Tài liệu Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ NGỌC VIỆN NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐA DÒNG ĐẶC HIỆU PHỤC VỤ SẢN XUẤT BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ VI TẢO GÂY MẤT TRÍ NHỚ CHO NGƯỜI (DOMOIC ACID) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HOÀ - 2018 vA DAo rAo TNUOUGDAI HQC I\HATRANG s0 crao DUC * NTU D t H9c r{HA TRA}IG r9t9 lf, Ncec vrEN NGHrtn ctru THU IvHAI\ xnAnc rHn B,q, oduc DAc nrpfpnUcv{rsa,nr xuir Be KIT puAr HrENI{HANH rbvl rAo cAvuAr rnilyHocHtrwctrot bqc (DOMOICACID) LUAN VAI\ THAC SI ^Y- tl Nghnh: Cdng ngh$ sinh hgc Mii 6042A201 s6: I/QD-DHNT ngiy 2l /612017 1 96/QD-DHNT nsiy 09 /3 12018 Quy6t illnh giao aA ta,i: Quy6t itinh thirnh I$p IID: 55 Nghy bfro vQ: fil4l20r8 Nguli hurirrrg Ofin kihoa hgc: r. PGS.TS. vO NGoc BoI 2. TS. oAo vlnr rIA Chu tich trqi OAng: PGS.TS. IYGO UANC NCNIA. Phdng Dho tpo sau il4i hgc: KHANH HOA - 2018 LOI CAM DOAN TOi xin cam doan c16y ld c6ng trinh nghiCn criu cria tdi dugc hodn sU thinh dudi tdi tro cria dA tii: "llghiin cru phdt ffiAn b0 KIT phat hi€n nhanh mQt sti d\c t(i vi tdo trong sdn phdm thrty sdn" do TS. Ddo ViQt Ha ldm chu nhiQm vd t6i le thdnh vi6n tham gia. Cic sti ligu, k6t qui n0u trong lupn v[n ldr trung thyc vi cl6 dugc nhiQm eC tai cho ph6p c6ng b5 trong lufln v[n. Kh6nh Hoi, ngAy 22 thing 3 ndm 2018 Tac giit lupn v[n LG Nggc ViQn 111 chu Lor cAnn oN Pe hoen thAnh LuQn v6n niy Tru6c trtit tOi xin gui t6i Ban Gi6m hiQu Trucrng Dpi hqc Nha Trang, Ban Chil nhiQm Khoa C6ng nghe ThUc phAm vlr Khoa Sau dpi hgc sg kinh trQng, nidm tu hio dugc hqc t?p SU vi nghiOn cuu t4i Trudrng trong nhirng ndm qua. bi6t crn sAu s[c nh6t t6i xin dugc gidnh cho thAy: PG.TS. Vfr Ngqc BQi - Trucrng khoa C6ng nghe ThUc phAm vi TS. Dio ViQt He - Ph6 Vien trucrng - Vien Hii ducrng hqc Nha Trang dd tpn tinh hucrng d6n vd dQng vi6n t6i trong sr5t qu6 trinh thyc hien lufln v6n. Xin ch6n thdnh citmcrn TS. Ddo ViCt HA - chu nhiQm dA tii c6p Nhd nudc "NghiAn c*u phdt ffiAn bQ KIT phdt hi€n nhanh mQt sd dpc t() vi tdo trong san phdm thfiy sdn" dA tei ffq kinh phi, cho ph6p t6i dugc tham gia de tdi vd su dpng sti tgr', nghiCn ciru trong b6o cito 1u0n vdn. Xin gui ldi cim on sflu sic dtin Ban Gi6m d6c Trung t6m Phrip y Kh6nh Hoi, dd tao di6u kiQn vdr cho ph6p t6i dugc di hqc d€ ndng cao trinh dQ. Xin c6m cm quy thAy c6 gi6o trong ViQn Cdng nghe Sinh hqc Mdi truong - Trucrng Dpi hgc Nha Trang, cic cin b0 - phdng Hoa sinh - Vien H6i ducrng hqc Nha Trang dd tpn tinh giirp dd vi tao diOu kiQn cho t6i trong s.r6t thoi gian thUc hien de tai trong thdi gian vtra qua. Xin c6m crn c6c th6y cO phin biQn dd cho t6i nhfmg loi khuy6n quf b6u d€ c6ng trinh nghiCn ciru dugc hoin thenh c6 ch6t luqmg. Dac biQt xin dugc ghi nhd tinh cdm, sg giirp dd cua gia dinh vd bpn bd lu6n ludn chia se kip thdi ctng t6i trong qu6 trinh nghiOn cuu. Kh6nh Hoi, ngey 22 thdng 3 ndm 2018 T6c gril luQn vdn L0 Nggc ViQn 1V MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... iii LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iv MỤC LỤC ...................................................................................................................... v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... ix DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ x LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 5 1.1. ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH POISONING - ASP) ....................................................................................................... 5 1.1.1. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP ...................................................... 6 1.1.2. Độc tính của DA ................................................................................................... 7 1.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ VI TẢO ............................................. 8 1.2.1. Thử nghiệm sinh học trên động vật ...................................................................... 