Tài liệu Nghiên cứu tính chống chịu bệnh hỗn hợp nấm - tuyến trùng nốt sưng trên cà chua và biện pháp phòng trừ sinh học ở vụ xuân 2010 tại hà nội

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------
--------- TRẦN THỊ LỢI NGHIÊN CỨU TÍNH CHỐNG CHỊU BỆNH HỖN HỢP NẤM - TUYẾN TRÙNG NỐT SƯNG TRÊN CÀ CHUA VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ SINH HỌC Ở VỤ XUÂN 2010 TẠI HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: PSG.TS. NGÔ THỊ XUYÊN HÀ NỘI - 2010 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng mọi số liệu, kết quả sử dụng trong báo cáo này hoàn toàn trung thực, chưa ñược sử dụng hoặc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Tác giả luận văn Trần Thị Lợi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........i LỜI CẢM ƠN Có ñược kết quả nghiên cứu này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ của thầy cô, gia ñình, bạn bè. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến PGS.TS Ngô Thị Xuyên ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp ñỡ tôi, truyền cho tôi kiến thức và kinh nghiệm quý báu ñể tôi hoàn thành luận văn nghiên cứu khoa học này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô trong bộ môn Bệnh câykhoa Nông học - trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều kiện, giúp ñỡ tôi trong thời gian thực hiện ñề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn UBND xã ðặng Xá, Hợp tác xã ðặng Xá, gia ñình cô Ngô Thị Kiệm, xã ðặng Xá – huyện Gia Lâm – TP Hà Nội ñã tạo ñiều kiện và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài ở ñịa phương. Tôi xin cảm ơn gia ñình, bạn bè ñã luôn bên tôi, ñộng viên, khích lệ tôi trong thời gian tôi thực hiện ñề tài này. Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Tác giả luận văn Trần Thị Lợi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........ii MỤC LỤC 1. MỞ ðẦU ...................................................................................................i 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài...........................................................................1 1.2. Mục ñích, yêu cầu nghiên cứu của ñề tài .................................................2 1.2.1. Mục ñích...............................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu.................................................................................................3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài..................................................3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học..................................................................................3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn. .................................................................................3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU...............................................4 2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. ...........................................................4 2.1.1. Cà chua chuyển gen. .............................................................................4 2.1.2. Bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng và nấm. .................................7 2.1.3. Biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hỗn hợp. ...................................... 10 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước........................................................... 15 2.2.1. Cà chua chuyển gen ............................................................................ 15 2.2.2. Bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm....................................................... 18 2.2.3 Biện pháp phòng trừ bệnh.................................................................... 23 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......... 27 3.1. ðối tượng,vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu............................. 27 3.1.1 ðối tượng nghiên cứu .......................................................................... 