MẠC VĂN TRỌNG
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
LUẬN VĂN THẠC SỸ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM
TRA CHẤT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY
TẾ BÀO VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ
NGHIỆM
MẠC VĂN TRỌNG
2016 - 2018
HÀ NỘI - 2018
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
LUẬN VĂN THẠC SỸ
NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
CHÁT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO
VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM
MẠC VĂN TRỌNG
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 8420201
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐỖ TUẤN ĐẠT
HÀ NỘI - 2018
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Tuấn Đạt, người đã tận tình
giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong công việc cũng như trong suốt quá trình học tập, và
thực hiện các nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu, ban lãnh đạo Khoa, các
thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Sau Đại Học, Trường Đại Học Mở Hà Nội đã tận
tình giảng dạy, hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học
tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị em, các bạn đồng
nghiệp phòng Công nghệ Cao, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, đã
nhiệt tình giúp đỡ, cùng chia sẻ các kinh nghiệm và kiến thức trong suốt thời gian
tôi thực hiện nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi muốn được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên khích lệ,
động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Học Viên
Mạc Văn Trọng
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về bệnh dại................................................................................... 3
1.1.1. Sơ lược về lịch sử bệnh dại ....................................................................... 3
1.1.2. Virút dại .................................................................................................... 5
1.1.3. Dịch tễ học bệnh dại.................................................................................. 8
1.2. Vắcxin phòng bệnh dại ................................................................................ 13
1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất ...................................................................... 13
1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai ........................................................................ 16
1.2.3. Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại được đề cập nghiên
cứu sử dụng trên thế giới................................................................................... 22
1.3. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại VABIOTECH ... 27
1.3.1. Tế bào Vero dùng trong sản xuất vắcxin dại .......................................... 27
1.3.2. Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại
VABIOTECH .................................................................................................... 29
1.3.3. Căn cứ và cơ sở thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại
trên nuôi cấy tế bào............................................................................................ 31
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 36
2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 36
2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 36
2.2.1. Hóa chất................................................................................................... 36
2.2.2. Vắcxin, sinh phẩm, động vật thí nghiệm................................................. 38
2.2.3. Trang thiết bị ........................................................................................... 38
2.2.4. Dụng cụ ................................................................................................... 40
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 41
2.3.1. Các phương pháp kiểm tra hóa lý ........................................................... 41
i
2.3.1.1. Kiểm tra tính chất vật lý ................................................................... 41
2.3.1.2. Kiểm tra pH ...................................................................................... 41
2.3.1.3. Kiểm tra hàm lượng Thimerosal ....................................................... 42
2.3.1.4. Kiểm tra hàm lượng Protein.............................................................. 44
2.3.1.5. Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư ...................................................... 44
2.3.1.6. Kiểm tra hàm lượng nhôm ............................................................... 47
2.3.2. Các phương pháp kiểm tính an toàn và công hiệu .................................. 48
2.3.2.1. Kiểm tra vô khuẩn ............................................................................ 48
2.3.2.2. Chuẩn độ hiệu giá virút dại trên chuột (LD50/ml) ............................ 48
2.3.2.3. Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp miễn dịch huỳnh
quang phát hiện nucleocapsid của virút dại ( FFD50/0,05ml) ....................... 49
2.3.2.4. Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp xác định hàm lượng
kháng nguyên Glycoprotein của virút dại ( EL.U/ml) .................................. 52