8 1.2.2. Phương pháp hoá học............................................................................................ 9 1.2.3. Phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào ............................................... 10 1.2.4. Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................... 13 1.3. HƯỚNG NGHIÊN CỨU VỀ MIỄN DỊCH HỌC ĐỘC TỐ DOMOIC ACID ..... 14 1.3.1. Điều chế phức hợp kháng nguyên từ domoic acid.............................................. 14 1.3.2. Quy trình gây miễn dịch ..................................................................................... 20 1.3.3. Thu nhận kháng thể từ liệu pháp miễn dịch động vật ......................................... 23 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 30 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 30 2.2.1. Tạo kháng thể trên đối tượng sinh vật thử nghiệm ............................................. 30 2.2.2. Thu nhận và tinh sạch kháng thể kháng DA từ huyết thanh thỏ trắng ............... 38 v 2.2.3. Thử nghiệm phân tích độc tố ASP trong sản phẩm thuỷ sản bằng phương pháp ELISA ........................................................................................................................... 41 2.3. HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG................................................................ 43 2.3.1. Hoá chất .............................................................................................................. 43 2.3.2. Thiết bị ................................................................................................................ 44 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU...................................................................... 44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................ 45 3.1. TẠO KHÁNG THỂ TRÊN ĐỐI TƯỢNG SINH VẬT THỬ NGHIỆM .............. 45 3.1.1. Điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không hoàn chỉnh domoic acid ......................................................................................................... 45 3.1.2. Hoạt tính kháng thể kháng độc tố domoic acid trong huyết thanh thỏ trắng theo thời gian ........................................................................................................................ 51 3.2. THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ KHÁNG DA TỪ HUYẾT THANH THỎ TRẮNG ............................................................................................................... 53 3.2.1. Thu nhận kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng .............................. 53 3.2.2. Tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng .............................. 53 3.2.3. Hiệu giá kháng thể .............................................................................................. 57 3.2.4. Tính đặc hiệu của kháng thể thu nhận từ liệu pháp miễn dịch ........................... 58 3.3. THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ ASP TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA.................................................................................. 59 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 63 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT -NH2 : Nhóm amin sơ cấp -NO3 : Nhóm nitrate =NH : Nhóm amin thứ cấp AOAC : Association Of Analytical Communities (Hiệp hội các nhà hoá học phân tích chính thức). ASP : Amnesic Shellfish Poisoning (Độc tố gây mất trí nhớ tạm thời) BSA : Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò) CBB : Coomassie Brilliant Blue CE : Capillary Electrophoresis (Điện di mao quản) COOH : Nhóm cacboxyl đ.v.c : đơn vị Cacbon DA : Domoic acid DANIDA : Danish International Development Agency (Cơ quan Phát triển Quốc tế Đan Mạch) DMF : N,N- dimethylformamide DMSO : Dimethyl Sulfoxide DSP : Diarrhetic Shellfish Poisoning (Độc tố gây tiêu