chất A của terazosin Phương pháp Điều kiện sắc ký Tài liệu tham khảo - Silica gel 60 F254. TLC - Pha động: cloroform:toluen:methanol (9:1:6). [22], [38] - Phát hiện bằng UV hoặc phun KI. - Cột Zorbax Rx C8 (15 cm x 4,6 mm; 5 μm) hoặc cột μ-Bondapak C18 (30 cm x 3,9 mm; 10 μm) hoặc cột Bakerbond C18 (15 cm x 4,6 mm; 5 μm). - Pha động: acetonitril:isopropanol:đệm citrat 0,05 M [18], [38] (175:50:1775). - Tốc độ dòng: 2,0 ml/phút. - Detector UV 254 nm. - Cột C18 (25 cm x 4,6 mm; 5 µm). - Pha động: nước:acetonitril:methanol:acid acetic băng:diethylamin (25:35:40:1:0,017). HPLC [38], [42] - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Detector UV 254 nm. - Cột C18 (25 cm x 4,0 mm; 5 µm). - Pha động: đệm natri laurysulfat:acetonitril (600:400). [23], [38] - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Detector UV 210 nm. - C18 (25 cm x 4,6 mm; 5 µm). - Pha động: đệm citrat pH 3,2:acetonitril (1685:315). [38], [41] - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Detector UV 254 nm. 5 1.3. Một số phƣơng pháp hóa lý sử dụng trong nghiên cứu đề tài 1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 1.3.1.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp thụ làm pha tĩnh trải thành lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận. Trong quá trinh di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả thu được là một sắc ký đồ trên lớp mỏng [1], [3], [4]. 1.3.1.2. Ứng dụng của phương pháp sắc ký lớp mỏng Định tính: Thường dựa trên giá trị Rf của chất phân tích và chất chuẩn khui chấm trên cùng một sắc ký đồ. Thử tinh khiết: Xác định giới hạn tạp chất trong thành phẩm và nguyên liệu thuốc. Định lượng: Có hai cách - Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng các chất bằng một kĩ thuật thích hợp (phổ hấp thụ, huỳnh quang…). - Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký bằng Densitometer hoặc xử lí ảnh với camera kĩ thuật số [3], [4]. 1.3.1.3. Đại lượng đặc trưng của phương pháp sắc ký lớp mỏng Hệ số lưu trữ Rf: Đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích. Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1 (tối ưu 0,2-0,8) [3]. Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm). dM là khoảng cách từ điểm cuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm). 6 1.3.1.4. Một số ví dụ về xác định giới hạn tạp chất không định danh trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc bằng phương pháp TLC Một trong những ứng dụng của TLC hay được sử dụng trong các dược điển là xác định giới hạn tạp chất trong thành phẩm và nguyên liệu làm thuốc. Ví dụ 1. Xác định giới hạn tạp chất trong viên nén acid mefenamic [3]. - Bản mỏng: silica gel 60 F254. - Dung môi khai triển: acid acetic băng:1,4-dioxan:toluen (1:25:90). - Dung dịch (1): Dung dịch bột viên nồng độ 25 mg/ml trong hỗn hợp dicloromethan:methanol (3:1). - Dung dịch (2): Lấy 0,1 ml dung dịch thử (1) pha loãng thành 50 ml bằng hỗn hợp dicloromethan: methanol (3:1). - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 l mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai, đặt bản mỏng vào bình thủy tinh kín chứa hơi iod trong 5 phút và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. - Đánh giá kết quả: Bất kỳ vết phụ nào trong sắc ký đồ thu được của dung dịch (1) không được đậm hơn vết chính trong sắc ký đồ của dung dịch (2) (0,2%). Ví dụ 2. Xác định giới hạn tạp chất trong nguyên liệu nicotinamid [34]. - Bản mỏng: silica gel 60 F254. - Dung môi khai triển: nước:ethanol:cloroform (5:45:48). - Dung dịch thử: Dung dịch 0,4 g chế phẩm trong 5,0 ml hỗn hợp dung môi nước: ethanol (50:50). - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 0,5 ml dung dịch thử thành 200 ml bằng hỗn hợp nước: ethanol (50:50). - Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 5 l mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. - Đánh giá kết quả: Bất kỳ vết phụ nào trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử không được đậm hơn vết chính trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,25%). 7 1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1.3.2.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC HPLC là một kĩ thuật tách các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha tĩnh chưa trong cột. Quá trình sắc ký được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ. Tùy theo bản chất của chất phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Hiện nay có nhiều loại detector như: UV-VIS, huỳnh quang, tán xạ bay hơi, độ dẫn, MS… nhưng sử dụng nhiều nhất vẫn là detector UV-VIS [1], [3], [4]. 