Tài liệu Nghiên cứu tổng hợp Carbocystein.

Bộ Y T Ế TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM THỊ HIÈN NGHIÊN CỨU TỎNG HỢP CARBOCYSTEIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng dẫn: Ds. Đào Nguyệt Sương Huyền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường hoc Dươc H à N ôi o Đai • • • • HÀ N Ộ I-2011 LỜI CẢM OiN Sau một thời gian làm việc khẩn trương được sự giúp đỡ tận tình của các thày cô giáo, gia đình cùng bạn bè, tôi đã hoàn thành Khóa luận tốt nghiệp “Nghiên cứu tổng hợp Carbocystein”. Với tất cả sự kính trọng, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thày giáo PGS. TS Nguyễn Đình Luyện đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi nghiên cứu thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo DS. Đào Nguyệt Sương Huyền, thày giáo TS Nsuyễn Văn Hân, DS. Nguyễn Văn Hải, DS. Nguyễn Văn Giang và thày Phan Tiến Thành của Tổ môn Tổng hợp Hóa dược - Bộ môn Công nghiệp dược đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận vừa qua. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thày cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dược, cũng như các thày cô trong trưòng Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt năm năm học. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đặc biệt là bố mẹ tôi và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện đề tài Khóa luận tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Phạm Thị Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIÉT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ ĐẶT VẤN ĐÈ.............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về Carbocysteỉn.............................................................................. 2 1.1.1. Cấu trúc hỏa học và tỉnh chất lý hóa............................................................. 2 1.1.2. Tác dụng dược lý.............................................................................................5 ỉ. 1.3. Tổng quan về các phương pháp tổng hợp Carbocystein................................5 1.2. Tổng quan về L-cystin......................................................................................10 1.2.1. Cẩu trúc hỏa học...........................................................................................10 1.2.2. Tính chất....................................................................................................... 11 1.2.3. Phương pháp điều chế.................................................................................. 11 1.3. Tổng quan về L-cystein.................................................................................... 11 1.3.1. Cẩu trúc hóa học........................................................................................... 11 1.3.2. Tỉnh chất.......................................................................................................12 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ ư .....................14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết b ị...............................................................................14 2 . 1 . 