chảy) DSS : Disuccinimidyl Suberate EDC : N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride ELISA : Enzyme Linked Immunosorbant Assay (Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym) FCA : Freund’s Complete Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh) FIA : Freund’s Incomplete Adjuvant (Tá chất Freund không hoàn chỉnh) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPLC-UV : High Performance Liquid Chromatography with Ultra Violet detection (Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phát hiện bằng tia cực tím) IAC : Immunoaffinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch) ID : Intradermal (trong da) IM : Intramuscular (trong cơ) vii IOC : Intergovernmental Oceanographic Committee (Uỷ ban Hải dương học Liên chính phủ) IP : Intraperitoneal (trong màng bụng) IV : Intravenous (trong tĩnh mạch) JSPS : Japan Society for the Promotion of Science (Cơ quan Phát triển Khoa học Nhật Bản) LC : Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng) LOD : Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ : Limit of Quantification (Giới hạn định lượng) MBA : Mouse Bioassay (Thử nghiệm sinh học trên chuột) mg/mL : milligam/ milli Lít NAFIQAD : National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department (Cục Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản) NHS : N-Hydroxysuccinimide NMDA : N-methyl-D-aspartate NSP : Neurotoxic Shellfish Poisoning (Độc tố thần kinh) OD : Optical Density (Mật độ quang) OPD : Ortho-phenylenediamine P : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê PBS : Phosphate Buffer Saline Plys : Polylysin PSP : Paralytic Shellfish Poisoning (Độc tố gây liệt cơ) PVDF : Polyvinylidine Fluoride RIA : Radio Immuno Assays (Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ) SC : Subcutaneous (dưới da) SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di Polyacrylamide với SDS) STX : Saxitoxin TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) UV : Ultra Violet (Cực tím) µg/g : microgam/ gam µg/mL : microgam/ milli Lít viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thể tích tiêm tối đa của hỗn hợp kháng nguyên/tá dược trên một vị trí tiêm ở các loài động vật khác nhau .......................................................................................... 22 Bảng 2.1. Sơ đồ mô tả một phép phân tích ASP-ELISA trên bản nhựa 96 giếng ........ 42 Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hàm lượng DA (mg) trong phức hợp DA-DSS và hiệu suất phản ứng ....................................................................................................................... 45 Bảng 3.2. Hàm lượng BSA (mg) trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA và hiệu suất phản ứng ................................................................................................................ 48 Bảng 3.3. Kết quả phân tích độc tố DA trong mẫu Hàu Hương bằng kit ASP-ELISA (do đề tài Nhà nước thử nghiệm chế tạo) ............................................................................ 60 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid ................... 5 Hình 1.2. Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA bằng cách sử dụng DSS làm cầu nối giữa nhóm imino của DA và nhóm cacboxyl của protein tải ........................... 17 Hình 1.3. Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp Domoic acid - Disuccinimidyl suberate (DADSS) .............................................................................................................................. 18 Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với Bovine serum albumin (BSA) . 19 Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA ...................................................................................... 31 Hình 2.2. Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA .............................................................................................................. 