2.3.2.5. Kiểm tra chất gây sốt........................................................................ 54
2.3.2.6. Kiểm tra an toàn chung chuột nhắt và chuột lang ............................ 54
2.3.2.7. Kiểm tra an toàn đặc hiệu................................................................. 55
2.3.2.8. Kiểm tra công hiệu ........................................................................... 56
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 60
3.1. Kết quả kiểm tra các thành phần hóa lý trong kiểm định vắcxin dại tế
bào ......................................................................................................................... 60
3.1.1. Kiểm tra tính chất vật lý .......................................................................... 60
3.1.2. Kiểm tra pH. ............................................................................................ 61
Tiến hành kiểm tra pH vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào ở các giai đoạn chúng
tôi thu được kết quả như bảng 3.1 dưới đây. .................................................... 61
3.1.3. Kiểm tra hàm lượng Thimerosal ............................................................. 62
3.1.4. Kiểm tra hàm lượng protein tổng số ....................................................... 63
3.1.5. Kiểm tra hàm lượng nhôm ...................................................................... 65
3.1.6. Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư ........................................................... 66
3.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn và công hiệu trong kiểm định vắcxin dại tế
ii
bào ......................................................................................................................... 68
3.2.1. Kiểm tra vô khuẩn ................................................................................... 68
3.2.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại ........................................................ 70
3.2.3. Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên glycoprotein virút dại. ....... 74
3.2.4. Kết quả kiểm tra chất gây sốt .................................................................. 75
3.2.5. Kết quả kiểm tra an toàn chung .............................................................. 77
3.2.6. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu ........................................................... 79
3.2.7. Kết quả kiểm tra công hiệu ..................................................................... 81
3.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin dại tế bào ................ 82
3.3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về thành phần hóa học ................................. 82
3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về tính an toàn và công hiệu ........................ 85
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................ 91
4.1. Kết luận ......................................................................................................... 91
4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 92
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 93
iii
DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
ABLV
Australian Bat Lyssavirus
ADN
Deoxyribonucleic Acid
Axit Deoxyribonucleic
ARN
Ribonucleic Acid
Axit Ribonucleic
ASEAN
BSA
Association of South East Asian Hiệp hội các nước Đông
Nations
Nam Á
Bovine Serum Albumin
BTP
CDC
Bán thành phẩm
Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm soát bệnh
Prevention
tật và Dự phòng Hoa kỳ
CHLB
Cộng hoà Liên bang
CPE
Cytopathic effect
Huỷ hoại tế bào
CVS
Challenge Virus Strain
Chủng virút thử thách
DĐVN
EBLV
Dược điển Việt Nam
European Bat Lyssavirus
ED50
Effective Dose 50
EIA
Enzyme Immunoassay
ELISA
FAT
FAVN
FBS
Liều bảo vệ 50%
Enzyme - linked Immunosorbent
Assay
Fluorescent antibody test
Fluorescent antibody virus
neutralization
Fetal Bovine Serum
Huyết thanh bào thai bê
iv
Viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
FFD50
Focus Forming Dose 50%
GMP
Good Manufacturing Practices
HGKT
IU
Thực hành sản xuất tốt
Hiệu giá kháng thể
Đơn vị Quốc tế
International Unit
kDa
KiloDalton
LD50
Lethal Dose
Liều gây chết 50%
mARN
Messenger RNA
ARN thông tin
MCB
Master Cell Bank
Ngân hàng tế bào giống gốc
MEM
Minimum Essential Media
NICVB
National Institute for Coltrol of Viện Kiểm định quốc gia
Vaccine and Biological
vắcxin và sinh phẩm y tế
NIH
National Institute Of Health
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
Viện sức khỏe quốc gia Hoa
PV
RFFIT
RT-PCR
Kỳ
Phản ứng chuỗi polymerase
Pasteur virus
Rapid fluorescent focus inhihition
test
Reverse Transcription polymerase
chain reaction
SRID
Single Radial Immunodiffusion
SSC
Saline - sodium citrate
v
PCR phiên mã ngược
Phương pháp miễn dịch
khuếch tán đơn
Viết tắt
TCA
Tiếng Anh
Tiếng Việt
Trichloroacetic acid
TCYTTG
TE
Tổ chức y tế thế giới
Tris - EDTA
Trách nhiệm hữu hạn một
TNHH MTV
thành viên
Công
VABIOTECH
TNHH
MTV
Vắcxin và sinh phẩm số 1
VSDTTƯ
WCB
ty
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Working Cell Bank
Ngân hàng tế bào sản xuất
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Số người tiêm vắcxin dại và số ca tử vong do bệnh dại tại Việt Nam