1 .Nguyên 2.1.2. liệu và hóa chẩt nghiên cứu...............................................................14 Thiết bị, mảy móc và dụng cụ nghiên cứu.......................................... 15 2.2. Nội dung nghiên cứu.........................................................................................15 2.2.1. Khảo sát một sổ yếu tổ ảnh hưởng đến tổng hợp Carbocysteỉn đi từ hai nguyên liệu L-cystin và L-cystein................................................................................15 2.2.2. Xác định cẩu trúc và kiểm tra độ tỉnh khiết của sản phẩm thu được............16 2.2.3. Kiểm nghiệm Carbocysteỉn theo một số tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009... 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................16 2.3.1. Tổng hợp hóa học......................................................................................... 16 2 .3.2 .Kiểm tra độ tinh khiết..................................................................................... 16 2 .3.3.Xác định cấu trúc sản phẩm.......................................................................... 17 2.3.4. Phương pháp khác...................................................................................17 CHƯƠNG 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN............................. 18 3.1. Thực nghiệm và kết quả................................................................................... 18 3.1.1. Tổng hợp Carbocystein từL-cystein hydroclorid monohydrat.................... 18 3.1.2. Tổng hợp Carbocystein từL-cystin...............................................................23 3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm..............................................................30 3.3. Kết quả phân tích phổ của sản phẩmCarbocystein....................................... 31 3.2.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại................................................................ 31 3.2.2. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( ’H- NMR)............32 3.4. Kiểm nghiệm sản phẩm thu được theo một số tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009............................................................................................................................32 3.4.1. Định tính Carbocystein theo một số tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009........32 3.4.2. Định lượng Carbocystein theo tiêu chuẩn Dược điển Anh 2009..................33 3.5. Bàn luận.............................................................................................................35 3.5. ỉ. Tổng hợp Carbocystein từ L-cystein hydroclorỉd monohydrat....................35 3.5.2. Tổng hợp Carbocysteỉn từ L-cystỉn...............................................................37 CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ.........................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT CMC g h KL L-CHM MCA ml NMR IR SKLM rc TB THF Carbocystein gam giờ Khối lượng L-cystein hydroclorid monohydrat Acid monocloacetic mililit Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy) Phổ hồns nsoại (Inữared spectroscopy) Sắc ký ỉớp mỏng Nhiệt độ Trung bình Tetrahydrofuran DANH MỤC CÁC BẢNG • Bảng 2.1 : Nguyên liệu và hóa chất nghiên cửu.......................................................14 Bảng 2.2: Thiết bị, máy móc và dụng cụ nghiên cửu.............................................. 15 Bảng 3.1: Bảng ký hiệu và yêu cầu của các biến đầu vào.......................................19 Bảng 3.2; Bảng ký hiệu và mục tiêu biến đầu ra..................................................... 19 Bảng 3.3: Bảng thiết kế thí nghiệm phản ứng.........................................................19 Bảng 3.4: Kết quả các thí nghiệm............................................................................ 