34 Hình 2.3. Sơ đồ gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand với phức hợp .................. 36 Hình 2.4. Sơ đồ nguyên tắc thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA trong huyết thanh thỏ bằng phản ứng ELISA ............................................................... 37 Hình 2.5. Sơ đồ tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ bằng sắc ký ái lực Sepharose EAH 4B với pha rắn DA ............................................................................. 39 Hình 3.1. Phổ tử ngoại (UV) của phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA .................. 48 Hình 3.2. Hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA trong huyết thanh thỏ trắng New Zealand từ sau tháng thứ 4 đến sau tháng thứ 12 của liệu pháp miễn dịch với liều 500 µg phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA ................................................................................ 51 Hình 3.3. Sắc ký đồ của 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand sau khi qua cột sắc ký ái lực miễn dịch (pha rắn DA-DSS) với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2 mL ................................................................................................................................. 54 Hình 3.4. Sắc ký đồ kháng thể chuẩn kháng DA 1 mg/mL sau khi qua cột sắc ký ái lực miễn dịch với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2 mL (Đào Việt Hà và Phạm Xuân Kỳ, 2017) ............................................................................................................ 55 Hình 3.5. Hình ảnh gel SDS-PAGE (sau khi nhuộm CBB) và màng PVDF sau Western Blot: 1) kháng thể kháng DA chuẩn, 2) chế phẩm kháng thể thu nhận từ huyết thanh thỏ sau tinh chế qua cột IAC ............................................................................................... 56 Hình 3.6. Hiệu giá kháng thể kháng DA của huyết thanh thỏ trắng New Zealand thu nhận bằng liệu pháp miễn dịch ..................................................................................... 57 x Hình 3.7. Kết quả phản ứng ELISA giữa kháng thể kháng DA thu nhận được với DA chuẩn và một số chất có cấu trúc hoá học tương tự DA (KA: Kainic acid; Glu: Glutamic acid; Asp: Aspartic acid; GABA: Gamma-Aminobutyric acid; Pr: proline; HyPr: hydroxyproline) ............................................................................................................ 58 xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid) Giới thiệu về đề tài và mục tiêu nghiên cứu Các nhà khoa học đã phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA) trong các loài hai mảnh vỏ tại vùng biển Châu Á và Việt Nam, với hàm lượng vượt ngưỡng giới hạn an toàn của độc tố này trong sản phẩm thuỷ sản là 20 µg/g mô mềm (AOAC, 1990). Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám sát độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC). Bên cạnh những ưu điểm, MBA và HPLC có những hạn chế nhất định và cần thiết có một phương pháp thử nghiệm sinh học khác ưu việt hơn để thay thế. Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA. Để có kit thử nhanh ELISA cho độc tố DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại độc tố DA. Một khó khăn rất lớn khi tạo kháng thể kháng độc tố DA là động vật bậc cao chỉ sản sinh được kháng thể kháng lại những độc tố có bản chất protein. Trong khi đó, DA có khối lượng phân tử thấp, không thuộc nhóm protein nên cơ thể sinh vật không có hiệu ứng miễn dịch khi bị tiêm trực tiếp độc tố. Muốn tạo được hiệu ứng miễn dịch của sinh vật thử nghiệm đối với DA, trước tiên phải điều chế một phức hợp kháng nguyên từ DA có bản chất là bán kháng nguyên (hapten) bằng cách gắn kết độc tố này với một loại protein thích hợp, sao cho trong phức chất tạo ra vừa có tính chất kháng nguyên từ độc tố (DA), vừa có tính sinh miễn dịch của một phân tử protein. Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA, sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA và kế thừa kết quả nghiên cứu của Takata (2006), nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện nhanh độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục đích điều chế được phức hợp kháng nguyên Domoic acid - Bovine Serum Albumin (DA-BSA) có tính sinh miễn dịch từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA; thu nhận được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng New Zealand. xii Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu sử sụng các phương pháp hoá sinh truyền thống và hiện đại như ELISA, HPLC, sắc ký ái lực miễn dịch (IAC), điện di Western Blot với các bước điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA (Domoic acid - Disuccinimidyl Suberate Bovine Serum Albumin) có tính sinh miễn dịch hoàn chỉnh; sau đó gây miễn dịch trên đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng nguyên DA-BSA; thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng. Đối tượng nghiên cứu là DA; BSA và thỏ trắng (Oryctolagus cuniculus) dòng New Zealand, được nuôi theo quy trình nuôi động vật thí nghiệm của Viện Vắc-xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel xử lý số liệu thống kê trong nghiên cứu. Kết quả thu được 1) Luận văn đã xây dựng được quy trình 02 bước phản ứng và điều chế được phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA với hiệu suất đạt 18,42%. Sản phẩm kháng nguyên cộng hợp DA-DSS-BSA có tỉ lệ gắn kết 7,8 phân tử DA với 01 phân tử BSA. 2) Luận văn đã sử dụng phức hợp DA-DSS-BSA để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand và nhận thấy với liều phức hợp sử dụng 500µg, thỏ trắng New Zealand có đáp ứng miễn dịch sau 05 tháng thí nghiệm và đạt khả năng đáp ứng miễn dịch cao nhất ở thời điểm sau 06 tháng thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy các cá thể thỏ trắng khác nhau có sự đáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng liều DADSS-BSA sử dụng và có 01 trong số 09 thỏ thử nghiệm có hoạt tính kháng thể cao nhất (mức hiệu giá kháng thể: 12800). 3) Luận văn đã tiến hành tinh chế kháng thể bằng phương pháp sắc ký ái lực với pha rắn DA và thu được 1,2 mg kháng thể từ 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand đã đáp ứng miễn dịch. Kháng thể thu được có tính đặc hiệu với DA và đạt độ tinh sạch để sử dụng làm vật liệu cho sản xuất bộ kit ELISA dùng phát hiện độc tố từ nhuyễn thể 2 mảnh vỏ. Từ khoá: Domoic acid, bovine serum albumin, ELISA, kháng thể đa dòng xiii LỜI MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Takata và cộng sự (2009) phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA) trong loài nhuyễn thể Spondylus tại vùng biển châu Á bao gồm Nhật Bản, Thái Lan, Philippin và Việt Nam. Tiếp theo, Đào Việt Hà và cộng sự (2009) cũng công bố đã phát hiện độc tố này trong loài hai mảnh vỏ Spondylus versicolor sống tại đầm Nha Phu, Khánh Hòa, Việt Nam với hàm lượng lên tới 150 µg/g mô mềm trong khi giới hạn an toàn của độc tố DA trong sản phẩm thuỷ sản là 20 g/g mô mềm (AOAC, 1990). Những phát hiện này cho thấy nguy cơ tích luỹ độc tố DA trong sinh vật biển, đặc biệt là các loài nhuyễn thể thân mềm, có thể dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm cho cộng đồng. Hiện nay, việc kiểm soát chất lượng, an toàn thực phẩm trong tất cả các công đoạn sản xuất thủy sản đang được đẩy mạnh vì đây là một trong những tiêu chuẩn cần thiết phục vụ nhu cầu thị trường quốc tế và trong nước. Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám sát độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC). MBA được một số quốc gia khu vực Đông Nam Á lựa chọn là phương pháp giám sát độc tố DA quốc gia do một số ưu điểm của kỹ thuật MBA là thời gian thử nghiệm nhanh (trong vòng 24÷48 tiếng), giá thành rẻ (khoảng 20 USD/thử nghiệm). Tuy vậy, MBA cũng có khá nhiều nhược điểm như sai số khá lớn (± 20%) và phụ thuộc vào chất lượng nguồn sinh vật giống - dòng chuột nhắt trắng Swiss swiss (được cung cấp bởi một số cơ sở y tế như Viện Vắc-xin, Viện Vệ sinh Dịch tễ…). Hiện nay, dòng chuột trắng này có nguy cơ bị thoái hóa do được giữ và nhân giống bằng phương pháp lai cận huyết trong một thời gian rất dài. Trong phương pháp MBA, sức khỏe của sinh vật thử nghiệm là điều kiện quan trọng đảm bảo tính chính xác của kết quả. Nghiên cứu của Đào Việt Hà và cộng sự trong suốt 15 năm gần đây cho thấy, khi sử dụng dòng chuột nhắt trắng Swiss swiss tại Việt Nam thường bắt gặp những kết quả không ổn định, dẫn đến sai số rất lớn. Hơn nữa, theo xu hướng hiện nay trên thế giới, nhiều quốc gia không ủng hộ việc sử dụng sinh vật sống trong các thí nghiệm độc tính cấp (gây chết cho sinh vật thử nghiệm). Mặt khác, giới hạn phát hiện của MBA đối với độc tố DA là 150 µg/g, trong khi ngưỡng 1 an toàn thực phẩm của độc tố này trong sản phẩm hải sản lại là 20 µg/g. Do vậy, không thể sử dụng MBA để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm của độc tố DA trong các sản phẩm thuỷ sản. Trong khi đó, phương pháp xác định hàm lượng DA bằng HPLC lại khá tốn kém, đòi hỏi đầu tư thiết bị chuyên biệt, người phân tích cần có kiến thức cơ bản tốt và được huấn luyện, đào tạo trong thời gian dài (đôi khi tới vài năm) mới vận hành, sử dụng thành thạo hệ thống và cho kết quả chính xác. Chính vì thế, việc tìm kiếm một phương pháp thử nghiệm sinh học khác, ưu việt hơn để thay thế MBA tại Việt Nam là cần thiết. Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA, hứa hẹn là một trong kỹ thuật được AOAC lựa chọn là phương pháp chuẩn quốc tế do những điểm ưu việt về giới hạn phát hiện thấp, độ chính xác cao hơn hẳn MBA. Việc tìm tòi, phát triển phương pháp đánh giá nhanh độc tố này là cấp thiết không chỉ với Việt Nam. Để có kit thử nhanh ELISA cho độc tố DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại độc tố DA. Trong khi đó, độc tố DA có khối lượng phân tử thấp (312 đ.v.c), không có bản chất protein nên không thể tạo hiệu ứng miễn dịch khi được đưa vào cơ thể động vật. Để có được phản ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng độc tố DA từ động vật thử nghiệm, cần phải có một kháng nguyên thích hợp mang tính chất độc tố DA và protein thích hợp cho quá trình sản sinh kháng thể. Mặt khác, liều miễn dịch, cách gây miễn dịch, thời gian ủ cũng là những chỉ tiêu rất quan trọng trong cơ chế tạo miễn dịch của sinh vật thử nghiệm. Thuỵ Điển, và gần đây là Nhật Bản đã nghiên cứu phát triển bộ kit ELISA dùng cho độc tố gây mất trí nhớ tạm thời (Amnesic Shellfish Poisoning - ASP) (ASP-ELISA), nhưng cho đến hiện nay vẫn chưa có sản phẩm thương mại. Đối với Việt Nam, nếu sử dụng kit ELISA của nước ngoài sẽ gặp phải khó khăn do giá thành quá cao (khoảng 20 triệu đồng/ kit/ 26 - 28 mẫu) và đòi hỏi phải đặt hàng với số lượng đủ lớn để hãng sản xuất chấp nhận chi phí vận chuyển quốc tế. Mặt khác, quá trình vận chuyển trong nội địa Việt Nam khó đáp ứng được yêu cầu về nhiệt độ bảo quản theo quy định (4 - 100C), gây ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả. Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA, nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện nhanh 2 độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản với giá thành dự kiến giảm một nửa so với bộ kit thương mại có nguồn gốc nhập ngoại, đáp ứng nhu cầu thị trường Việt Nam về an toàn thực phẩm biển một cách chủ động; từ sự tài trợ kinh phí của chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện nhanh một số độc tố vi tảo trong sản phẩm thủy sản” thuộc “Chương trình trọng điểm ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020”, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)”. 2. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu chung Thu nhận được kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid). Mục tiêu cụ thể - Điều chế được phức hợp kháng nguyên DA-protein tải có tính sinh miễn dịch từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA. - Thu nhận được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ. 