27 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu.............................................................................. 27 3.1.3. ðịa ñiểm, thời gian nghiên cứu........................................................... 27 3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ................................................... 28 3.2.1. Phương pháp ñiều tra thu thập mẫu..................................................... 28 3.2.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm............................... 28 3.2.3. Phương pháp nghiên cứu trong nhà lưới ............................................. 31 3.4. Các chỉ tiêu theo dõi và xử lí số liệu. .................................................... 34 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........iii 3.4.1 Chỉ tiêu theo dõi .................................................................................. 34 3.4.2 Xử lí số liệu ......................................................................................... 35 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...................................... 36 4.1. Thành phần bệnh hại trên cây cà chua tại Hà Nội vụ xuân 2010 ........... 36 4.2. Tình hình bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm trên cà chua vụ xuân 2010 tại Hà Nội.......................................................................................................... 42 4.2.1. Bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm Rhizoctonia solani trên giống cà chua ðại Minh Châu tại ða Tốn- Gia Lâm- Hà Nội. .................................... 42 4.2.2. Bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm Rhizoctonia solani trên một số giống cà chua tại khu sản xuất rau an toàn Phúc Lợi- Long Biên- Hà Nội. ............. 44 4.2.3. Bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm Fusarium oxysporum trên giống cà chua K002 và giống 62 Ấn ðộ tại ða Tốn- Gia Lâm- Hà Nội ...................... 46 4.2.4. Bệnh hỗn hợp giữa TTNS và héo rũ gốc mốc trắng tại ðặng Xá......... 47 Gia Lâm- Hà Nội.......................................................................................... 47 4.3. Kết quả phòng trừ bệnh trên cà chua bằng chế phẩm sinh học ............... 50 4.3.1. Thử nghiệm khả năng ñối kháng của vi khuẩn Bacillus filaris với một số nấm, vi khuẩn gây bệnh ........................................................................... 50 4.3.2. So sánh khả năng phòng trừ nấm Sclerotium rolfsii của Trichoderma viride và Trichoderma harzianum................................................................. 52 4.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen kháng ở thế hệ 2 bằng phương pháp PCR 55 4.4. Các thí nghiệm trong nhà lưới................................................................ 57 4.4.1. Xác ñịnh mối tương quan giữa tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita và nấm Sclerotium rolfsii trên giống cà chua DV 1234. ................ 57 4.4.2. Khảo sát mức ñộ nhiễm bệnh hỗn hợp của một số giống cà chua thường và cà chua chuyển gen. ................................................................................. 59 4.4.3. ðánh giá khả năng phòng trừ bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm Sclerotium rolfsii bằng Chitosan ở các nồng ñộ khác nhau. .......................... 61 4.4.4. ðánh giá khả năng chống chịu bệnh hại của một số giống cà chua chuyển gen và giống không chuyển gen trong ñiều kiện nhà lưới. .....................63 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........iv 4.4.5. Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh hỗn hợp giữa TTNS và HRGMT của một số chế phẩm sinh học. ..................................................................... 66 4.4.6. Nghiên cứu khả năng gây hại của bọ phấn Bemissia tabaci Genadius trên dòng cà chua chuyển gen và giống không chuyển gen........................... 69 4.5. Thí nghiệm ngoài ñồng ruộng................................................................ 71 4.5.1. Khả năng phòng trừ bệnh khi sử dụng chế phẩm sinh học LEC trên một số giống cà chua trồng phổ biến ................................................................... 