Tài liệu Nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất của chitinase từ mủ cây cao su hevea brasiliensis

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN -----------------------*****--------------------- NGUYEÃN QUANG NHAÂN NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN, TINH SAÏCH VAØ XAÙC ÑÒNH TÍNH CHAÁT CUÛA CHITINASE TÖØ MUÛ CAÂY CAO SU HEVEA BRASILIENSIS Chuyeân ngaønh: Hoaù sinh Maõ soá: 1.07.05 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: PGS. TS. NGUYEÃN ANH DUÕNG THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH - 2009 LÔØI CAÛM ÔN Ñeå coù ñöôïc nhö ngaøy hoâm nay, ngoaøi söï noã löïc cuûa baûn thaân, toâi ñaõ nhaän ñöôïc bieát bao söï quan taâm, chaêm soùc, daïy doã vaø giuùp ñôõ cuûa cha meï, thaày coâ vaø baïn beø. Tröôùc heát em xin baøy toû loøng bieát ôn chaân thaønh vaø saâu saéc ñeán Thaày PGS. TS. Nguyeãn Anh Duõng. Thaày luoân höôùng daãn, quan taâm vaø taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát cho em ñeå em coù theå hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn caùc thaày coâ trong Boä moân Sinh hoùa Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân vaø Boä moân Sinh hoïc Thöïc vaät Tröôøng Ñaïi hoïc Taây Nguyeân. Caùc thaày coâ luoân ñoäng vieân vaø taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát cho em trong suoát thôøi gian laøm ñeà taøi. Toâi cuõng xin caùm ôn nhöõng ngöôøi baïn ñaõ luoân giuùp ñôõ vaø ñoäng vieân toâi raát nhieàu, ñaëc bieät laø baïn Traàn Quoác Tuaán, baïn Nguyeãn Vaên Boán, chò Trònh Thò Bích Ngoïc, chò Nguyeãn Kim Ngaân. Toâi xin caûm ôn caùc baïn, caùc em laøm vieäc taïi boä moân Sinh hoùa vaø boä moân Sinh hoïc Thöïc vaät ñaõ giuùp ñôõ toâi trong quaù trình laøm thí nghieäm. Toâi xin caûm ôn anh Sôn cuøng caùc anh chò laøm vieäc taïi phoøng Kyõ thuaät, noâng tröôøng Phuù Xuaân, TP Buoân Ma Thuoät ñaõ nhieät tình giuùp ñôõ toâi trong quaù trình laáy maãu taïi noâng tröôøng. Cuoái cuøng, con xin baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán Ba Maù vaø Anh Chò Hai. Ba Maù vaø Anh Chò vaãn luoân quan taâm, chaêm soùc, ñoäng vieân vaø laø choã döïa tinh thaàn cho con, cho em. Moät laàn nöõa toâi xin caûm ôn taát caû moïi ngöôøi, xin nhaän ôû nôi toâi loøng bieát ôn chaân thaønh vaø lôøi chaøo traân troïng nhaát. Thaønh phoá Hoà Chí Minh, thaùng 09 naêm 2009 NGUYEÃN QUANG NHAÂN -i- MUÏC LUÏC Trang LÔØI CAÛM ÔN ................................................................................................................................ i DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT ............................................................................................ ii DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU .................................................................................................iii DANH MUÏC CAÙC HÌNH ............................................................................................................ iv DANH MUÏC CAÙC ÑOÀ THÒ .......................................................................................................... v LÔØI MÔÛ ÑAÀU .............................................................................................................................. vi Phaàn I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU ................................................................................................. 1 I.1. Sô löôïc veà chitin vaø chitinase ................................................................................................. 1 I.1.1. Chitin ................................................................................................................................... 1 I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14)........................................................................................................ 5 I.1.2.1. Phaân loaïi chitinase............................................................................................................ 6 I.1.2.2. Caùc nguoàn thu nhaän enzyme chitinase.............................................................................. 9 I.1.2.3. Caùc ñaëc tính cô baûn cuûa enzyme chitinase ..................................................................... 12 I.1.2.4. Caùc loaïi cô chaát cuûa enzyme chitinase ........................................................................... 15 I.1.2.5. Cô cheá taùc ñoäng cuûa caùc loaïi enzyme chitinase ............................................................. 16 I.1.2.6. ÖÙng duïng cuûa chitinase .................................................................................................. 17 I.2. Caây cao su Hevea brasiliensis vaø chitinase trong muû cao su................................................. 20 I.2.1. Caây cao su ......................................................................................................................... 