20 Bảng 3.5: Công thức tối ưu cho quy trình tổng hợp Carbocystein từ L-cystein..... 23 Bảng 3.6: Bảng kết quả phản ứng theo công thức tối ưu........................................... 23 Bảng 3.7: Bảng biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưỏng của các loại dung môi tới hiệu suất tạo CM C...........................................................................................................26 Bảng 3.8: Bảng biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất phản ứng alkyl hóa...................................................................................27 Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng alkyl hóa............................................................................................................28 BảngS.lO: Kết quả khảo sát ảnh hưcmg của tỷ lệ mol L-cystin và acid monocloacetic đến hiệu suất tạo Carbocystein........................................................29 Bảng 3.11: Các thông số tốt nhất cho quy trình phản ứng tổng hợp CMC............... 30 Bảng 3.12: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm CMC....................................... 31 Bảng 3.13; Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của CMC tổng họrp được.................. 31 Bảng 3.14: Kết quả phân tích phổ 'H- NMR của CMC tổng hợp được.................... 32 Bảng 3.15: Kết quả định tính CMC theo một số tiêu chuẩn BP 2009....................... 33 Bảng 3.16: Kết quả chuẩn độ lại dung dịch acid HCIO4 0,1M..................................34 Bảng 3.17; Kết quả định lượng CMC........................................................................34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐÒ THỊ Hình 3.1: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa L-CHM và MCA, thời gian phản ứng alkyl hóa đến hiệu suất tạo CMC..................................................... 20 Hình 3.2: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưcmg của tỷ lệ mol giữa L-CHM và MCA, nhiệt độ phản ứng alkyl hóa đến hiệu suất tạo CMC..........................................................2 1 Hình 3.3: Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của thời gian phản ứng và nhiệt độ phản ứng alkyl hóa đến hiệu suất tạo CMC......................................................................21 Hình 3.4: Sơ đồ quy trình tổng hợp CMC từ L-cystin............................................. 25 Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất phản ứng tạo CM C.................................................................................... 27 Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng tạo CM C.................................................................................... 28 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol L-cystin và MCA đến hiệu suất phản ứng tạo CM C................................................................... 30 ĐẶT VẤN ĐÈ Việt Nam là một nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm. Do vậy bệnh đường hô hấp là một trong những bệnh phổ biến nhất hiện nay. Các bệnh hô hấp thường gặp bao gồm: viêm phế quản cấp, viêm phổi do các loại vi khuẩn, virus; hen phế quản, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, tràn dịch màng phổi, lao phổi, ung thư phổi... Các bệnh này chiếm khoảng 80% số các bệnh lý hô hấp, bên cạnh đó, còn nhiều