71 4.5.2. ðánh giá năng suất ñạt ñược trên giống cà chua DV987 khi sử dụng biện pháp phòng trừ sinh học........................................................................ 73 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 77 5.1. Kết luận ................................................................................................. 77 5.2. ðề nghị.................................................................................................. 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 78 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Thành phần bệnh hại trên cây cà chua vụ xuân............................. 37 năm 2010 tại Hà Nội..................................................................................... 37 Bảng 4.2. Diễn biến bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm Rhizoctonia solani trên giống cà chua ðại Minh Châu tại ða Tốn- Gia Lâm- Hà Nội. ...................... 43 Bảng 4.3. Diễn biến bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm Rhizoctonia solani trên một số giống cà chua tại Phúc Lợi- Long Biên- Hà Nội................................ 45 Bảng 4.4. Diễn biến bệnh hỗn hợp giữa TTNS và bệnh héo vàng trên giống cà chua K002 và giống 62 Ấn ðộ tại ða Tốn – Gia Lâm .................................. 46 Bảng 4.5. Diễn biến bệnh hỗn hợp với TTNS và HRGMT trên giống cà chua HT 42 vụ xuân 2010 tại ðặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội. ............................... 48 Bảng 4.6. Khả năng ñối kháng của Bacillus filaris với một số nấm, vi khuẩn gây bệnh ....................................................................................................... 50 Bảng 4.7. So sánh khả năng phòng trừ nấm Sclerotium rolfsii của Trichoderma viride và Trichoderma harzianum ........................................... 52 Bảng 4.8. Khả năng nhiễm bệnh hỗn hợp TTNS và HRGMT trên giống DV 1234 với các ngưỡng lây nhiễm khác nhau ................................................... 57 Bảng 4.9. Mức ñộ nhiễm bệnh hỗn hợp trên các giống cà chua trồng phổ biến và giống chứa gen kháng .............................................................................. 60 Bảng 4.10. ðánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh hỗn hợp giữa TTNS và HRGMT của chế phẩm sinh học Chitosan ở các nồng ñộ khác nhau. ........... 62 Bảng 4.11. Thành phần bệnh hại trên một số dòng cà chua chuyển gen và không chuyển gen vụ xuân năm 2010........................................................... 64 Bảng 4.12. Hiệu lực phòng trừ bệnh hỗn hợp giữa M. incognita và nấm Sclerotium rolfsii bằng 1 số chế phẩm sinh học trên giống DV1234............. 66 Bảng 4.13. Hiệu lực phòng trừ bệnh hỗn hợp giữa M. incognita và nấm Sclerotium rolfsii bằng 1 số chế phẩm sinh học trên dòng Hypsys #78......... 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........vi Bảng 4.14. Diễn biễn mật ñộ bọ phấn Bemissia tabaci Genadius trên giống cà chua thường và các dòng cà chua chuyển gen............................................... 69 Bảng 4.15. Một số bệnh hại chính trên ruộng cà chua thí nghiệm tại ðặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội ..................................................................................... 72 Bảng 4.16. Năng suất các giống cà chua trên ruộng thí nghiệm .................... 73 tại ðặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội.................................................................. 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 4.1. Triệu chứng bệnh TTNS ............................................................... 41 Hình 4.2. TTNS tuổi 2.................................................................................. 41 Hình 4.3. Triệu chứng bệnh xoăn vàng ngọn cà chua ................................... 41 Hình 4.4. Triệu chứng bệnh HRGMT ........................................................... 41 Hình 4.5. Triệu chứng bệnh lở cổ rễ ............................................................. 41 Hình 4.6. Triệu chứng bệnh ñốm vòng ......................................................... 41 Hình 4.7. ðồ thị diễn biễn bệnh hỗn hợp giữa TTNS và LCR trên giống ðại Minh Châu tại ða Tốn – Gia Lâm ................................................................ 