20 I.2.2. Muû cao su .......................................................................................................................... 24 I.2.3. Hevamin ............................................................................................................................ 32 Phaàn II: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP .................................................................................. 37 II.1. Vaät lieäu................................................................................................................................ 37 II.2. Phöông phaùp ........................................................................................................................ 37 II.2.1. Phöông phaùp ly taâm muû thu nhaän lutoid ........................................................................... 37 II.2.2. Keát tuûa protein baèng dung moâi höõu cô ............................................................................ 38 II.2.3. Keát tuûa protein baèng muoái trung tính .............................................................................. 38 II.2.4. Thaåm tích ......................................................................................................................... 39 II.2.5. Xaùc ñònh haøm löôïng protein hoøa tan theo phöông phaùp Lowry ....................................... 40 II.2.6. Xaùc ñònh hoaït ñoä chitinase theo phöông phaùp ñònh löôïng ñöôøng khöû vôùi thuoác thöû DNS.... ................................................................................................................................................... 42 II.2.7. Tinh saïch enzyme baèng phöông phaùp loïc gel Sephadex ................................................. 45 II.2.8. SDS-PAGE ...................................................................................................................... 46 II.2.9. Xaùc ñònh nhieät ñoä toái öu cho hoaït tính chitinase ............................................................. 50 II.2.10. Xaùc ñònh pH toái öu cho hoaït tính chitinase .................................................................... 50 II.2.11. Xaùc ñònh noàng ñoä cô chaát toái öu cho hoaït tính chitinase ................................................ 51 II.2.12. AÛnh höôûng cuûa ion kim loaïi ........................................................................................... 51 Phaàn III: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN ...................................................................................... 52 III.1. Quy trình taùch chieát, thu nhaän chitinase thoâ töø muû cao su.................................................. 52 III.1.1. Quy trình ly taâm taùch muû, thu hoài lutoid vaø phaù vôõ lutoid ñeå giaûi phoùng chitinase............. .................................................................................................................................................... 52 III.1.2. Quy trình tuûa ñeå thu nhaän chitinase thoâ .......................................................................... 52 III.1.2.1. Tuûa baèng coàn ñeå thu nhaän chitinase thoâ....................................................................... 52 III.1.2.2. Tuûa baèng acetone ñeå thu nhaän chitinase thoâ................................................................ 54 III.1.2.3.Tuûa baèng muoái ammonium sulfate ñeå thu nhaän chitinase thoâ ....................................... 55 III.2. Quy trình tinh saïch chitinase baèng phöông phaùp loïc gel Sephadex ................................... 58 III.2.1. Haøm löôïng protein vaø hoaït tính chitinase tröôùc loïc gel .................................................. 58 III.2.2. Keát quaû ño OD 280nm caùc phaân ñoaïn loïc gel ôû 3 gioáng cao su..................................... 59 III.2.3. Haøm löôïng protein vaø hoaït tính chitinase sau loïc gel ..................................................... 61 III.2.4. Hieäu suaát haøm löôïng protein vaø hoaït tính chitinase thu ñöôïc qua loïc gel....................... 63 III.2.5. Hieäu suaát thu hoài chitinase töø muû cao su......................................................................... 63 III.2.6. Keát quaû ñieän di SDS-PAGE caùc gioáng cao su qua loïc gel ............................................. 64 III.3. Xaùc ñònh caùc tính chaát cuûa chitinase ................................................................................. 67 III.3.1. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä .................................................................................................. 67 III.3.2. AÛnh höôûng cuûa pH .......................................................................................................... 