1991-2016.................................................................................................................. 10
Bảng 1.2: Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y ...... 13
Bảng 1.3: Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất ................ 19
Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra pH vắcxin dại tế bào ..................................................... 61
Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Thimerosal .................................................. 63
Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra hàm lượng nhôm ........................................................... 65
Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư BTP tinh khiết vắcxin dại tế bào
................................................................................................................................... 67
Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra vô khuẩn........................................................................ 68
Bảng 3.6: Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại .......................................................... 71
Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra chất gây sốt ................................................................... 76
Bảng 3.8: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu hoá lý......................................................... 83
Bảng 3.9: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu an toàn và công hiệu ................................. 85
vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại ................................................................................... 7
Hình 1. 2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại ............................................................ 8
Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017 ................................................. 9
Hình 1.4: Phân bố tỷ lệ chết do dại/100000 dân theo khu vực giai đoạn 1996-2017
................................................................................................................................... 12
Hình 1.5: Phân bố số ca bệnh dại theo tỉnh năm 2017-2018 .................................... 12
Hình 1.6: Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng để sản xuất vắcxin
trên nuôi cấy tế bào. .................................................................................................. 18
Hình 1.7: Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Vabiotech ... 29
Hình 3.1: Kết quả kiểm tra tính chất vật lý Vắcxin dại tế bào ở các giai đoạn. ....... 60
Hình 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Protein tổng số vắcxin dại tế bào BTP tinh
khiết .........................................................................................................................644
Hình 3.3:Hình ảnh kiểm tra hàm lượng AND tồn dư loạt sản xuất 0314 ................. 67
Hình 3.4: Hình ảnh ống thử nghiệm vô khuẩn vắcxin loạt 0215 trước và sau 14 ngày
theo dõi ...................................................................................................................... 69
Hình 3.5: Hình ảnh chuột liệt do virus dại và hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào
vero dưới kính hiển vi huỳnh quang trong các thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá ....... 73
Hình 3.6: Kết quả xác định hàm lượng glycoprotein. ............................................... 75
Hình 3.7: Đồ thị phân tích tổng nhiệt tăng của các loạt ........................................... 77
Hình 3.8: Kết quả kiểm tra an toàn chung vắcxin dại tế bào thành phẩm ................ 78
Hình 3.9: Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu BTP sau bất hoạt và BTP tinh khiết
vắcxin dại tế bào........................................................................................................ 80
Hình 3.10: Kết quả kiểm tra công hiệu vắcxin dại tế bào ......................................... 81
viii
MỞ ĐẦU
Bệnh dại là bệnh nhiễm virút cấp tính của hệ thống thần kinh trung ương do
virút thuộc họ Rhabdoviridae, giống Lyssavirus từ động vật lây sang người bởi chất
tiết, thông thường là nước bọt của chó bị nhiễm virút dại. Hầu hết các trường hợp bị
nhiễm virút dại đều qua vết cắn, vết liếm trên da, niêm mạc bị tổn thương. Kể cả
người và động vật khi đã bị bệnh dại đều dẫn tới tử vong. Bệnh dại thuộc nhóm B
trong Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm [2], [5], [6]. Bệnh dại phổ biến trên
toàn cầu, cả ở châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ La tinh, trừ một số vùng không
có bệnh dại như Vương quốc Anh, Nhật Bản, vùng Bắc cực, châu Đại Dương được
gọi là những vùng đất “biệt lập”. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới
(TCYTTG) hàng năm có khoảng 55000 - 70000 người chết vì bệnh dại, trong đó
hơn 90% được thông báo từ các nước đang phát triển ở châu Phi và châu Á. Ở Đông
Nam Á (ASEAN) bệnh dại đang có xu hướng diễn biến phức tạp và có chiều hướng
gia tăng trong những năm gần đây [2], [6]. Bệnh dại chưa có thuốc điều trị đặc hiệu,
do đó biện pháp tiêm vắcxin phòng bệnh dại để chủ động gây miễn dịch là phương
thức hữu hiệu nhất trong phòng và điều trị bệnh dại hiện nay.