43 Hình 4.8. Diễn biến bệnh hỗn hợp giữa TTNS và bệnh héo vàng trên giống cà chua K002 và giống 62 Ấn ðộ tại ða Tốn – Gia Lâm.............................. 47 Hình 4.9. ðồ thị diễn biến bệnh hỗn hợp với TTNS và HRGMT trên giống cà chua HT 42 vụ xuân 2010 tại ðặng Xá – Gia Lâm – Hà Nội. ....................... 49 Hình 4.10. Ruộng ñiều tra tại ða Tốn........................................................... 49 Hình 4.11. Ruộng ñiều tra tại Phúc Lợi ........................................................ 49 Hình 4.12. Ruộng nhiễm bệnh HH giữa TTNS và héo vàng tại ða Tốn........ 49 Hình 4.13. Triệu chứng bệnh HH giữa TTNS và HRGMT ........................... 49 Hình 4.14, 4.15. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus filaris ................. 51 Hình 4.16. Khả năng ñối kháng của B. filaris với nấm S. rolfsii ................... 51 Hình 4.17. So sánh hiệu lực phòng trừ S. rolfsii của T. viride và T. harzianum .................................................................................................... 54 Hình 4.18. Hiệu lực phòng trừ S. rolfsii của T. viride và T. harzianum ......... 54 Hình 4.19. Thí nghiệm trên các dòng cà chua chuyển gen ............................ 56 Hình 4.20. Phản ứng PCR phát hiện gen Hypsys. ......................................... 56 Hình 4.21. Tương quan giữa lượng nấm S.rolfsii và tỉ lệ bệnh hỗn hợp ........ 58 Hình 4.22. Tương quan giữa số lượng tuyến trùng lây nhiễm ban ñầu và tỉ lệ bệnh hỗn hợp................................................................................................ 58 Hình 4.23 Bệnh hỗn hợp TTNS và HRGMT trên giống DV987 ................... 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........viii Hình 4.24 Bệnh hỗn hợp TTNS và HRGMT trên dòng Hypsys # 78 ............ 60 Hình 4.25 Một số sâu bệnh hại trên cà chua trong nhà lưới .......................... 65 Hình 4.26. Các giống cà chua chuyển gen và không chuyển gen dùng trong thí nghiệm ......................................................................................................... 68 Hình 4.27. ðồ thị diễn biễn mật ñộ bọ phấn Bemissia tabaci Genadius trên giống cà chua thường và các dòng cà chua chuyển gen ................................ 70 Hình 4.28. Triệu chứng bọ phấn gây hại trên giống cà chua chuyển gen ...... 71 Hình 4.29. Triệu chứng bọ phấn gây hại trên giống cà chua thường ............. 71 Hình 4.30. Làm giàn cà chua ........................................................................ 75 Hình 4.31. Giống DV1234............................................................................ 75 Hình 4.32. Giống DVS95 ............................................................................. 75 Hình 4.33. Giống Lai số 2 ............................................................................ 75 Hình 4.34. Giống DV 987............................................................................. 75 Hình 4.35. Ruộng cà chua TN ...................................................................... 75 Hình 4.36 Hội thảo nghiệm thu mô hình tại ðặng Xá .................................. 76 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TTNS: Tuyến trùng nốt sưng LCR: Lở cổ rễ HV: Héo vàng HH: Hỗn hợp HLPT: Hiệu lực phòng trừ TLB: Tỷ lệ bệnh TT2: Tuyến trùng tuổi 2 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ..........x 1. MỞ ðẦU 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài. Rau là một mặt hàng không thể thiếu trong ñời sống hàng ngày của con người. Trong rất nhiều loại rau ñang ñược trồng hiện nay thì cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) là loại rau có giá trị kinh tế cao ñược trồng ở nhiều nơi trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Cà chua có nguồn gốc từ Nam Mỹ, là loại quả thường dùng của thổ dân nơi ñây. ðến khi người Tây Ban Nha xâm chiếm Nam Mỹ, họ ñã ñem cà chua về châu Âu vào khoảng những năm 1500 và sau ñó là ñem ñến Philipines. Cho ñến ngày nay cà chua ñã có mặt trên khắp thế giới và ñược sử dụng rộng rãi trong bữa ăn. Những quốc gia có sản lượng cà chua lớn nhất thế giới là Hoa Kỳ, Trung Quốc, Thổ Nhĩ Kỳ, Italia và Ấn ðộ. Cà chua là nguồn cung cấp vitamin A và C phong phú nhất. Ngoài vitamin, trong cà chua