69 III.3.3. Ảnh hưởng của noàng ñoä cô chaát ...................................................................................... 71 III.3.4. Aûnh höôûng cuûa caùc ion kim loaïi...................................................................................... 73 III.3.5. Quy trình thu nhaän enzyme chitinase töø muû cao su......................................................... 76 Phaàn IV: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ .......................................................................................... 78 IV.1. Keát luaän ............................................................................................................................. 78 IV.2. Ñeà nghò .............................................................................................................................. 78 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO ........................................................................................................... 80 PHUÏ LUÏC ................................................................................................................................... 84 DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT ΔOD Bieán thieân maät ñoä quang BSA Bovine serum albumin, albumin boø Dd Dung dòch DNS acid 3,5-dinitrosalicylic GlcNAc N-Acetyl-β-D-Glucosamine HT Hoaït tính HTR Hoaït tính rieâng Latex Muû cao su Laticifer Teá baøo caây chöùa nhöïa muû NAGase β-N-Acetylglucosaminidase OD Maät ñoä quang hoïc Serum Dòch loûng trong muû cao su UI Ñôn vò hoaït ñoä (International Unit - ñôn vò quoác teá) - ii - DANH MUÏC CAÙC BAÛNG BIEÅU BAÛNG Trang Baûng 3.1: Haøm löôïng, hoaït tính vaø hoaït tính rieâng chitinase khi tuûa baèng coàn .......................... 53 Baûng 3.2: Haøm löôïng, hoaït tính vaø hoaït tính rieâng chitinase khi tuûa baèng acetone ................... 54 Baûng 3.3: Haøm löôïng, hoaït tính, hoaït tính rieâng chitinase tuûa baèng (NH4)2SO4 ........................ 55 Baûng 3.4: So saùnh caùc taùc nhaân tuûa vôùi cuøng löôïng maãu ban ñaàu .............................................. 57 Baûng 3.5: Haøm löôïng vaø hoaït tính chitinase cuûa 3 gioáng cao su tröôùc loïc gel............................ 58 Baûng 3.6: Haøm löôïng vaø hoaït tính chitinase cuûa 3 gioáng cao su sau loïc gel .............................. 62 Baûng 3.7: Hieäu suaát haøm löôïng protein vaø hoaït tính chitinase qua loïc gel................................. 63 Baûng 3.8: Hieäu suaát thu hoài chitinase töø muû cao su .................................................................... 64 Baûng 3.9: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa chitinase ôû gioáng GT1 ............................. 67 Baûng 3.10: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa chitinase ôû gioáng PB235 ........................ 67 Baûng 3.11: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa chitinase ôû gioáng RRIM600................... 68 Baûng 3.12: AÛnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa chitinase ôû gioáng GT1 .................................... 69 Baûng 3.13: AÛnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa chitinase ôû gioáng PB235 ................................ 70 Baûng 3.14: AÛnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính cuûa chitinase ôû gioáng RRIM600 ........................... 70 Baûng 3.15: AÛnh höôûng cuûa nồng độ cơ chất leân hoaït tính chitinase ôû gioáng GT1....................... 72 Baûng 3.16: AÛnh höôûng cuûa nồng độ cơ chất leân hoaït tính chitinase ôû gioáng PB235 ................... 72 Baûng 3.17: AÛnh höôûng cuûa nồng độ cơ chất leân hoaït tính chitinase ôû gioáng RRIM600 .............. 72 Baûng 3.18: AÛnh höôûng cuûa ion kim loaïi leân hoaït tính chitinase gioáng GT1 ............................... 74 Baûng 3.19: AÛnh höôûng cuûa ion kim loaïi leân hoaït tính chitinase gioáng PB235............................ 75 Baûng 3.20: AÛnh höôûng cuûa ion kim loaïi leân hoaït tính chitinase gioáng RRIM600....................... 75 - iii - DANH MUÏC CAÙC HÌNH HÌNH Trang Hình 1.1: Caáu truùc cuûa chitin ........................................................................................................ 1 Hình 1.2: Caáu truùc chuoãi α-chitin ................................................................................................. 2 Hình 1.3: Caây cao su Hevea brasiliensis ..................................................................................... 22 Hình 1.4: Hình chuïp muû cao su döôùi kính hieån vi ñieän töû ........................................................... 27 Hình 1.5: Caáu truùc cuûa hevamine ............................................................................................... 33 Hình 1.6: Caáu truùc baäc 2 cuûa hevamine A .................................................................................. 