Tại Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu
là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch
tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp
của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp).
Tuy nhiên, theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên
80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong
muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt
vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10000 mũi tiêm, nên từ năm
2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên
toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào
trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân
được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ
chiếm 15% số người được tiêm vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm
1
loại vắcxin này rất đắt do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa
được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế. Do vậy, phát triển các vắcxin dại cho
người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay
Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật
và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin
dại, công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã nghiên cứu
phát triển thành công quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero ở quy mô phòng thí nghiệm. Theo yêu cầu của các cơ quan quản lý, các nhà
sản xuất thuốc và dược phẩm sinh học nói chung phải kiểm soát tối đa các sản
phẩm, đảm bảo được chất lượng và các tiêu chuẩn kĩ thuật. Nhằm quản lý và đảm
bảo chất lượng tốt tất cả các công đoạn trong quy trình sản xuất cũng như đảm bảo
về an toàn và công hiệu cho người sử dụng vắcxin dại sản xuất trên nuôi cấy tế bào
Vero thì yêu cầu cấp bách đặt ra là cần thiết lập được các phương pháp cũng như
đưa ra các tiêu chuẩn trong kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên tế bào
Vero, do vậy chúng tôi thực hiện đề tài
"Nghiên cứu thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên
nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm"
Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài
1. Thiết lập được các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi
cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm bằng cách tiến hành các
phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại đã được khuyến cáo bởi các tổ chức
(WHO, DĐVN4) ở điều kiện kiểm tra thực tế.
2. Xây dựng được bảng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào
Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm.
2
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh dại
1.1.1. Sơ lược về lịch sử bệnh dại
Bệnh dại là một trong những căn bệnh cổ xưa nhất của động vật có thể
truyền sang người một cách rủi ro khi có tiếp xúc với virút dại qua da hoặc niêm
mạc bị tổn thương. Bệnh dại (rabies) xuất phát từ chữ Latin có nghĩa là “cuồng
bạo, điên rồ”. Những người Hy Lạp cổ đã mô tả bệnh dại bằng từ lyssa nghĩa là
“chứng điên khùng, rồ dại”. Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não
nguyên phát của động vật có vú. Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc
da bị tổn thương. Từ hàng nghìn năm trước công nguyên, những người thầy thuốc
cổ phương Đông đã viết về căn bệnh tương tự bệnh dại – bệnh sợ nước, sợ gió mà
chó và người mắc phải. Bệnh dại cũng được người da đỏ, người Ả rập và người Do
Thái cổ đề cập trong y văn với 5 dấu hiệu bệnh dại ở chó: mõm há, chảy
nước dãi, tai rủ, đuôi cụp, giọng khàn và khuyến cáo nếu gặp các con vật có
biểu hiện này phải tiêu diệt ngay bằng cung tên. Ở Ai Cập, Hy Lạp, La Mã
người ta coi bệnh dại là sự trừng phạt của thượng đế vì sự bí mật của căn
nguyên gây bệnh cũng như sự khủng khiếp của các triệu chứng lâm sàng [2], [5],
[6].
Một trăm năm sau công nguyên, Celse đã biết rằng độc tố đã được
truyền từ chó sang người và muốn loại bỏ độc tố này cần phải đốt vết thương
bằng que sắt nung đỏ. Hai trăm năm sau công nguyên, Galien đã đề ra phương pháp
phẫu thuật cắt bỏ phần cơ thể bị vết cắn để ngăn ngừa sự phát bệnh dại.