bệnh hô hấp khác, tuy nhiên chỉ chiếm tỷ lệ ít hơn như: giãn phế quản, viêm phổi kẽ, bụi phổi, các biểu hiện phổi trong các bệnh hệ thống, nội tiết, cơ xưong khớp, thận [3]... Có rất nhiều loại thuốc được sử dụng để điều trị các bệnh đường hô hấp, trong đó Carbocystein được dùng rất phổ biến. Carbocystein có tác dụng làm lỏng dịch nhầy đường hô hấp, được dùng trong các trường hợp rối loạn hô hấp, đặc biệt liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ nhầy nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mạn tính, giãn phế quản, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng. Điều trị hỗ trợ trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật [4, 16, 17, 20]. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh được Carbocystein có tác dụng đáng kể trong việc điều trị bệnh nghẽn phổi mãn tính (chronic obstructive pulmonary disease- (COPD)) [11, 12] và trong việc ức chế sự lây nhiễm virus cúm A [24]. Tuy nhiên, trên thị thưòng Việt Nam các biệt dược chứa Carbocystein đều có nguồn gốc nhập khẩu và chưa đon vị nào tổng họp đươc nguyên liệu này. Do vậy giá thành các thành phẩm chứa carbocystein còn rất cao. Để góp phần nghiên cứu tổng hợp nguyên liệu làm thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài ""Nghiên cứu tỏng hợp Carbocysteỉtỉ'. Với muc tiêu nghiên cứu sau: ^ Tổng hợp được Carbocystein từ hai nguồn nguyên liệu ban đầu là L-cystin và L-cystein có hàm lượng đạt tiêu chuẩn BP 2009. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp Carbocystein. CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 1.1. Tổng quan về Carbocystein (CMC) 1.1.1. Cấu trúc hóa hoc và tính chất lý hỏa a. Cấu trúc hóa hoc [2 1 . 23] HO. 'OH Công thức phân tử: C5H9NO4S Phân tử lượng: 179,19. Thành phần: 33,51% C; 5,06% H; 7,82% N; 35,71% O; 17,89% s. Danh pháp quốc tể (International Nonproprietary Name- INN): Carbocisteine Danh pháp Hóa học theo Hiệp hội Hóa học Quốc tế (International Union of Pure and Applied Chemistry Nomenclature- (carboxymethylsulfanyl) propanoic acid Tên khác: S-Carboxymethyl-L-cystein Acid (R)-2-amino-4-thia-adipic Acid L -2-Amino-3-(carboxymethylthio) propionic 3-(Carboxymethylthio)- L -alanin L -3-((Carboxymethyl)thio)alanin L -Carboxymethylcystein ( R )-Carbocistein Carbocystein b. Tính chat Iv hóa Tính chất vật lý [21]; • Bột kết tinh hay tinh thể hình đĩa, không màu lUPAC): (R)-2-Amino-3- • Tan trong nước sôi, không tan trong nước lạnh và không tan trong các các chất hữu cơ thông thường (ethanol, methanol, aceton...) - • Độ quay cực riêng: [a]o°= 0,5 trong dung dịch HCl IN • Nhiệt độ nóng chảy; 204- 207°c. Tính chất hóa học [12]: • CMC có cấu trúc của một a-amino acid, CMC có chứa nhóm -COOH và NH2 nên có các phản ứng đặc trưng cho các nhóm amin và carboxylnhư phản ứng acetyl hóa, phản ứng fomiyl hóa hay este hóa. + Phản ứng vói Ninhydrin: Nguyên tắc: Ninhvdrin là chất oxy hóa mạnh, khi đun nóng có khả năng khử nhóm amin và nhóm carboxyl của a-amino acid tạo ninhydrin khử, CO2, NH3 và aldehyd. Sau đó ninhydrin và ninhydrin khử lại phản ứng tiếp với NH3 tự do tạo thành phức hợp màu tím, có độ hấp thụ cực đại ở Ằ,= 570nm. Cường độ màu phụ thuộc vào nồng độ của acid amin. o COOH o C H NH, Ninhydrin Aminoacid R H2O + N H 3 + CO 2 + R- CHO + Phản ứng với FIuorescamin: Nguyên tắc: Tạo sản phẩm huỳnh quang với a-amin của acid amin, đây là phản ứng rất nhạy cho phép phát hiện acid amin tới hàng ngàn nano gram. H H I ,+ -cH----N H Pluorescamin R Acid amin Dan xuất huỳnh quang + Phản ứng Biuret: Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm các liên kết peptid trong protein kết họp với ion tạo phức họp màu tím ở dạng anion. Phản ứng này tạo phức có màu bền vững và ổn định được dùng để định lượng protein. R’ -C H H N C I CH-C R' o -CH — c -N — CH — C— N — C--------- II H H N ----------- C CuSO, o R" R" 0 NaOH H -C H ---- c ----- N ----- CH----- c ----- N I R’ o I R 0 li R o 'x /X R" l R" 2Na -CH — C---- N — CH — C— N ------------ ộ ---.. í 0 + Phản ứng Edman: Nguyên tẳc: Acid amin phản ứng với phenylisothiocyanat tạo dẫn xuất phenylthiohydantoin có thể xác định liên tiếp tới 50 acid amin-N tận mà không hề làm thủy phân đoạn peptid còn lại. + Phản ứng Sanger; Nguyên tắc: Acid amin phản ứng với clorid đabsyl, clorid dansyl và 1fluoro-2,4 dinitrobezen cho các dẫn chất bền vững trong điều kiện thủy phân protein.(Phản ứng này dùng để xác định aa-N tận nhưng không có khả năng xác định liên tiếp vì peptid còn lại bị phá hủy do thủy phân). R \ / -NO2 + H- + -N- -C - H H H -COO^------“OOC—C —N\ O2N l-fluoro-2,4 dinifrobenzen acid a- amin HF I R -NO2 H O2N 2,4-dinifrophenylaminoacid • Trong phân tử CMC có chứa lưu huỳnh, nên có phản ứng Folh xác định acid amin chứa lưu huỳnh. Nguyên tắc: CMC khi đun nóng trong môi trường kiềm sẽ phản ứng với muối chì tạo chì sulfid PbS màu đen xám. • Phân tử CMC có chứa nhóm chức acid (diacid), nên có phản ứng đặc trưng của acid: phản ứng ester hóa, phản ứng acyl hóa. 1.1.2. Tác dung dươc lý T4. 12. 16. 17. 20. 241 Theo một nghiên cứu nhận thấy, các thành phần đường (fücose và acid sialic) trên glycoprotein nhầy (còn được gọi là mucins) có liên quan đến độ nhớt của dịch nhầv đưòms tiêu hóa. CMC ỉà một loại thuốc mucoresulation, có tác dụns điều chỉnh fucose và acid sialic trong chất nhầy đường tiêu hóa thông qua cơ chế ức chế yếu tố hoại tử khối u alpha (tumor nucrosis factor alpha- TNF a)- yếu tố làm tăng độ nhớt của chất nhầy và ức chế sialyl Lewis X trên protein dung họp MUC5AC (Mucin 5 kiểu phụ A và C) do đó làm giảm độ nhớt của chất nhày. Theo một nghiên cứu khác, các tác giả cho biết, CMC có tác dụng làm lỏng dịch nhầy đường hô hấp theo cơ chế làm gãy cầu nối disulfua của các glycoprotein (còn gọi là mucoprotein) làm cho tan chất nhày nhớt đặc quánh. Theo một nghiên cứu mới, CMC có tác dụng trong ngăn ngừa lây nhiễm cúm tuyp A: CMC có tác dụng ức chế yếu tố nhân kappa B (Nuclear factor- kappa B: NF-kB) và tăng độ pH trong endosomes làm giảm các thụ thể virus cúm người trong tế bào biểu mô đưòng hô hấp, do vậy, ức chế sự lây nhiễm virus cúm A. Chỉ định: Rối loạn hô hấp đặc biệt liên quan đến sự tăng tiết hoặc tăng độ nhầy nhớt như viêm phế quản cấp hoặc mãn, giãn phế quản, viêm phế quản dạng hen hoặc khí phế thũng. Điều trị hỗ trợ trong viêm tai, viêm xoang, viêm mũi họng, chảy dịch ống tai và giảm việc tăng tiết trước khi phẫu thuật 1.1.3. Tổng quan về các phương pháp tổng hop CMC 1.1.3.1. Các phương pháp tong hơp CMC đi từL-cvsteỉn a. Phương pháp của L. Michaelis và Maxwell p. Schubert (1934) [22] Tổng hợp CMC (I) từ L-cystein hydroclorid monohydrat (II) và acid monocloacetic (III) trong môi trường kiềm (dung dịch KOH 6,7M). Dung dịch sau phản ứng được điều chỉnh về pH 5 bằng acid acetic băng, làm lạnh bằng nướcđá trong 2h, cystein dư sẽ tủa lại. Lọc loại tủa cystein, thu lấy dịch lọc. Điều chỉnh pH của dịch lọc về 2 bằng acid clohydric 