còn có rất nhiều dưỡng chất quan trọng khác như chất xơ, betacaroten, lycopen, sắt, magie, kali, phốt pho...vv. Cà chua chứa rất ít chất béo no, ít cholestrol và natri. Ngoài ra, cà chua còn có ý nghĩa hết sức to lớn trong cơ cấu luân canh, xen canh cây trồng, tăng hiệu quả sử dụng ñất, tăng thu nhập trên một ñơn vị diện tích của nông dân. Cho tới nay, cà chua ñang ñược trồng với diện tích khá lớn. Ở Việt Nam, diện tích là 17.874 ha, chủ yếu ở các tỉnh ñồng bằng sông Hồng và Lâm ðồng. Chúng ta ñang từng bước hình thành những vùng chuyên canh sản xuất cà chua với số lượng lớn như Hà Nội, Hưng Yên, Hải Dương, Hải Phòng, Bắc Ninh, Lâm ðồng... Cùng với sự gia tăng về diện tích và quy mô sản xuất thì vấn ñề sâu bệnh hại cũng không ngừng gia tăng. Theo thống kê của CABI (2005) [1], hiện có khoảng 499 loài dịch hại gây hại trên cà chua. Sâu bệnh làm giảm năng suất, chất lượng sản phẩm, tăng chi phí sản xuất do sử dụng thuốc trừ sâu bệnh. Trên cà chua thường xuyên xuất hiện các loại bệnh như mốc sương, héo vàng, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............1 héo rũ gốc mốc trắng, bệnh do virus, héo xanh, tuyến trùng nốt sưng...Thực tế cho thấy, trên ñồng ruộng hiếm khi xuất hiện từng bệnh riêng lẻ, mà xuất hiện theo nhóm gồm nhiều nguyên nhân. Tuy nhiên, bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng và nhóm bệnh héo do nấm là nhóm bệnh gây thiệt hại ñáng kể. Biện pháp hoá học ñược sử dụng nhiều trong phòng trừ bệnh hại, song dư lượng thuốc bảo vệ thực vật có thể gây ảnh hưởng ñến sức khoẻ con người. Hiện nay, xu hướng sử dụng các giống cà chua kháng bệnh và sử dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ dịch bệnh ñã ñược áp dụng rộng rãi, nhằm hạn chế sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, ñảm bảo an toàn thực phẩm. Ở Việt Nam, việc sử dụng các giống cà chua chuyển gen kháng sâu bệnh vẫn còn hạn chế do các nghiên cứu chưa ñược tiến hành ñầy ñủ, những hiểu biết về cây trồng chuyển gen còn thiếu. Việc khảo sát khả năng chống chịu bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng và nấm của một số giống cà chua, thử nghiệm khả năng phòng chống bệnh của một số chế phẩm sinh học là yêu cầu quan trọng nhằm tạo vật liệu khởi ñầu ñể lai tạo giống chống chịu sâu bệnh, cung cấp thông tin cho công tác phòng trừ bệnh hại cà chua. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, ñược sự phân công của Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Ngô Thị Xuyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tính chống chịu bệnh hỗn hợp nấm-tuyến trùng nốt sưng trên cà chua và biện pháp phòng trừ sinh học ở vụ xuân 2010 tại Hà Nội”. 1.2. Mục ñích, yêu cầu nghiên cứu của ñề tài 1.2.1 Mục ñích - ðiều tra tình hình bệnh hại trên các giống cà chua trồng phổ biến ở vụ xuân năm 2010 tại Hà Nội. - Nghiên cứu tính chống chịu của 1 số dòng cà chua chuyển gen và giống không chuyển gen với bệnh hỗn hợp do nấm, tuyến trùng và tác dụng của các chất kích kháng trong việc tăng cường khả năng kháng, từ ñó làm cơ sở cho việc phòng trừ sinh học trên cà chua. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............2 1.2.2. Yêu cầu - Tiến hành ñiều tra tình hình bệnh hại, thu thập mẫu bệnh trên ñồng ruộng ở Hà Nội. Xác ñịnh mức ñộ phổ biến và gây hại của bệnh gây ra trên các giống cà chua hiện ñang trồng phổ biến vào vụ xuân 2010. - Phân lập mẫu bệnh, nuôi cấy trên môi trường nhân tạo nhằm thu ñược mẫu bệnh thuần. - Kiểm tra sự xuất hiện của gen kháng ở thế hệ 2 bằng phương pháp PCR. - Lây nhiễm bệnh, ñánh giá tính chống chịu của các giống có xử lí và không xử lí chất kích kháng. - Thử nghiệm khả năng phòng trừ bệnh của các chế phẩm sinh học. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài. 1.3.1. Ý nghĩa khoa học. - Kết quả nghiên cứu góp phần tìm hiểu một số bệnh hại chính trên cà chua, thử nghiệm về khả năng kháng bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng và nấm của một số dòng cà chua chuyển gen kháng và giống trồng phổ biến, làm cơ sở ñề xuất vật liệu khởi ñầu cho công tác chọn tạo giống kháng. - Cung cấp những dẫn liệu khoa học về các biện pháp sinh học phòng trừ bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng và nấm. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn. - Các kết quả nghiên cứu ñược dùng làm cơ sở ñể áp dụng các biện pháp phòng trừ sinh học với bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng và nấm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. 2.1.1. Cà chua chuyển gen. Sinh vật biến ñổi gen (Genetically Modified Organism - GMO) là những sinh vật ñược thay ñổi vật liệu di truyền (ADN) bằng công nghệ sinh học hiện ñại, hay còn gọi là công nghệ gen. Cây trồng biến ñổi gen ñã mang lại nhiều lợi ích về kinh tế, môi trường cho nông dân trên thế giới. Sử dụng giống cây trồng chuyển gen kháng sâu bệnh ñang là xu hướng chính trong việc phòng trừ sâu bệnh. Năm 1994, giống cà chua Calgene chuyển gen chín chậm trở thành cây chuyển gen ñầu tiên ñược sản xuất và tiêu thụ ở các nước công nghiệp. Từ ñó tới nay ñã có thêm một số quốc gia trồng cây chuyển gen làm tăng hơn 20 lần diện tích cây chuyển gen trên toàn thế giới. Trong chuyển gen cà chua, phương pháp tiêm quả và nhúng hoa ñã ñược nghiên cứu từ nhiều năm nay. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa 1 trong 3 cấu trúc pROKIIAP1GUSint chứa gen Apetala 1 (AP1), pROKIILFYGUSint chứa gen LEAFY, hoặc p35SGUSint chứa gen β glucuronidase (GUS) ñược sử dụng ñể chuyển gen thực vật và thu ñược nhiều kết quả như mong muốn của nhiều nhà khoa học. ðối với chuyển gen qua tiêm quả, không có ảnh hưởng nào ñáng kể (p<0.05) ñược quan sát. Tần số chuyển gen cao nhất thu ñược sau 48h xâm nhiễm ñối với quả cà chua với tế bào vi khuẩn chứa 1 trong 3 cấu trúc trên, tần số chuyển gen là 17%, 19%, và 21% ñối với cấu trúc gen AP1, LFY, và GUS ñược quan sát. Cũng theo nghiên cứu này, ñộ thành thục của quả ảnh hưởng ñến tần số chuyển gen. Những quả chín ñỏ cho tần số chuyển gen cao hơn quả còn xanh theo thứ tự là 40%, 35%, and 42% ñối với cấu trúc gen AP1, LFY, và GUS. ðối với phương pháp chuyển gen bằng nhúng hoa, cấu trúc gen GUS cho tần số gen chuyển cao hơn cấu trúc AP1 và LFY, do ñó gợi ý về tác dụng ức chế có thể có của gen nở hoa ñược nghiên cứu. Hoa ñược chuyển gen trước khi thụ phấn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............4 cho tần số chuyển gen cao hơn, 12% ñối với cấu trúc LFY và 23% ñối với cấu trúc GUS (p<0,05). Mặc dù không có gen chuyển nào ñược quan sát ở cấu trúc AP1. Tất cả những phần chuyển gen tích cực GUS ñược phân tích bằng PCR và ñược xác thực bằng sự tồn tại của gen chuyển. So với cây ñối chứng, các cây chuyển gen mang cả gen chuyển AP1 và FLY ra hoa sớm và có ñặc ñiểm hình thái khác biệt (Abida Yasmeen, 2008) [23]. Cà chua chuyển gen Tobacco Chi-I và Glu-I cho hiệu quả kháng nấm rõ rệt. Sau khi xâm nhiễm với Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici, hai dòng cà chua chuyển gen kháng giảm tỉ lệ bệnh từ 36-58%. Hai dòng cà chua này hồi phục rất nhanh sau khi nhiễm bệnh, trong khi những cây cà chua dạng dại bị chết (Erik Jongedijk, 1995) [32]. Theo Xiang-Quian Li và các tác giả khác (2007) [63], cây cà chua chuyển gen cry6A Bt có tính kháng tốt hơn ñối với tuyến trùng nốt sưng M.incognita. Các nhà nghiên cứu ñại học California ñã thử hai gen cry6A, một gen ñược chuyển ñổi không có chứa codons (bộ 3 cặp DNA mã hoá một amino axit) không phổ biến trong thực vật và một gen khác ñược thay ñổi ñể chỉ bao gồm codon cho mỗi amino axit dựa trên các nghiên cứu về cây cỏ linh lăng Arabidopsis. Các nhà nghiên cứu cho biết sự sinh sản của tuyến trùng nốt sưng giảm 4 lần khi gen cry6A biểu hiện trong cây. Họ ñề xuất rằng gen cry6A có thể ñược xếp chồng trong các giống cây trồng mang các ñặc tính kháng tuyến trùng nốt sưng khác. Mới ñây các nhà nghiên cứu tại ðại học Victoria ñã tạo ñược cà chua mang gen tạo ñộc chất của ếch giúp cây cà chua có thể kháng bệnh, hoạt chất này có tên là dermaseptin B1. Các nhà nghiên cứu cho thấy rằng một dạng tương cận tổng hợp của dermaseptin B1 có thể kìm hãm sự sinh trưởng của các loại nấm gây bệnh thực vật như Alternaria, Cercospora, Fusarium, Phytophthora, Pythium, Rhizoctonia, Verticillium, và cả loài vi khuẩn Erwinia carotovora. Các nhà nghiên cứu ñã hiệu chỉnh cây cà chua ñể sản xuất ñộc chất nói trên và ñặt các cây này trong ñiều kiện dễ dàng