Đầu thế kỷ 19, Zinke đã chứng minh được tính lây nhiễm có trong nước
dãi của chó dại. Tại viện Lion, Galtier đã thành công trong việc gây bệnh thực
nghiệm trên thỏ và thử nghiệm gây miễn dịch cho cừu bằng cách tiêm nước bọt
của con vật bị bệnh dại vào tĩnh mạch cón vật lành. Năm 1884, Louis Pasteur đã
thành công trong việc nghiền não tuỷ của chó mắc bệnh dại sau đó gây nhiễm dưới
màng cứng não thỏ. Tiếp tục nghiền não thỏ đã gây nhiễm truyền cho thỏ tiếp theo
3
và cứ tiếp tục như vậy sau hơn 100 lần tiêm truyền liên tiếp trên não thỏ ông đã thu
được chủng virút có thời gian ủ bệnh thu ngắn và cố định 6 - 7 ngày, ông gọi đó là
“virút dại cố định”. Pasteur cũng đã phát minh ra phương pháp bất hoạt virút dại
gây nhiễm não tuỷ thỏ bằng cách làm khô dưới KOH tinh thể. Ông đã dùng não tuỷ
thỏ bất hoạt này tiêm cho chó, sau đó dùng virút dại sống thử thách cho những
con chó này và kết quả thí nghiệm đã giúp Pasteur tìm ra cách sản xuất vắcxin
dại. Ngày 6 tháng 7 năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắcxin não thỏ bất
hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister, bị một con chó lên cơn dại cắn
nhiều vết. Sau khi được tiêm 13 mũi vắcxin dại của Pasteur, cậu bé đã được
cứu thoát khỏi bệnh dại. Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2500
người bệnh đã được điều trị bằng vắcxin này và chỉ có 12 người bị chết [5], [6].
Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự
phát triển của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn
dòng để chẩn đoán các chủng virút dại gây bệnh ở người và động vật. Bằng kỹ
thuật PCR, sequencing người ta đã có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp
các gen và trình tự nucleotide của virút dại. Hiện nay, chẩn đoán bệnh dại trên
người chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh và tiền sử phơi
nhiễm với virút dại. Chẩn đoán xác định bệnh dại bằng các kỹ thuât xét nghiệm:
phát hiện kháng nguyên (FAT), phân lâp virút, kỹ thuât sinh học phân tử (RT-PCR),
phát hiện kháng thể (ELISA, RFFIT, FAVN). Tuy nhiên, trên thực tế do tính nguy
hiêm của bệnh dại, nên khi bị động vât nghi dại cắn, ngươi bệnh phải được giám sát
và điều trị dự phòng khẩn cấp mà không chờ chẩn đoán xác định bệnh dại ở động
vât bằng xét nghiệm [2], [6].
Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và vết
cào xuyên da của động vật nhiễm. Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất lây nhiễm
thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn thương da mới của
nạn nhân. Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết có chứa virút hoặc cấy
ghép phủ tạng nhiễm bệnh.
Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến vài
4
tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm. Thời gian ủ bệnh
phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn thương và vị
trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập [17], [59].
Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ư ơng qua các dây
thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ virút nhân lên và phát tán ngược trở ra hệ thống
thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt. Virút dại lan truyền đến
toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên lúc đó cơ thể không
có được đáp ứng miễn dịch với virút [56].
Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở
người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng. Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa
trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình dịch tễ của
bệnh trên động vật. Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị
cảm tại vết thương. Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não
tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất
ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng thở ngừng tim. Bệnh dại
gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triển ít trầm trọng hơn tuy
nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong. Dạng bệnh dại này thường bị chẩn đoán
nhầm là bệnh lý khác [59].
Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại
được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh được
nguy cơ tử vong. Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ dơi được
cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc kháng virút
nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng trên một số bệnh
nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [56].