6 M, làm lạnh khối phản ứng bằng nước đá trong 2h. CMC sẽ kết tinh. Lọc thu lấy tinh thể. Hòa tan tinh thể CMC trong 200ml nước sôi, lọc nóng thu dịch lọc. Dịch lọc được làm lạnh bằng đá. CMC sẽ kết tinh dưới dạng tinh thể 6 mặt. Lọc, rửa bằng nước lạnh, sấy ở 60°c. Hiệu suất phản ứng khoảng 70%, nhiệt độ nóng chảy 175- 176°c. Phươns trình phản ứng; o o 'OH II b. Phương pháp của M. D. Amstrong và cộng sự (1951)[9] Tổng họfp CMC từ L-cystein bằng cách hồi lưu hỗn hợp của L-cystin và acid monocloacetic trong acid HCl đặc. Kết quả thu được dạng racemic của CMC c. Phương pháp của L. Goodmans và cộng sự (1958)[14] CMC được tổng hợp từ L-cystein và acid monocloacetic, trong môi trường nước, có mặt NaOH. Kết quả thu được L-CMC d. Phương pháp của Maurice Joullie và cộng sự (1962)[32] CMC được tổng hợp từ L-cystein hydroclorid monohydrat và monoacetat natri trong môi trưÒTig kiềm (dung dịch NaOH 5N) dưới bầu khí Nitơ và nhiệt độ thấp. Tinh chế CMC: Đun nóng hỗn hợp gồm: CMC, HCl 3N ở 70°c trong 30 phút. Sau đó thêm than hoạt, rồi đun sôi khối phản ứng trong 15 phút. Lọc nóng để loại bã than. Dịch lọc được làm nguội đến 40°c. Sau đó được trung hòa bằng cách thêm từ từ dung dịch NaOH, khuấy mạnh. Duy trì nhiệt độ khối phản ứng 50°c trong 16h, CMC sẽ kết tinh lại. Lọc thu tinh thể. Tạo hỗn dịch của tinh thể với nước cất. lọc thu tinh thể, rửa cho tới khi có phản ứng âm tính với dung dich AgNOsHiệu suất quá trình tinh chế đạt 89- 90%, CMC thu được có nhiệt độ nóng chảy 248"c, góc quay cực riêng ở 26°C: [ữ]ị°= -36°5 đến -38°. e. Phương pháp của Maurice Joullie và cộng sự (1967) [19] CMC được tổng hợp từ cystein hydroclorid và acid monocloacetic trong môi trường pH 8 (điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 5N) dưới bầu khí Nitơ ở nhiệt độ 50®c. Khi phản ứng kết thúc, ngừng cung cấp N2, sau đó điều chỉnh pH về 6 bằng HCl đặc. Tẩy màu bằng than hoạt, lọc nóns, thu dịch lọc. Dịch lọc được đưa về nhiệt độ phòng. Điều chỉnh pH dịch lọc về 2,8 bằng HCl đặc, CMC (I) sẽ kết tủa. Ly tâm thu lấy tủa và rửa tủa cho đến khi hết ion c r. Tinh chế: Tạo hỗn dịch của CMC thô với HCl 2N (HCl dư khoảng 25%). Đun sôi hỗn dịch trong 5 phút, rồi làm lạnh về 30°c. Điều chỉnh pH dung dịch đến 2,8 bằng NaOH 2N. Sản phẩm I sẽ kết tủa. Lọc rửa tủa sản phẩm tới khi hết ion c r . Sản phẩm đạt độ tinh khiết 99,5%. Hiệu suất phản ứng đạt 90- 95%. Nhiệt độ nóng chảy: 249-250°c. f. Phương pháp của Bethge và các cộng sự (1984)[31] Hòa tan hoàn toàn 140 g clohydrat (RS) cystein, trong llit dung dịch NaOH 4N. Khuấv và cho thêm vào dung dịch 32; NaHS. Khuấy thêm 45 phút. Sau đó cho vào khối phản ứng 95g acid monocloacetic. Luôn giữ nhiệt độ 20°c trong suốt các quá trình đó. Để khối phản ứng 3h ở nhiệt độ 20- 30°c. Sau đó điều chỉnh pH về 3 bằng dung dịch HCl. Hạ nhiệt độ xuống 10°c, hỗn hợp racemic của CMC kết tinh. Lọc lạnh, rửa với nước loại ion clorid. sấy tinh thể ở 105°c. Hiệu suất phản ứng đạt 97%, hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy 188- 192°c. Từ hỗn họp racemic (RS) CMC tách lấy (R) CMC bằng (R)-l-phenyl ethylamin và tách lấy (S) CMC bằng (S)-l-phenyl ethylamin ỉ. 1.3.2. Các phươmpháp tons hơp Carbocvsteỉn đi từL-cvstin a. Phương pháp của Ear ỉ Pierson và các cộng sự (1946) [26] 8 CMC được tổng hợp từ L-cystin (IV) bằng cách thực hiện phản ứng khử trong môi trường kiềm (dung dịch NaOH 30%) có mặt acid monocloacetic (III) và kẽm, ở nhiệt độ 30°c. Dịch phản