34 Hình 1.7: Caáu truùc TIM barrel ôû hevamine................................................................................ 35 Hình 2.1: Phaûn öùng phaân caét chitin baèng chitinase ..................................................................... 42 Hình 2.2: Phaûn öùng cuûa ñöôøng khöû vôùi thuoác thöû DNS .............................................................. 42 Hình 3.1: Khối lượng phân tử của các protein trong các mẫu thô và mẫu tinh của 3 giống cao su.. 65 Hình 3.2: Sô ñoà quy trình sô boä thu nhaän chitinase töø muû cao su Hevea brasiliensis .................. 77 - iv - DANH MUÏC CAÙC ÑOÀ THÒ ÑOÀ THÒ Trang Ñoà thò 3.1: Keát quaû ño OD 280nm caùc oáng loïc gel cuûa gioáng cao su GT1.................................. 60 Ñoà thò 3.2: Keát quaû ño OD 280nm caùc oáng loïc gel cuûa gioáng cao su PB235 .............................. 60 Ñoà thò 3.3: Keát quaû ño OD 280nm caùc oáng loïc gel cuûa gioáng cao su RRIM600 ......................... 61 Ñoà thò 3.4: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính chitinase ôû gioáng GT1................................... 67 Ñoà thò 3.5: AÛnh höôûng cuûa pH leân hoaït tính chitinase ôû gioáng GT1 ........................................... 69 Ñoà thò 3.6: AÛnh höôûng cuûa nồng độ cơ chất leân hoaït tính chitinase ôû gioáng GT1 ....................... 71 Ñoà thò 3.7: AÛnh höôûng cuûa ion kim loaïi leân hoaït tính chitinase gioáng PB235 .......................... 74 -v- LÔØI MÔÛ ÑAÀU Chitin laø thaønh phaàn chính trong thaønh teá baøo naám vaø voû ngoaøi cuûa coân truøng, giaùp xaùc. Chitin bò phaân caét bôûi chitinase taïo thaønh caùc saûn phaåm coù Nacetylglucosamine vaø oligomer N-acetyl-glucosamine coù nhieàu öùng duïng trong y döôïc hoïc, noâng nghieäp. Ngoaøi ra, chitin coøn coù theå ñöôïc duøng trong thuoác tröø naám, tröø saâu beänh, coân truøng sinh hoïc vaø khoâng gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Vieät nam ñang laø nöôùc nuoâi troàng, cheá bieán vaø xuaát khaåu thuûy saûn haøng ñaàu chaâu AÙ. Saûn löôïng toâm cuûa Vieät nam haèng naêm hôn 1.000.000 taán. Ñaây laø nguoàn nguyeân lieäu doài daøo ñeå saûn xuaát chitin, chitosan vaø caùc saûn phaåm khaùc coù giaù trò. Vì vaäy vieäc söû duïng chitinase ñeå taän duïng nguoàn chitin khoång loà thaûi ra töø coâng nghieäp cheá bieán thuûy saûn vöøa giaûm oâ nhieãm moâi tröôøng vöøa taïo thaønh caùc saûn phaåm coù ích coù yù nghóa khoa hoïc vaø thöïc tieãn cao. Chitinase coù theå thu nhaän töø thöïc vaät, ñoäng vaät (tuyeán tieâu hoùa cuûa caù, möïc) vaø vi sinh vaät (Aspergillus fumigatus, Bacillus sp.). Tuy nhieân vieäc saûn xuaát chitinase ñaët bieät laø chitinase tinh saïch ñoøi hoûi nhieàu ñaàu tö veà voán laãn veà maët kyõ thuaät vaø toán nhieàu coâng söùc. Cho neân hieän nay vieäc saûn xuaát enzyme naøy coøn nhieàu haïn cheá vaø giaù thaønh cuûa chitinase treân thò tröôøng laø raát ñaét. Theo moät soá nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy trong muû cuûa caây cao su coù chöùa moät loaïi chitinase goïi laø hevamine. ÔÛ Vieät Nam, dieän tích troàng caây cao su hieän nay khoaûng hôn 500.000ha vaø trong thôøi gian tôùi coù theå taêng leân 800.000ha, ñaây laø moät nguoàn cung caáp chitinase ñaày tieàm naêng vaø reû tieàn. Ñeà taøi naøy höôùng tôùi muïc tieâu taùch chieát, tinh saïch, xaùc ñònh tính chaát vaø tieán ñeán moâ hình hoùa vieäc söû duïng enzyme hevamine trong thuûy phaân chitin ñeå thu nhaän Nacetylglucosamine vaø oligomer cuûa chuùng. Hieän nay, chöa coù caùc ñeà taøi trong nöôùc nghieân cöùu veà chitinase töø muû cao su hay hevamine. Do ñoù, thaønh coâng cuûa ñeà taøi naøy seõ goùp phaàn môû ra moät höôùng môùi trong vieäc saûn xuaát chitinase ôû Vieät Nam, moät enzyme coù nhieàu öùng duïng quan troïng. - vi - -1- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Phaàn I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU I.1. SÔ LÖÔÏC VEÀ CHITIN VAØ CHITINASE I.1.1. Chitin • Caáu taïo chitin Chitin coù coâng thöùc hoùa hoïc (C8H13NO5)n trong ñoù C chieám 47,29%, H chieám 6,45%, N chieám 6,89% vaø O chieám 39,37%. ÔÛ daïng töï nhieân, chitin laø moät chaát raén maøu traéng voâ ñònh hình, dai, coù sôïi, phuï thuoäc vaøo nguoàn goác vaø phöông phaùp thu nhaän. Veà caáu truùc, chitin (coøn goïi laø poly-[1,4-(N-acetyl-β-D-glucosamine)]) laø moät polysaccharide bao goàm caùc goác N-acetyl-D-glucosamine [GlcNAc, coøn goïi laø (1->4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose] gaén vôùi nhau baèng lieân keát β-1,4O-glycoside. Hình 1.1: Caáu truùc cuûa chitin Veà maët caáu truùc laäp theå, chitin coù 3 daïng: α, β, δ. Söï khaùc nhau naøy bieåu hieän ôû söï saép xeáp caùc chuoãi. ÔÛ α-chitin caùc chuoãi xuoâi vaø ngöôïïc xen keõ nhau, ôû Nguyeãn Quang Nhaân -2- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu β-chitin thì cuøng höôùng vaø ôû δ-chitin coù 2 chuoãi xuoâi xen keõ vôùi 2 chuoãi ngöôïc. Daïng chieám nhieàu nhaát laø α-chitin. Hình 1.2: Caáu truùc chuoãi α-chitin • Phaân boá vaø soá löôïng Chitin coù maët ôû nhieàu nhoùm sinh vaät khaùc nhau. ÔÛ naám, chitin laø thaønh phaàn chính yeáu vaø keát hôïp vôùi caùc hôïp chaát khaùc taïo ra thaønh cuûa khuaån ty vaø baøo töû naám sôïi nhö: Chytridiaceae, Blastodiaceae, Ascomycetes, Basidiomycetes. ÔÛ nhöõng loaøi ñoäng vaät khoâng xöông soáng nhö: Crustacea (giaùp xaùc), Onychophora (nhoùm coù moùng), Myriapoda (ña tuùc) vaø Arachnida (nheän), chitin ñoùng vai troø laø boä xöông ngoaøi döôùi daïng phöùc hôïp chitin-protein. Tæ leä chitin : protein thoâng thöôøng khoaûng 55 : 45 vaø tæ leä naøy thay ñoåi trong suoát quaù trình phaùt trieån vaø khaùc nhau giöõa caùc loaøi. ÔÛ Insecta (coân truøng), chitin laø voû boïc cô theå vaø maøng bao chaát dinh döôõng. Ngoaøi ra, chitin coøn coù ôû taûo luïc vaø nhuyeãn theå (Mollusca), truøng ñoát (Annelida), ruoät khoang (Coelenterata-Cnidaria). ÔÛ caùc loaøi thöïc vaät, chitin vaø ñöôøng amin ñoùng vai troø khoâng quan troïng trong quaù trình trao ñoåi chaát hay veà caáu truùc hình thaùi. Veà soá löôïng, chitin laø moät trong ba loaïi polysaccharide phong phuù nhaát trong thieân nhieân (cellulose, tinh boät vaø chitin). Chitin laø ñöùng ôû vò trí thöù hai sau cellulose. Chitin vaø cellulose töông öùng vôùi nhau veà nhieàu ñieåm veà caáu taïo vaø Nguyeãn Quang Nhaân -3- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu chöùc naêng. Veà chöùc naêng, chitin vaø cellulose ñeàu laø nhöõng polysaccharide caáu truùc. Veà caáu truùc phaân töû, chitin coù caáu truùc töông töï cellulose ngoaïi tröø nhoùm OH ôû C2 ñöôïc thay theá baèng moät nhoùm acetylamine. Chitin coù theå thay theá moät phaàn hay toaøn boä cellulose hoaëc glucan trong thaønh teá baøo naám vaø vaøi loaïi taûo. • Ñaëc ñieåm khaùc Chitin khoâng tan trong nöôùc, dung dòch kieàm loaõng vaø thuoác thöû Schweitzer. Chitin coù theå tan trong moät soá dung dòch nhö HCl ñaäm ñaëc, HNO3, acid fomic khan vaø moät soá muoái trung tính. Neáu ñun noùng chitin trong dung dòch kieàm maïnh, moät phaàn nhoùm N-acetyl bò khöû (deacetyl hoùa) taïo thaønh chitosan. Ngöôïc laïi, trong dung dòch HCl ñaäm ñaëc, quaù trình thuûy phaân chitin xaûy ra ôû caùc noái β -1,4-glycoside laøm [ α]D töø -14o daàn ñoåi sang +56o, sau ñoù laø söï thay ñoåi ôû caùc nhoùm acetyl. Ñoä nhôùt cuûa chitin trong dung dòch acid nitric laø 14,3.10-3 ñoái vôùi chitin nguyeân chaát töø voû cua, 13,1.10-3 ñoái vôùi chitin töø naám. Caùc giaù trò naøy xaáp xæ nhö nhau chöùng toû troïng löôïng cuûa chuùng gaàn nhö nhau. Trong vieäc ñònh tính cuõng nhö so saùnh chitin töø nhöõng nguoàn thöïc vaät, ñoäng vaät khaùc nhau, phöông phaùp nhieãu xaï tia X coù leõ laø phöông phaùp vaät lyù duy nhaát coù yù nghóa vaø coù giaù trò. Trong khi ñoù, caùc phöông phaùp ñònh löôïng chitin ñeàu coù ñoä chính xaùc giôùi haïn, nhöõng ñieàu kieän caàn thieát cho vieäc tinh cheá chitin coù khaû naêng laøm thay ñoåi polysaccharide naøy, vì vaäy khoù ñaït ñöôïc chitin tinh khieát. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coù theå taïo thaønh chitin töø Uridin-diphosphate-N-acetylD-Glucosamine nhôø enzyme chitin synthetase (EC 2.4.1.16) trích töø naám. • ÖÙng duïng Vôùi kyõ thuaät cheá bieán hieän ñaïi, chitin vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng coù moät tieàm naêng to lôùn ñaëc bieät laø trong caùc lónh vöïc nhö y sinh hoïc, dinh döôõng, cheá bieán thöïc phaåm, döôïc phaåm, vi sinh, noâng nghieäp vaø myõ phaåm. Nguyeãn Quang Nhaân -4- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Chitin coù theå öùng duïng laøm chaát phuï gia trong thöïc phaåm, taïo ñoä beàn dai cho thöïc phaåm thay theá moät soá chaát khoâng cho pheùp (nhö haøn the…). Chitin laøm chaát mang trong coá ñònh enzym hay coá ñònh teá baøo, laøm chaát mang taïo caùc giaù theå troàng caây caûnh. Coøn chitosan, daãn xuaát cuûa chitin, coù ñoä beàn dai, ñaøn hoài, coù theå taïo thaønh caùc maøng moûng gaàn nhö trong suoát, söû duïng caùc maøng chitosan ñeå baûo quaûn caùc loaïi traùi caây, laøm maøng bao thuoác, maøng bao thöïc phaåm (thòt nguoäi, laïp xöôûng…) coøn laøm nguyeân lieäu ñeå coá ñònh enzyme hay coá ñònh teá baøo vi sinh vaät. Chitosan ñöôïc ñaùnh giaù cao trong haøng loaït nhöõng öùng duïng trong y hoïc nhö: baêng boù vaø laøm laønh veát thöông, maøng thaåm tích, chæ khaâu veát thöông töï tieâu huyû, nhaân toá oån ñònh liposome, dieät vi khuaån, dieät virus, choáng ung thö, chaát laøm giaûm löôïng cholesterol trong maùu, chaát kích thích cuûa heä thoáng mieãn dòch. Söï phaân huûy töï nhieân cuûa chitin raát quan troïng khoâng chæ trong chu trình tuaàn hoaøn cuûa carbon vaø nitô maø coøn taïo ra caùc chaát phaûn öùng