1.1.2. Virút dại
Virút dại thuộc họ Rhabdoviridae, chi Lyssavirus, có vât liệu di truyền
là ARN, vỏ ngoài là lipid. Có hơn 100 chủng phân bố trong tự nhiên có thể gây
nhiễm cho động vật và thực vật. Virút dại có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi
nhiệt độ; dễ bị phá hủy bởi các chất hòa tan lipid (xà phòng, ether, chloroform,
5
acetone); rất nhạy cảm với tia cực tím và bị bất hoạt nhanh chóng trong dung dịch
cồn và cồn iốt [2], [5], [6]. Trong chi Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút
hoang dại ở chó, mèo… và các chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên
trong 7 genotype của nhóm. Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh
ở động vật, tuy nhiên đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở
người như nhiễm Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu
(EBLV) [50], [56].
Hình thái:
Virút dại có hình viên đạn một đầu tròn, đầu kia dẹt với đường kính
trung bình 75 nm, chiều dài dao động từ 100 - 300 nm. Sự thay đổi về độ dài phản
ánh sự hiện diện các hạt trung gian có cấu trúc không hoàn chỉnh với độ dài ngắn
hơn khoảng từ 20 - 50% so với hạt virút hoàn chỉnh. Các hạt trung gian có bộ gen bị
cắt xén và vì thế thiếu hụt một số chức năng của virút, chúng nhân lên một cách
nhanh chóng và cạnh tranh tích cực với các virút có bộ gen bình thường trong quá
trình tạo thành lớp vỏ bao [6].
Cấu trúc:
Cấu trúc virút dại gồm lõi bên trong là chuỗi xoắn ribonucleoprotein, bao
bọc bên ngoài là một lớp vỏ lipoprotein gồm 2 màng mỏng phospholipid. Trên bề
mặt có những protein G tạo những chồi gai có chiều dài 10 nm (Hình 1.1). Đây là
kháng nguyên chủ yếu kích thích cơ thể tạo ra kháng thể trung hoà và là ngưng kết
tố hồng cầu. Thành phần hoá học của virút dại gồm có 67% protein, 26% lipid, 1%
ARN và 3% cacbonhydrat [6].
6
Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại
Các protein cấu trúc của virút dại:
Mỗi hạt virút dại gồm có ARN sợi đơn và 5 protein [6].
1. Protein L (180 kDa) là ARN polymerase phụ thuộc ARN, hoạt động như
một emzym trong quá trình tổng hợp ARN.
2. Glycoprotein: Protein G (62-67 kDa) có hai đoạn kỵ nước tạo khả năng
xuyên màng của virút, chịu trách nhiệm tiếp xúc, nhận biết và gắn vào thụ thể
đặc hiệu trên bề mặt tế bào cảm thụ. Protein G có vai trò sinh bệnh học của virút
dại, chúng tạo nên khả năng ái tính với tế bào thần kinh, kích thích hệ miễn
dịch tạo kháng thể trung hoà và ngưng kết hồng cầu.
3. Nucleoprotein N: (54 Da) Protein N đóng vai trò cấu trúc chính trong quá
trình tạo vỏ cho ARN gen và bảo vệ bộ gen. Ngoài ra, nó còn có thể điều hoà sự cân
bằng giữa phiên mã và sao mã. Protein N là protein có tính bảo tồn nhất trong các
protein của virút dại, trình tự nucleotide của gen mã hoá cho protein N có độ tương
đồng cao trong cùng một genotype, nhưng lại rất khác nhau giữa các genotype khác
nhau. Chính vì vậy mà gen N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh dại
bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đồng thời cũng được sử dụng để nghiên cứu sự
tiến hoá cũng như dịch tễ học phân tử của nhóm Lyssavirrus.
7
4. Phosphoprotein NS hay M1 (37 kDa): Protein M có vai trò điều hoà ARN
polymerase phụ thuộc ARN trong quá trình polymer hoá.
5. Protein màng M2: (24 kDa) protein M2 chịu trách nhiệm về hình thái và
tiếp xúc qua lại với protein của tế bào.