ứng sau khi loại bỏ kẽm dư sẽ được điều chỉnh về pH 2 bằng acid sulíliric đặc. Hạ nhiệt độ phản ứng xuống 15- 20°c, khuấy liên tục trong Ih, CMC (I) sẽ kết tinh. Lọc, rửa tinh thể bằng nước lạnh, sấy thu được sản phẩm I. Hiệu suất phản ứng đạt 90%, nhiệt độ nóng chảy 188- 191°c. Phương trình phản ứng: o NH, ,COOH l,Zn/NaOH HOv HOOC rv ' o 2 ’. CK 1 NH, III 'OH trong NaOH b. Phương pháp Maỉerhop và công sư (1978) [81 Để tổng họp CMC (I), trước tiên nhóm tác giả tiến hành phản ứng khử hóa L-cystin (IV) bằng tác nhân Na/ NH3 lỏng, ở -40°c để tạo thành L-cystein (II). Sau đó cho II thu được phản ứng với acid monocloacetic (III) ở nhiệt độ 20-30°c, tạo thành CMC (I). Hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 92%, sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao hơn các phương pháp khác Phưong trình phản ứng: NH2 NH2 HOOC. 'COOH NH2 IV l.N a /N H s 2. CICH2COOH 'COOH XOOH c. Phương pháp của J. González-García và các cộng sự (1998)[15] Sử dụng phản ứng điện phân L-cystin tại cực âm với dự có mặt của anion monocloacetat được thêm vào trong suốt quá trình điện phân. Điện cực sử dụng có thể là điện cực carbon. - Cực âm: Điện cực sợi carbon - Cực dương: Kim loại - Dung dịch cực âm: dung dịch L-cystin/NaOH. Nồng độ L-cystin ban đầu 0,8- 1,3M. pH dung dịch khoảng 8 - 13,5 - Dung dịch cực dương: Dung dịch Na2SƠ4 - Mật độ dòng điện; 250- 2000 Pdvcỉ - Nhiệt độ; 40- 50°c Nồng độ L-cystin trong sản phẩm cuối luôn thấp hơn 0,5% 1.1.3.3. Các phương pháp tom hơp Carbocvstein đi từ nsuyên liêu khác a. Phương pháp của Kazuo Nakayasu và cộng sự (1984) [25] Các tác giả tiến hành tổng hợp CMC (I) đi từ nguyên liệu ban đầu là acid thioglycollic (V) bằng phản ứng với p-cloroalanin (VI) trong môi trưòmg kiềm (dung dịch KOH), pH 10-13, ở nhiệt độ 20°c. Sau đó acid hóa khối phản ứng về pH 2-4, sản phẩm I sẽ kết tủa. Phưong trình phản ứng; 0 'OH Ồ b. Phương pháp của Kenzo Yokozeki và các cộng sự (1988)[29] Từ chất ban đầu là DL-2-aminothiazolin-4-carboxylic acid (ATC), sử dụng vi khuẩn Pseudomonas thiazolinophilum hoặc Pseudomonas molytica, quá trình sinh tổng họp nên CMC gồm 4 bước: - Bước 1: Sử dụng enzym ATC racemase phân tách hỗn hợp đồng phân racemic DL-ATC thành D-ATC và L-ATC - Bước 2: Thủy phân L-ATC thành S-carbamyl-L-cystein (L-SCC) bằng enzym L-ATC hydrolase 10 - Bước 3: Thủy phân L-SCC thành L-cystein bằng enzym L-SCC hydroxylaze - Bước 4: L-cystein phản ứng với anion monocloacetat tạo thành CMC. Ps. thiazolinophilum và Ps. desmolytica có thể tạo ra cả 3 enzym trên với sự có mặt của DL-ATC trong môi trưòng nuôi cấy. c. Phương pháp của Ken-Ichi Ishiwata và cộng sự (1989)[18] Các tác giả tiến hành tổng hợp CMC (I) tìr L-serin với enzym tryptophan synthease (thu được từ nuôi cấy vi khuẩn Escherichia Coli trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Enzym tryptophan synthease sẽ xúc tác cho phản ứng thay thế vị trí ß của L-serin bằns một chất nền là thioslvcolic hoặc tốt hơn là alkylthioglycolat tạo thành -^-(l-EthylhexyloxycarbonylmethyO-l-cystein, sau S-{2- đó ethylhexyloxycarbonylmethyl)-l-cystein sẽ bị thủy phân trong môi trường kiềm tạo sản phẩm I. d. Phương pháp của Jingmin Zeng và cộng sự (2005)[30] Các tác giả tổng họp CMC (I) đi từ nguyên liệu là polycystein theo sơ đồ sau: ^SH HC- -CH Reaưangement ể XOOH T hiohem iacetal------------- ► 'H N ' G lyoxal .CH HoN' Ö Po lycy Stein 1.2. Ö Tổng quan về L-cystin 1.2.1. Cấu trúc hỏa hoc: Công thức cấu tạo [21]: o Công thức phân tử: C6H 12N2O4S2 11 - Phân tử lượng; 240,30 - Thành phần: C: 29,99%; H: 5,03%; N: 11,66%; O: 26,63%; S; 26,69% - Tên khoa học: ß,ß’-diamino-ß,ß’-dicarboxydiethyl disulfid. 