bị vi sinh vật Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............5 tấn công. Kết quả cho thấy gen chèn vào ñã thể hiện một phổ kháng khuẩn với hoạt lực cao (Milan O. et al, 2005) [42]. Năm 2007, các nhà khoa học tại Trung tâm chuyển gen thực vật (ðại học California, Riverside) ñã chuyển gen SlpreproHypSys dưới sự ñiều khiển của promoter 35S CaMV. Các phân tích biểu hiện gen cho thấy nhiều dòng cà chua chứa cấu trúc trong ñó kích hoạt sự biểu hiện của gen mã hóa protein PI (protease inhibitor), một protein hình thành nhằm phản ứng lại các tổn thương cơ học của cây cũng như tổn thương do côn trùng (Narvaez – Vasquez et al, 2007) [44]. Tuy nhiên, cho tới nay chưa có một nghiên cứu nào ñược thực hiện nhằm ñánh giá tính kháng thông qua các peptid Hypsys ñối với các côn trùng gây hại trên cà chua. Vì các peptide tín hiệu như systemin và Hypsys liên quan ñến phản ứng kháng thông qua ñường hướng JA (jamonic acid) nên rất có thể cây cà chua mang gen mã hóa các peptide này cũng kháng ñược các tác nhân gây bệnh thuộc nhóm hoại dưỡng (necrotroph) như Rhizoctonia và Sclerotium là các tác nhân gây bệnh quan trọng trên cà chua. Kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học ở các nước nhiệt ñới sử dụng 74 giống cà chua chống chịu bệnh TTNS (M. incognita, M. javanica) cho kết quả ở cả 3 mức: kháng, kháng vừa và rất kháng, ngưỡng gây hại kinh tế là 2-100 tuyến trùng tuổi 2/100g ñất (Netscher & Sikora, 1993) [45]. Gen từ nấm ñối kháng là nguồn cải thiện tính kháng của cây trồng với bệnh cây. Lần ñầu tiên, tính kháng bệnh cây ở thực vật chuyển gen ñược cải thiện bằng cách chèn 1 gen từ nấm ñối kháng. Gen mã hóa endochitinase kháng nấm bệnh từ nấm ñối kháng Trichoderma harzianum ñược chuyển vào cà chua và khoai tây. Gen nấm thu ñược từ nhiều mô cây khỏe khác nhau có sự biểu hiện cao. Sự khác nhau chủ yếu trong hoạt ñộng của endokitinase ñược phát hiện trong các cây chuyển gen. Dòng chuyển gen có tính kháng cao hoặc kháng hoàn toàn với bệnh trên lá Alternaria alternate, A. solani, Botrytis cinerea, và bệnh nấm ñất Rhizoctonia solani. Tính kháng cao và phổ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............6 kháng rộng thu ñược từ gen chitinase ñơn của Trichoderma vượt qua tính kháng của gen chitinnase từ thực vật hoặc vi khuẩn. Những kết quả này chứng minh nguồn gen phong phú từ nấm ñối kháng có thể ñược sử dụng ñể phòng trừ bệnh hại thực vật (Matteo Lorito, 1998) [41]. Nấm ký sinh và nấm ñối kháng ñược nghiên cứu như là chất bổ sung hoặc thay thế các thuốc trừ sâu hóa học trong phòng trừ bệnh nấm. Việc chọn lọc các chủng và biến ñổi di truyền ñược ñưa ra ñối với 1 số isolate nấm có hiệu quả như thuốc trừ nấm trong ñiều kiện nuôi cấy. 2.1.2. Bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng và nấm. Nấm Sclerotium rolfsii Sacc. ñược Rolfs phát hiện và nghiên cứu ñầu tiên vào năm 1892 trên cây cà chua. Những phát hiện sau ñó chứng minh nấm có khả năng gây hại trên các cây trồng khác như củ cải ñường, lạc, cà rốt. Các loài nấm Sclerotium có sự khác nhau nhiều về hình thái nhưng chúng có ñặc ñiểm chung là ñều hình thành hạch nấm với kích thước khác nhau, màu sắc từ nâu sáng ñến nâu ñen (Punja và Rahe, 1992) [51]. Nấm Sclerotium thuộc lớp nấm ñảm (Basidiomycetes) (Punja và Grogan, 1981) [50]. Trong nhóm nấm này thì nấm S. rolfsii Sacc ñược biết ñến là loài nấm có phổ kí chủ khá rộng ngoài tự nhiên và là nguồn bệnh gây hại lớn cho cây trồng (Anycook, 1966) [25]. Theo Stephen và cộng sự thuộc ðại học Hawaii (2000) [55], trên thế giới ñã nghiên cứu, xác ñịnh ñược phạm vi ký chủ của nấm Sclerotium rolfsii Sacc. với ít nhất 500 loài cây trồng thuộc 100 họ thực vật. Những cây ký chủ mẫn cảm nhất với bệnh bao gồm: Họ cà (cà chua, khoai tây, cà pháo...), họ hoa thập tự (cải bắp, súp lơ trắng, súp lơ xanh, cải dầu), họ ñậu ñỗ (ñậu tương, lạc, ñậu xanh), họ bầu bí (dưa chuột, dưa hấu, bí ñao, bí ngô). Nấm S. rolfsii có thể sinh trưởng phát triển và tấn công vào bộ phận cây sát mặt ñất. Trước khi nấm xâm nhập vào mô ký chủ, chúng sản sinh tản nấm trên bề mặt gốc thân, quá trình tấn công có thể mất từ 2-10 ngày (Townsend và Willetts, 1954) [61]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............7 