hoùa hoïc quan troïng. Caùc ñôn phaân cuûa chitin vaø chitosan laø N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) vaø glucosamine (GlcN), laø nhöõng taùc nhaân chöõa beänh vieâm khôùp xöông maõn tính, vieâm ruoät vaø vieâm daï daøy [15]. Caùc oligomer coù nguoàn goác töø chitin cuõng coù hoaït tính khaùng khoái u, khaùng naám, khaùng khuaån, laø thaønh phaàn taïo neân glycolipid vaø glycoprotein coù vai troø quan troïng trong sinh hoïc vaø nhieàu öùng duïng khaùc. Haøng ngaøn baøi baùo veà chitin vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng ñaõ ñöôïc xuaát baûn cuøng vôùi khoaûng gaàn 200 baèng saùng cheá ñaõ ñöôïc löu haønh taïi Myõ. Caùc coâng trình nghieân cöùu vaø baèng saùng cheá veà caùc cheá phaåm naøy cuõng ñaõ xuaát hieän ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi. Caùc nhaø khoa hoïc töø haøng chuïc nöôùc treân theá giôùi trong ñoù coù Myõ vaø Nga ñaõ taäp trung laïi 3 naêm moät laàn ñeå trao ñoåi caùc baøi baùo, nghieân cöùu khoa hoïc môùi nhaát veà chitin vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng. Nhöõng ñieàu ñoù cho Nguyeãn Quang Nhaân -5- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu thaáy chitin vaø caùc daãn xuaát cuûa chuùng raát ñöôïc quan taâm treân theá giôùi vì khaû naêng öùng duïng raát roäng cuøng vôùi nhöõng ñaëc tính ñaëc bieät cuûa chuùng. Haøng naêm chitin ñöôïc saûn xuaát ra khoaûng 5,11 trieäu taán treân toaøn theá giôùi. Nhaät vaø Myõ laø nhöõng nöôùc saûn xuaát chitin lôùn nhaát. ÔÛ Vieät Nam, chitin chuû yeáu laø pheá phuï lieäu daïng raén vôùi soá löôïng khoång loà ñöôïc thaûi ra haèng ngaøy töø ngaønh coâng nghieäp cheá bieán vaø xuaát khaåu thuûy haûi saûn. Voû cuûa toâm (toâm huøm, toâm theû), cua vaø caùc loaøi giaùp xaùc treân bieån laø nguoàn cung caáp chitin toát nhaát. Trong voû toâm cua, chitin chieám töø 20-50% troïng löôïng khoâ, khoaûng 12% trong toâm nöôùc ngoït, coøn laïi laø caùc chaát voâ cô, chuû yeáu laø carbonate calci. Neáu taän duïng ñöôïc nguoàn cung caáp chitin naøy thì vöøa giaûm thieåu oâ nhieãm moâi tröôøng, vöøa taïo thaønh caùc saûn phaåm thöïc söï coù giaù trò. I.1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) Chitinase (coøn goïi laø [poly β-1,4-(2-acetamido-2-deoxy)-D-glucosid glucanohydrolase]) laø enzyme thuûy phaân chitin thaønh caùc ñôn phaân Nacetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose qua vieäc xuùc taùc söï thuûy giaûi lieân keát β-1,4-glycoside giöõa C1 vaø C4 cuûa hai phaân töû N-acetylglucosamine lieân tieáp nhau trong chitin. Enzyme naøy coù ôû nhieàu loaøi khaùc nhau nhö thöïc vaät, ñoäng vaät khoâng xöông soáng, ñoäng vaät coù vuù, coân truøng, chaân khôùp, naám, vi khuaån vaø virus. Chaân khôùp vaø naám caàn chitinase trong söï phaân chia teá baøo ñeå taêng tröôûng. Chitinase ñöôïc taïo thaønh trong suoát quaù trình sinh tröôûng cuûa naám. Ñoái vôùi naám sôïi, chitinase tham gia nhieàu chöùc naêng nhö phaân giaûi thaønh teá baøo, naûy maàm baøo töû, phaùt trieån khuaån ty vaø töï phaân khuaån ty, bieät hoùa baøo töû, ñoàng hoùa chitin vaø kyù sinh. ÔÛ vi khuaån, chitinase ñöôïc taïo ra ñeå söû duïng chitin laøm nguoàn carbon vaø Nguyeãn Quang Nhaân -6- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu naêng löôïng. ÔÛ thöïc vaät, chitinase laø moät phaàn cuûa phaûn öùng choáng laïi söï xaâm nhieãm vaø stress, phoái hôïp hoaït ñoäng vôùi caùc protein phoøng veä khaùc [9]. Chitinase thöông phaåm coù giaù raát ñaét, ñaëc bieät laø chitinase ñaõ tinh saïch. Vì theá vieäc söû duïng enzyme thoâ trôû thaønh thay theá thuù vò trong vieäc taïo ra GlcNAc vaø caùc oligomer coù nguoàn goác chitin [15]. I.1.2.1. Phaân loaïi chitinase • Döïa vaøo caáu truùc phaân töû: Chitinase ñöôïc saép xeáp vaøo 2 hoï Glycohydrolase (enzyme thuûy phaân ñöôøng): - Hoï glycohydrolase 18: laø hoï chitinase lôùn nhaát vôùi khoaûng 180 chi, coù caáu truùc xaùc ñònh goàm 8 xoaén α/β cuoän troøn, ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu loaïi sinh vaät nhö vi khuaån, naám, thöïc vaät, coân truøng, höõu nhuõ vaø virus. Hoï naøy bao goàm chuû yeáu laø enzyme chitinase, ngoaøi ra coøn coù caùc enzyme khaùc nhö chitodextrinase, chitobiase vaø N-acetylglucosaminidase. Trong hoï naøy, chitinase töø caùc prokaryote chæ coù 2 motif trình töï ngaén ñöôïc baûo toàn cao (bao goàm 1 goác acid glutamic ñöôïc baûo toàn) gioáng vôùi enzyme cuûa eukaryote (10% cuûa toaøn boä caùc goác gioáng nhau). Tuy nhieân, caû 2 loaïi chitinase ñeàu coù cuøng domain xuùc taùc barrel (βα)8. Trong caû 2 enzyme, raõnh gaén cô chaát ñeàu naèm ôû ñaàu C cuûa sôïi β trong caáu truùc barrel (βα)8 vaø goác acid glutamic cho proton xuùc taùc coù 1 vò trí töông ñöông. Khoâng gioáng vôùi caùc glycoside hydrolase khaùc, chitinase hoï 18 coù cô cheá phaûn öùng baát thöôøng bao goàm vieäc taùc ñoäng leân nhoùm N-acetyl