1.3.2.2. Ứng dụng của phương pháp HPLC Định tính: Có thể sử dụng 2 cách - Cách 1: Dựa vào sự giống nhau của thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử. - Cách 2: Trên các máy HPLC có detector với DAD (diod array detector) có thể vẽ phổ UV-VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng 2 phổ lên nhau và đánh giá tương đồng thông qua hệ số Match. Định lượng: Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó trên sắc ký đồ. [31] Xác định giới hạn tạp chất: - Với các tạp chất định danh: Xác định giới hạn tạp chất của thuốc hay nguyên liệu dựa trên tạp chuẩn. - Với các tạp chất không định danh: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic trên sắc ký đồ [3]... 1.3.2.3. Các đại lượng đặc trưng trong HPLC - Thời gian lưu (tR) - Hệ số dung lượng k’ 8 - Hệ số chọ lọc α - Hiệu lực cột - Hệ số bất đối AF - Độ phân giải 1.3.2.4. Các kỹ thuật định lượng bằng HPLC Phương pháp chuẩn ngoại (external standard method): Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ. Phương pháp chuẩn nội (internal standard method): Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội. Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation): Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Phương pháp này có thể áp dụng để định lượng, ngoài ra phương pháp còn sử dụng để xác định tạp chất liên quan: tính phần trăm tạp dựa vào tạp chuẩn, hoặc đối với phép thử tạp chất liên quan khi không biết tên tạp chất hoặc không có tạp chuẩn thì có thể tính phần trăm tạp chất dựa vào phần trăm diện tích pic của tạp đó so với tổng diện tích các pic (gồm các pic tạp và pic chính) [1], [3]. 1.3.2.5. Một số ví dụ về xác định giới hạn tạp chất không định danh trong nguyên liệu và thành phẩm thuốc bằng phương pháp HPLC Trong một số chuyên luận của các dược điển quy định cách thử giới hạn tạp chất không định danh trong thành phẩm thuốc và nguyên liệu bằng phương pháp HPLC như sau: Ví dụ 1: Xác định giới hạn tạp chất trong viên nén roxithromycin [3] Các dung dịch sắc ký: - Dung dịch thử: dung dịch bột viên nồng độ 2 mg/ml. 9 - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử bằng pha động đến vừa đủ 100 ml. Điều kiện sắc ký: - Pha động: acetonitril:đệm phosphat (315:710). - Cột: thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm, 5 μm). - Phát hiện: Detector UV 205 nm. - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Cách tiến hành và đánh giá kết quả: - Tiến hành sắc ký trong khoảng thời gian gấp 4 lần thời gian lưu của pic roxithromycin. - Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, diện tích của bất kỳ pic phụ nào cũng không được lớn hơn 2,5 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Ví dụ 2: Xác định giới hạn tạp chất trong nguyên liệu niclosamid [18], [34]. Các dung dịch sắc ký: - Dung dịch thử: dung dịch chế phẩm nồng độ 1 mg/ml trong methanol. - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 2000 lần 1 ml dung dịch thử với acetonitril. Điều kiện sắc ký: - Pha động: acetonitril:đệm phosphat (50:50). - Cột: Thép không gỉ (12,5 cm x 4 mm, 5 μm). - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Phát hiện: Detector UV 230 nm. Đánh giá kết quả: Trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, tổng các diện tích của các pic, ngoài pic tương ứng niclosamid và pic dung môi, không lớn hơn bốn lần diện tích pic chính trên sắc ký đồ thu được dung dịch đối chiếu (0,2%). Ví dụ 3: Xác định giới hạn tạp chất trong nguyên liệu oxybuprocain hydroclorid [40] Các dung dịch sắc ký: - Dung dịch thử: Dung dịch chế phẩm 0,4 mg/ml trong pha động. 10 - Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 400 lần 1,0 ml dung dịch thử với MeCN. Điều kiện sắc ký: - Pha động: MeCN:đệm pH 2,5 (25:75). - Cột: thép không gỉ (15 cm x 3,9 mm, 5 μm). - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Phát hiện: Detector UV 309 nm. Cách tiến hành và đánh giá kết quả: - Tiến hành sắc ký khoảng thời gian gấp 4 lần thời gian lưu của pic oxybuprocain hydroclorid. - Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, diện tích của bất kỳ pic phụ nào cũng không được lớn hơn 0,4 lần diện tích của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (0,1%) và tổng diện tích các pic không lớn diện tích pic chính của dung dịch đối chiếu (0,25%). 1.3.2.6. Một số ví dụ xác định hàm lượng sản phẩm bằng phương pháp HPLC sử dụng cách tính theo chuẩn hóa diện tích. Trong một số đề tài khoa học, luận văn khi không có sẵn chất chuẩn, các chất được định lượng bằng HPLC theo phương pháp chuẩn hóa diện tích. - Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc [7]. - Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế kaempferol từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc [7]. - Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc [7]. - Bước đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid. 1.3.3. Phương pháp sắc ký cột 1.3.3.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký cột Sắc ký cột là phương pháp mà chất nhồi (pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố) được nhồi vào cột, dùng để phân chia các chất trong hỗn hợp và tinh chế các chất. Các chất được tách ra dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha 11