Trong số các loài tuyến trùng hại thực vật thì tuyến trùng nốt sưng gây bệnh có ý nghĩa kinh tế trên thế giới. Tuyến trùng Meloidogyne incognita Kofoid et White, 1999/Chitwood, 1949 là loài tuyến trùng nội kí sinh rễ thuộc giống Meloidogyne họ Meloidogynidae, bộ Tylenchida. Tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne xâm nhiễm cũng kéo theo xâm nhập của vi khuẩn, nấm, virus làm giảm năng suất cây trồng. Tuyến trùng là tác nhân gây vết thương cơ giới tạo ñiều kiện cho nấm ñất phụ thuộc nhiều vào các giai ñoạn sinh trưởng và phát triển của cây trồng, chúng có thể xâm nhập trực tiếp vào ñầu rễ sinh trưởng của cây trồng (Doncaster & Seymour, 1973) [31]. Bệnh hỗn hợp hại cây trồng ñược biết ñến trong thời gian dài bởi mối quan hệ giữa cây kí chủ, nguyên nhân gây bệnh và các yếu tố môi trường quyết ñịnh sự nhiễm bệnh trên các giống cây trồng khác nhau. Các loài nấm, vi khuẩn ñất thường kết hợp với tuyến trùng cùng gây bệnh trong cùng một ñiều kiện ngoại cảnh làm cây trồng nhiễm bệnh hỗn hợp nghiêm trọng, dẫn tới giảm năng suất, cây chết không cho thu hoạch. Tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp. là một trong những loài tuyến trùng nhiệt ñới xuất hiện và giữ vai trò quan trọng thúc ñẩy các loài vi sinh vật ñất xâm nhiễm và gây bệnh nặng hơn trên rất nhiều loài cây trồng và phổ biến ở nhiều nước trồng cà chua trên thế giới. Trong nhiều trường hợp, tuyến trùng nốt sưng như Meloidogyne spp. cũng như các loài tuyến trùng nội kí sinh (Rotylenchulus spp., Pratylenchus spp.) và ngoại kí sinh (Xiphinema spp., Longidorus spp.) luôn kết hợp với một số loài nấm ñất gây hại trên cây rất phổ biến, trở thành bệnh hỗn hợp gây thiệt hại ñáng kể (Evans & Haydock, 1993) [33]. Mối quan hệ giữa tuyến trùng nốt sưng với một số bệnh hại khác trên cây trồng biểu hiện khi cả 2 tác nhân cùng xuất hiện gây bệnh thì cây trồng bị bệnh rất nặng, bị huỷ diệt nhanh chóng và tuyến trùng nội kí sinh không di ñộng (Meloidogyne spp.) giữ vai trò quyết ñịnh mối quan hệ cùng gây bệnh ñó (Pitcher, 1978) [47]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............8 Ngoài tác ñộng gây hại chính tạo vết thương cơ giới, tuyến trùng còn tạo ñiều kiện thúc ñẩy nhanh quá trình xâm nhập, kí sinh và phát triển của nấm làm tăng mối quan hệ gây bệnh và khả năng mẫn cảm của cây trồng. Sự phân giải các axitamin của hệ thống men tuyến trùng rất phù hợp cho sự phát triển của nấm bệnh, thu hút nấm bệnh xâm nhập qua các rễ sinh trưởng. ðồng thời trong quá trình thực hiện kí sinh vào rễ cây trồng nấm S. rolfsii xâm nhập tốt hơn khi có sẵn vết thương do tuyến trùng gây ra và quá trình kí sinh gây bệnh của nấm ñã thúc ñẩy những thay ñổi sinh hoá xảy ra trong tế bào thực vật qua quá trình sử dụng thức ăn của TTNS, vì vậy cây bị bệnh suy yếu nhanh chóng (Inagaki & Powell, 1969) [37]. Khi tuyến trùng nốt sưng tồn tại cùng với các nguyên nhân gây bệnh khác thì làm cho cây héo và chết rất nhanh. Kết quả nghiên cứu của Porter và Powell (1967) [48] ñã chỉ ra rằng giống thuốc lá chống ñược bệnh héo do nấm Fusarium oxysporum Schlect. nhưng khi ñã bị nhiễm TTNS thì cũng bị nhiễm loại nấm này chỉ sau 2 tuần lây. Khi lây bệnh với nấm F. oxysporum sau khi lây M. incognita 3 tuần và 3 tuần tiếp theo thì lây nấm Alternaria tenuis làm 70% số lá bị bệnh và làm giống này trở lên mẫn cảm với nấm A. tenuis cùng với TTNS M. incognita (Powell và Batten, 1971) [49]. TTNS cũng là nguyên nhân dẫn ñến bệnh héo rũ khoai tây cùng với vi khuẩn Pseudomonas solanacerum Smith ở vùng Lima Perum (Hooker, 1981) [36]. Bệnh hỗn hợp giữa tuyến trùng nốt sưng M. incognita và nấm F. oxysporum gây giảm năng suất ñáng kể trên cây ñậu xanh Vigna radiate. (Akhtar Haseeb, 2005) [24]. Bệnh hỗn hợp giữa TTNS và nấm Fusarium trên cà phê ñược phát hiện lần ñầu tiên năm 1974 tại Costa Rica. Bệnh chủ yếu do loài tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne arabicida và nấm F. oxysporum gây ra, ngoài ra còn phát hiện cả loài tuyến trùng M. exigua. Chúng gây ra triệu chứng cây giảm sút chiều cao và phần vỏ sát mặt ñất bị bần hoá (Bertrand et al, 2000) [26]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ............9