cuûa cô chaát treân nguyeân töû C anomer. Vieäc naøy daãn ñeán vieäc taïo ra chaát trung gian bao goàm voøng pyranose cuûa glucosamine keát hôïp vôùi voøng 5 oxazoline. Nguyeãn Quang Nhaân -7- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu - Hoï glycohydrolase 19: hoï naøy goàm hôn 130 chi, thöôøng thaáy chuû yeáu ôû thöïc vaät nhö caø chua (Solanum tuberosum), caûi (Arabidopsis thaliana), ñaäu Haø Lan (Pisum sativum), ngoaøi ra coøn coù ôû xaï khuaån Streptomyces griceus, vi khuaån Haemophilus influenzae… Chuùng coù caáu truùc hình caàu coù cuoän gioáng lysozyme (EC 3.2.1.17) cuûa ñoäng vaät vaø phage, bao goàm motif cuoän α + β vaø hoaït ñoäng thoâng qua cô cheá nghòch chuyeån. Thöïc vaät vaø vi sinh vaät nhö Streptomyces taïo chitinase thuoäc caû 2 hoï, trong khi coân truøng vaø haàu heát sinh vaät khaùc chæ taïo chitinase thuoäc hoï glycohydrolase 18. • Döïa vaøo trình töï amino acid: Döïa vaøo trình töï ñaàu amin (N), söï ñònh vò cuûa enzyme, ñieåm ñaúng ñieän, peptid nhaän bieát vaø vuøng caûm öùng, ngöôøi ta phaân loaïi enzyme chitinase thaønh 5 nhoùm: - Nhoùm I: laø nhöõng ñoàng phaân enzyme trong phaân töû coù vuøng ñaàu N giaøu cysteine chöùa khoaûng 40 acid amin (gioáng vôùi vuøng ñaàu N ôû hevein vaø caùc enzyme khaùc coù aùi löïc ñoái vôùi chitin hay N-acetylglucosamine) noái vôùi taâm xuùc taùc thoâng qua moät ñoaïn giaøu glycin hoaëc prolin ôû ñaàu carboxyl (C)(peptid nhaän bieát). Vuøng giaøu cysteine coù vai troø quan troïng ñoái vôùi söï gaén keát enzyme vaø cô chaát chitin nhöng khoâng caàn cho hoaït ñoäng xuùc taùc. Caùc vuøng gaén chitin naøy khoâng phaûi luoân ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc taêng cöôøng hoaït tính xuùc taùc enzyme maø chuùng caàn ñeå taïo caùc ñaëc tính sinh hoïc rieâng bieät cho chitinase ôû nhieàu loaøi khaùc nhau. ÔÛ naám men, vuøng gaén chitin naèm ôû ñaàu C giuùp ñònh vò chitinase treân thaønh teá baøo naám men, ñoùng vai troø trong vieäc phaân taùch teá baøo meï khoûi caùc teá baøo chò em. ÔÛ thuoác laù vaø nhieàu loaøi thöïc vaät khaùc, caùc chitinase naøy naèm trong khoâng baøo vaø ñöôïc caûm öùng töø söï nhieãm naám, vi khuaån hay virus Nguyeãn Quang Nhaân -8- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu [13]. Chitinase nhoùm I cuûa thuoác laù coù vuøng ñaàu C giaøu cystein ñoùng vai troø laø vuøng gaén chitin [24]. - Nhoùm II: laø nhöõng ñoàng phaân enzyme trong phaân töû chæ coù taâm xuùc taùc coù trình töï amino acid töông töï ôû chitinase nhoùm I, thieáu ñoaïn giaøu cysteine ôû ñaàu N vaø peptid nhaän bieát ôû ñaàu C. Chitinase nhoùm II coù ôû thöïc vaät, naám vaø vi khuaån. Chuùng ñöôïc caûm öùng bôûi caùc taùc nhaân beân ngoaøi. ÔÛ thöïc vaät, caùc protein nhoùm II thuoäc loaïi protein khaùng beänh vaø ñöôïc teá baøo tieát ra döôùi nhieàu ñieàu kieän stress khaùc nhau. - Nhoùm III: Trình töï amino acid hoaøn toaøn khaùc vôùi chitinase nhoùm I vaø II, nhöng raát gioáng veà trình töï vôùi lysozyme ôû Hevea brasiliensis, vì theá chuùng mang hoaït tính lysozyme. ÔÛ thöïc vaät, caùc chitinase nhoùm III laø caùc protein khaùng beänh vaø ñöôïc tieát ra ngoaïi baøo. - Nhoùm IV: laø nhöõng ñoàng phaân enzyme chuû yeáu coù ôû laù caây hai laù maàm, 41-47% trình töï amino acid ôû taâm xuùc taùc cuûa chuùng töông töï nhö chitinase nhoùm I vaø khaù gioáng vôùi chitinase vi khuaån. Trong phaân töû cuõng coù ñoaïn giaøu cysteine nhöng kích thöôùc phaân töû nhoû hôn ñaùng keå so vôùi chitinase nhoùm I. - Nhoùm V: döïa treân nhöõng döõ lieäu veà trình töï, ngöôøi ta nhaän thaáy vuøng gaén chitin (vuøng giaøu cysteine) coù theå ñaõ giaûm ñi nhieàu laàn trong quaù trình tieán hoùa ôû thöïc vaät baäc cao. • Döïa vaøo phaûn öùng phaân caét: Enzyme phaân giaûi chitin bao goàm: endochitinase, chitin-1,4-βchitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) vaø chitobiase. Endochitinase laø enzyme phaân caét noäi maïch chitin moät caùch ngaãu nhieân taïo caùc ñoaïn oligosaccharide, ñaõ ñöôïc nghieân cöùu töø dòch chieát moâi tröôøng nuoâi caáy naám moác Trichoderma harzianum (2 loaïi endochitinase: M1=36kDa, pI1=5,3±0,2 vaø M2=40kDa, pI2=3,9), Gliocladium virens (M=41kDa, pI=7,8). Nguyeãn Quang Nhaân -9- Phaàn I: Toång quan taøi lieäu Chitin-1,4-β-chitobiosidase laø enzyme phaân caét chitin (exochitinase) từ đầu không khử taïo thaønh caùc saûn phaåm chính laø caùc chitobiose, cuï theå enzyme naøy ñöôïc thu töø Trichoderma harzianum (M=36kDa, pI=4,4±0,2). N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) (EC 3.2.1.30) laø enzyme phaân caét chitin töø moät ñaàu cho saûn phaåm chính laø caùc monomer N-acetyl-Dglucosamin. Chitobiase laø enzyme phaân caét chitobiose thaønh 2 ñôn phaân N-acetyl-Dglucosamin. Ngoaøi ra, ñoái vôùi chitosan - daãn xuaát deacetyl hoùa cuûa chitin, chitosanase (EC 3.2.2.132) xuùc taùc thuûy phaân chitosan taïo thaønh