3. Nội dung của đề tài 1) Điều chế phức hợp kháng nguyên DA-protein tải có tính sinh miễn dịch hoàn chỉnh; 2) Gây miễn dịch trên đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng nguyên DA-protein tải; 3) Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng. 4. Phạm vi nghiên cứu - Điều chế phức hợp kháng nguyên bằng cách cộng hợp phân tử DA với protein tải BSA thông qua cầu nối hoá học DSS. - Thực nghiệm gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand. - Thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu sau liệu pháp miễn dịch. - Thử nghiệm sử dụng kit ELISA được chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA thu nhận được để phân tích độc tố DA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ. 3 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ý nghĩa khoa học: đây là nghiên cứu hoàn toàn mới tại Việt Nam, không bị cạnh tranh trên thị trường trong nước. Các quy trình công nghệ được triển khai tạo điều kiện phát triển phương pháp quản lý sử dụng tốt và nâng cao giá trị nguồn tài nguyên biển. Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài góp phần vào việc giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm từ độc tố vi tảo cho cộng đồng và tránh thiệt hại về kinh tế trong lĩnh vực xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản. 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH POISONING - ASP) Được phân lập lần đầu tiên từ loài tảo đỏ Chondria armata (Takemoto và Daigo, 1958) nhưng domoic acid (DA) chỉ được biết có nguồn gốc từ vi tảo biển khi có vụ ngộ độc đầu tiên cho người sau do ăn Vẹm xanh Mytilus edulis xảy ra vào năm 1987, tại đảo Prince Edwards, vùng Đông bắc Canada. Đây cũng là lần đầu tiên DA được xác nhận gây ra triệu chứng ngộ độc mất trí nhớ tạm thời ở người. Trong vụ ngộ độc này, 03 người chết, 19 người phải điều trị tại bệnh viện (trong đó 12 người trong tình trạng ngộ độc trầm trọng, phải chăm sóc đặc biệt) và hơn 100 người khác có các triệu chứng rối loạn tiêu hóa và thần kinh (Wright và cộng sự, 1989). Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc ASP bao gồm buồn nôn, nôn mửa, đau co thắt vùng bụng, mất trí nhớ, giảm sự tỉnh táo, lên cơn, lẫn lộn, và mất định hướng (Perl và cộng sự, 1990a, 1990b; Teitelbaum và cộng sự, 1990; Todd, 1993). DA trong vẹm xanh gây ra vụ ngộ độc nổi tiếng tại Canada năm 1987 được xác định do loài vi tảo silic Pseudo-nitzschia multiseries (Bates và cộng sự, 1989). Cho đến thời điểm hiện nay trên thế giới đã xác định được ít nhất 17 loài Pseudo-nitzschia, 01 loài Nitzschia và 01 loài Amphora có khả năng sản sinh DA (IOC, 2018). domoic acid glutamic acid kainic acid Hình 1.1. Cấu trúc hoá học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid Domoic acid (DA) là một amino acid với khối lượng phân tử 312 đ.v.c, công thức hoá học C15H21NO6, có ba nhóm cacboxyl (-COOH), tồn tại ở dạng tinh thể, tan trong nước, có tính acid. Cho đến hiện nay, 10 dẫn xuất của DA đã được phát hiện (Zaman và 5 cộng sự, 1997; Lefebvre và Robertson, 2010), nhưng các dẫn xuất này không có độc tính. DA có cấu trúc hóa học tương tự như glutamic acid và kainic acid (Hình 1.1). 1.1.1. Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP Vẹm nuôi (Mytilus edulis) được lấy mẫu trong đợt bùng phát ngộ độc ASP ở Canada (phía đông đảo Prince Edward) trong mùa thu năm 1987 có chứa tới 790 μg DA/g mô ướt (cả con vẹm) (lên đến 1280 μg/g trong mô mềm và 1500 μg/g trong tuyến tiêu hóa) (Bates và cộng sự, 1998; Todd, 1997). Từ tháng 8-10 năm 1988, DA đã được phát hiện ở vẹm xanh và cả trong trai vỏ mềm (Mya arenaria) ở phía tây nam Vịnh Fundy, Canada (Martin và cộng sự, 1993). Trong tháng 10 năm 1991, DA đã được phát hiện trong trai móng tay (Siliqua patula) từ Oregon và Washington, Hoa Kỳ. Lượng DA đạt mức cao nhất trong tuần đầu tiên của tháng 12 năm 1991 (mức tối đa trong phần ăn được là 147 μg/g, mức trung bình là 106 μg/g ở tất cả các bãi biển bang Washington). Lượng DA trong trai vẫn