Cấu trúc hệ gen:
Hệ gen của virút dại là một chuỗi ARN sợi âm, không phân nhánh có
hằng số lắng 45S và trọng lượng phân tử 4,6 x 106 Dalton, chứa khoảng 12000
nucleotide. Sợi ARN chứa 5 gen có trật tự sắp xếp được bắt đầu từ 3’-N-M1-M2-GL-5’. ARN sợi âm không có khả năng trực tiếp dịch mã tổng hợp protein của virút
mà phải thông qua việc tổng hợp ARN sợi dương bổ trợ (mARN).
Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại
ARN của virút dại không có khả năng lây nhiễm. ARN genome của chủng
PV (Pasteur virus) có 11932 nucleotide, 58 nucleotide đầu tiên từ vị trí 3’ của toàn
bộ genome là vùng không mã hóa và cũng chính là vùng mở đầu sao chép. Vùng
mở đầu sao chép này được hoạt hóa bởi bộ ba N, P và L protein. Ngay sau khi vùng
mở đầu sao chép được phiên mã thì 5 mARN mã hóa cho 5 protein cấu trúc của
virút là N, M1, M2, G và L lần lượt được tổng hợp và cuối cùng là vùng đuôi không
mã hóa gồm 70 nucleotide tận cùng ở phía đầu 5’ [6], [50], [56].
1.1.3. Dịch tễ học bệnh dại
Trên thế giới
Bệnh dại phổ biến trên toàn cầu, lưu hành ở trên 150 nước trên thế giới với
3,3 tỷ dân sống tại các vùng dịch lưu hành, từ châu Âu đến châu Á, châu Phi, Mỹ
La Tinh, trừ một số vùng không có bệnh dại như Vương Quốc Anh, Nhật Bản, vùng
8
Bắc Cực, Úc hay châu Đại Dương là những vùng đất “biệt lập”. Theo thống kê của
TCYTTG, hàng năm có khoảng 60000 người chết vì bệnh dại (99% trường hợp tử
vong này là do lây truyền virút dại từ chó, cứ 10 người chết vì bệnh dại thi có tới 4
trẻ em dưới 15 tuổi, 95% ca tử vong là ở châu Á và châu Phi) và 15 triệu người bị
phơi nhiễm bệnh dại phải đi điều trị dự phòng (trong đó 40% là trẻ em từ 5-14 tuổi
ở các nước châu Á và châu Phi), gây tổn thất kinh tế toàn cầu ước tính là 8,6 tỷ đô
la Mỹ mỗi năm. Cũng theo TCYTTG, nếu không được điều trị dự phòng, con số tử
vong có thể lên tới hơn 330 nghìn ngươi mỗi năm chiếm tới 80% số ca tử vong vì
bệnh này trên toàn thế giới. Số ca tử vong tâp trung ở các nước đang phát triển
thuộc khu vực Châu Phi (40%), Châu Á (55%). Các nước có số ca tử vong do bệnh
dại cao là Ấn Độ (20000 ngươi), Trung Quốc (3300), Băng-la-đét (1500), Nê-pan
(200). Trong khu vực Đông Nam Á, 8/11 nước có lưu hành bệnh dại (trừ Sing-gapo, Ma-lai-xi-a và Brunei). Từ năm 2004 đến nay bệnh dại tại các nước Châu Á,
đặc biệt khu vực Đông Nam Á đang có chiều hướng gia tăng, diễn biến phức tạp. Ở
Châu Á, mỗi năm có khoảng 26 triệu người được điều trị dự phòng sau phơi nhiễm,
trong đó riêng Trung Quốc là 15 triệu.
Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017
Tại châu Âu số lượng người đi điều trị dự phòng hằng năm chỉ khoảng
71500 người, bệnh dại chủ yếu xảy ra ở các nước CHLB Đức, Áo, Thuỵ Sĩ, Pháp,
Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Tiệp Khắc, Hung Ga Ry. Các quốc gia này mặc dù thường
9
- Xem thêm -