caùc oligosaccharide töông öùng. I.1.2.2. Caùc nguoàn thu nhaän enzyme chitinase • Chitinase vi khuaån Vi khuaån saûn sinh enzyme chitinase nhaèm ñaùp öùng nhu caàu dinh döôõng. Chuùng thöôøng toång hôïp nhieàu loaïi chitinase ñeå coù theå phaân caét ñöôïc caùc loaïi chitin ña daïng trong töï nhieân. Như vậy, chitinase vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chu trình chitin trong tự nhiên. Enzyme chitinase ñöôïc tìm thaáy trong vi khuaån: Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio vaø ñaëc bieät laø ôû nhoùm Streptomycetes. Enzyme chitinase coù theå laø enzyme caáu truùc hoaëc enzyme caûm öùng. Tuy nhieân trong caùc moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät, ngöôøi ta ñeàu cho theâm chitin-cô chaát cuûa enzyme chitinase ñeå laøm taêng khaû naêng toång hôïp enzyme chitinase, ñoàng thôøi oån ñònh hoaït tính enzyme chitinase sau quaù trình chieát taùch. Vi khuaån Nguyeãn Quang Nhaân - 10 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu toång hôïp enzyme chitinase nhaèm phaân giaûi chitin trong moâi tröôøng taïo nguoàn carbon cho vi khuaån sinh tröôûng, phaùt trieån. • Chitinase naám Chitinase cuõng ñöôïc taïo ra bôûi caùc loaøi naám sôïi. Caùc chuûng naám moác cho enzyme chitinase cao nhö: Trichoderma, Gliocladium, Calvatia, … ñaëc bieät laø ôû caùc loaøi naám lôùn nhö Lycoperdon, Coprinus … Töông töï nhö ôû vi khuaån, enzyme chitinase cuûa naám cuõng ñoùng vai troø quan troïng veà maët dinh döôõng nhöng khaùc laø hoaït ñoäng cuûa chuùng raát linh hoaït trong quaù trình phaùt trieån vaø trong söï phaùt sinh hình thaùi cuûa naám bôûi vì chitin laø thaønh phaàn chính cuûa vaùch teá baøo naám. • Chitinase thöïc vaät Caùc thöïc vaät baäc cao coù khaû naêng taïo enzyme chitinase nhö: cao su (Hevea brasiliensis), thuoác laù (Nicotiana sp), luùa, luùa mì, luùa maïch (Hordeum vulgare), luùa maïch ñen, caø roát, baép caûi, baép, khoai taây, ñaäu Haø Lan, ñaäu naønh, cuû töø … vaø ñaëc bieät moät soá loaøi taûo bieån cuõng laø nguoàn cung caáp enzyme chitinase. Chitinase thöïc vaät toàn taïi chuû yeáu ôû caùc moâ nhaát ñònh hoaëc cô quan sinh saûn nhö haït gioáng, cuû, hoa vaø ñöôïc caûm öùng bôûi coân truøng vaø caùc taùc nhaân gaây haïi treân thöïc vaät. Beân trong teá baøo thöïc vaät, chitinase naèm trong khoâng baøo cuøng vôùi caùc enzyme choáng beänh khaùc. Ví duï caùc endochitinase mang tính base trong laù ñaäu taäp trung trong khoâng baøo vaø coù chöùa haàu heát caùc hoaït tính chitinase noäi baøo. Nhôø vaäy, khoâng baøo thöïc vaät ñöôïc xem töông töï nhö tieâu theå ôû ñoäng vaät. Bôûi vì baûn thaân thöïc vaät khoâng coù chöùa cô chaát cuûa nhöõng enzyme phaân giaûi nhö chitinase vaø β-1,3-glucanase, söï toàn taïi cuûa nhöõng enzyme naøy cho thaáy chuùng coù vai troø khaùng khuaån, khaùng naám kyù sinh gaây beänh vaø caû coân truøng. Caùc protein khaùng khuaån (pathogenesis-related protein) khaùc nhau ñöôïc phaân laäp töø thöïc vaät bao goàm thionin, protein baát hoaït ribosome, defensin, Nguyeãn Quang Nhaân - 11 - Phaàn I: Toång quan taøi lieäu nsLTP vaø caùc enzyme phaân giaûi nhö β-1,3-glucanase vaø chitinase. Nhieàu chitinase, gioáng nhö caùc protein khaùc ñoùng vai troø baûo veä, coù theå chòu ñöôïc caùc protease ngoaïi baøo, hoaëc mang tính acid hoaëc mang tính base (thoâng thöôøng caùc protein mang tính acid ñöôïc tieát vaøo apoplast hoaëc moâi tröôøng ngoaïi baøo, trong khi daïng base thöôøng taäp trung noäi baøo trong caùc khoâng baøo). Trình töï cuûa caùc chitinase acid gioáng vôùi caùc chitinase base, chæ khaùc ôû choã chuùng khoâng coù vuøng ñaàu N hevein. Xeùt veà ñaëc tính phaân caét, chitinase thöïc vaät thöôøng laø endochitinase phaân caét ngaãu nhieân. Moät soá chitinase thöïc vaät coù hoaït tính lysozyme caét lieân keát β1,4 giöõa acid N-acetylmuramic vaø caùc goác N-acetylglucosamine trong peptidoglycan. Ví duï nhö chitinase phaân laäp töø ñu ñuû, Rubus hispidus vaø Parthenocissus quinquefolia. • Chitinase ñoäng vaät Töø moät soá ñoäng vaät nguyeân sinh vaø töø caùc moâ, tuyeán khaùc nhau trong heä tieâu hoùa cuûa nhieàu loaøi ñoäng vaät khoâng xöông: ruoät khoang, giun troøn, thaân meàm, chaân ñoát (ví duï trong dòch ruoät cuûa oác seân Helix aspersa), ta coù theå thu nhaän ñöôïc enzyme chitinase. Ñoái vôùi ñoäng vaät coù xöông soáng, enzyme chitinase ñöôïc tieát ra töø tuyeán tuïy vaø dòch daï daøy cuûa caùc loaøi caù, löôõng cö, boø saùt aên saâu boï, trong dung dòch daï daøy cuûa nhöõng loaøi chim, thuù aên saâu boï. Ngoaøi ra, enzyme chitinase coøn ñöôïc thu nhaän töø dòch bieåu bì cuûa giun troøn trong suoát quaù trình phaùt trieån vaø dòch tieát bieåu bì cuûa caùc loaøi chaân ñoát vaøo thôøi ñieåm thay voû, loät da. Enzyme chitinase giuùp coân truøng tieâu hoùa maøng ngoaøi (cuticle) trong quaù trình bieán thaùi hay loät xaùc. Nguyeãn Quang Nhaân