1 .2 .2 . Tính chất a, Tỉnh chất vát lý [21]: - Dạng bột kết tinh màu trắng - Thực tế không tan trong alcol - Tan trong nước ở pH< 2 hoặc pH> - Năng suất quay cực [a]n^^ = - 223.4° trong dung dịch HCl 1,0N. - Nhiệt độ nónơ chảy khoảns 260-26 l°c 8 b. Tỉnh chất hóa hoc [13]: L-cystin có cấu trúc của một a-amino acid, do vậy nó mang tính chất hóa học cơ bản của một a-amino acid. Tham gia các phản ứng với Ninhydrin, phản ứng với Flourescamin, phản ứng Sanger, phản ứng Edman và vì chứa s nên có phản ứng Fohl xác định acid amin chứa lưu huỳnh. 1.2.3. Phương pháp điều chế: L-cystin có thể điều chế bàng nhiều phương pháp khác nhau. Người ta có thể tổng hợp được L-cystin từ serin hay acid acrylic, hoặc có thể sinh tổng hợp từ các enzym....[10]. Tuy nhiên phương pháp thủy phân L-cystin từ protein vẫn đon giản và có ý nahĩa môi trưÒTig hơn cả. L-cystin là một trong những sản phẩm thu được từ dịch thủy phân của keratin có trong tóc, sừng, móng... Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng L-cystin có tỉ lệ cao trong keratin của tóc, sừng, móng và lông [2, 5, 6 , 7]: Tóc (14,0%), lông lợn (14,4%), sừng (12,1%), len (10,3%)- Do vậy, các nguồn keratin khác nhau chính là nguồn nguyên liệu chủ yếu để tách chiết L-cystin. 1.3. Tổng quan về L-cystein 1.3.1. Cấu trúc hỏa hoc \2\\. 12 'OH - Công thức phân tử: C3H7NO2S. KLPT: 121,16. - Tên khoa học; 2-amino-3-mercaptopropionic acid. 1 .3 .2 . Tính chất a. Tính chất vât lý [21 ]: - Góc quay cực: [a]D^^=+6.5° (trong dung dịch HCl 5N). - pKa: pKi= l,71;pK2=8,33;pK3=10,78 - Dễ tan trong nước, alcol, acid acetic, amoniac; không tan trong ether, aceton, ethyl acetat, benzen, disulfid carbon, tetrachlorocarbon. - Trong môi trường nước trung tính hoặc kiềm nhẹ, L-cystein dễ bị oxy hóa thành cystin bởi không khí. Nó ổn định hơn trong dung dịch acid. - Dạng muối HCl (C3H 7NO2S.HCI): tan được trong nước, alcol, aceton; dung dịch có tính acid; phân hủy và oxy hóa chậm; có khả năng hút ẩm; dạng dược dụng: L-cystein hydrochlorid monohydrat C3H7NO2S.HCl.H2O. b, Tỉnh chất hóa hoc [13]: - Với cẩu trúc có chứa cả hai nhóm -COOH và nhóm -NHi nên L-cvstein có những tính chất hóa học cơ bản của một aminoacid. Tính chất của nhóm thiol: Do s và o thuộc cùng một phân nhóm trong bảng tuần hoàn các nguyên tổ hóa học (phân nhóm VI.A) nên chúng có một số tính chất hóa học tương tự nhau. Tính chất hóa học của các hợp chất chứa nhóm thiol tưong tự như của alcol; các thiol tạo ra các thioete, thioacetal, thiocetal, thioester. Ví dụ; • Tạo thioete khi tác dụng với alcol; R-SH + R'OH -------- ► R -S -R + H 2O 13 • Tác dụng với aldehyd và ceton tạo thành thioacetal và thiocetal; 2R-SH + R'-CH=0 -------- ► R'-CH(SR)2 Thioacetal 2R-SH + R" • 7 = 0 ------------► / ỵC \ 2 R ./ R Dễ bị oxy hóa: Khi oxy hóa nhẹ nhàng thiol bởi oxy của không khí thì tạo thành dialkyl disulfid; 2R-SH + - Ơ 2 -------- ► R-S-S-R + H2O (dialkyl disulfid) Khi oxy hóa mạnh thiol với acid nitric tạo ra alkyl sulfonic: [0 ] R-SH -------- ► R-SO3H HNO3 • (alkyl sulfonic) Phản ứng với dung dịch chì acetat cho kết tủa chì mercaptid có màu vàng đặc trưng để nhận biết. • Nguyên tử lưu huỳnh trong nhóm thiol có độ âm điện nhỏ hơn nguyên tử oxy trong alcol nhưng lại thể hiện tính acid yếu.