ở mức cao hơn mức quy định cấm khai thác là 20 μg/g trong thời gian ít nhất là 6 tháng. Lượng DA đã giảm xuống mức < 10 μg/g vào cuối mùa xuân năm 1992, lượng DA < 5 μg/g đối với hầu hết các khu vực lấy mẫu ven biển. DA được phân bố trong nhiều bộ phận khác nhau của trai móng tay. Mức cao nhất được tìm thấy ở chân, tiếp theo là cơ quan nội tạng và vòi hút (hay cổ). Mức DA ở chân trai móng tay đạt 230 μg/g (Van Apeldoorn và cộng sự, 1999). Sò điệp sống trong vịnh (Argopecten iradians) đã được ghi nhận là có thể hấp thu DA lên đến mức 60 μg/g trong các tuyến tiêu hóa sau khoảng 84 giờ tiếp xúc với P. multiseries độc. Lượng DA giảm xuống mức 5 μg/g sau 48 giờ của quá trình loại bỏ độc tố (J. Douglas và cộng sự, 1997). Trong mùa thu năm 1993, sò biển (Placopecten magellanicus) ở vịnh Fundy, Canada đã bị chết mà không rõ nguyên nhân. Các tuyến tiêu hóa của sò điệp có chứa 93,4 μg DA/g. Mặc dù một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ được ghi nhận là có chứa hàm lượng DA cao mà không biểu hiện bất kỳ triệu chứng nào, sò gai (Chlamys hastata) đã bị chết nhanh chóng (trong vòng 12 giờ) sau khi tiếp xúc với các môi trường có P. multiseries độc (J. Douglas và cộng sự, 1997). Lượng đáng kể DA đã được tìm thấy thường xuyên trong tuyến tiêu hóa nhưng không có trong cơ khép của sò biển ngoài khơi ở Canada tại Georges Bank, Browns Bank và Vịnh Fundy (Stewart và cộng sự, 1998). 6 1.1.2. Độc tính của DA Cơ chế tác động của DA được biết đến trên các thụ thể acid amin kích thích và sự dẫn truyền tiếp hợp. Các acid amin kích thích, đáng chú ý nhất là L-glutamate và L-aspartate, từ lâu đã được coi là những chất có khả năng dẫn truyền thần kinh cao nhất. Các acid amin này được ghi nhận là có thể tác động lên nhiều loại thụ quan, tính chất đặc trưng nhất của chúng được đặt tên theo các tác nhân kích thích ngoại sinh chọn lọc là N-methyl-D-aspartate (NMDA), kainate và quisqualate. DA là một chất tương tự glutamate và liên kết với các thụ quan glutamate thuộc loại quisqualate bằng ái lực cao. Glutamate cũng như phân lớp của NMDA tác động mở các kênh trên lớp màng thẩm thấu Na+, tạo điều kiện cho các dòng Na+ có thể tràn vào và gây nên sự khử cực màng. DA có hai đối tượng tác động chính trong hệ thần kinh trung ương; sự hình thành vùng đồi hải mã và các khu vực liên quan đến đồi hải mã là vùng liên quan đến quá trình xử lý thông tin của bộ nhớ, và vùng thân não. Chính vì vậy, triệu chứng mất trí nhớ trong thời gian ngắn nhưng không hồi phục là biểu hiện đặc trưng của ngộ độc ASP ở người (Perl và cộng sự, 1990b). Ở các loài gặm nhấm, DA gây ra tình trạng kém hoạt động, lên cơn và gãi đặc trưng (Work và cộng sự, 1993) - đây là triệu chứng lâm sàng điển hình trong phương pháp thử nghiệm sinh học trên chuột đối với độc tố này. Có những bằng chứng chỉ ra rằng người dân sống trên đảo của Nhật Bản đã đánh giá các chất chiết xuất từ tảo biển có chứa DA như một loại chất có giá trị. Loài tảo đỏ Chondria armata chứa DA đã được sử dụng để điều trị bệnh giun đũa trong nhiều thế kỷ và là thuốc trừ sâu (Higa và Kuniyoshi, 2000). Thử nghiệm này rõ ràng đã được thực hiện để thử nghiệm các tính chất diệt giun của DA và các đơn liều 20 mg với độ tinh khiết không xác định được dùng cho người lớn và trẻ em mà không gây ảnh hưởng có hại (Iverson và Truelove, 1994). Tuy nhiên, DA độc với cả phần trung tâm và ngoại vi của hệ thống thần kinh ở người. DA là một chất gây nôn nên có thể gây nôn khan cũng như ói mửa khi nó tác động vào trung tâm gây nôn trong khu vực não thất. Nó tạo ra một hội chứng trên sợi trục thần kinh cảm giác vận động, gây mất trí nhớ, hôn mê, co giật và tử vong. Do tác động của nó vào bộ nhớ, trong số các tác động gây bệnh khác, ngộ độc DA được đặt tên là ngộ độc mất trí nhớ do nhuyễn thể (ASP) (Todd, 1993; Watters, 1995). Trong đợt bùng phát ngộ độc ASP đầu tiên vào năm 1987 tại đảo Prince Edward ở Canada, 107 trường hợp ngộ độc đã được báo cáo. Các triệu chứng ngộ độc đầu tiên được ghi nhận 7