Tài liệu Nghiên cứu thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm

  • Số trang: |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 29 |
  • Lượt tải: 0
hoang

Tham gia: 04/11/2015

Mô tả:

MẠC VĂN TRỌNG BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM MẠC VĂN TRỌNG 2016 - 2018 HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SỸ NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHÁT LƯỢNG VẮCXIN DẠI TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO SẢN XUẤT Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM MẠC VĂN TRỌNG CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 8420201 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐỖ TUẤN ĐẠT HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Tuấn Đạt, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong công việc cũng như trong suốt quá trình học tập, và thực hiện các nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu, ban lãnh đạo Khoa, các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Sau Đại Học, Trường Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn thạc sĩ này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các anh chị em, các bạn đồng nghiệp phòng Công nghệ Cao, Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, đã nhiệt tình giúp đỡ, cùng chia sẻ các kinh nghiệm và kiến thức trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này. Cuối cùng, tôi muốn được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên khích lệ, động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua. Học Viên Mạc Văn Trọng MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh dại................................................................................... 3 1.1.1. Sơ lược về lịch sử bệnh dại ....................................................................... 3 1.1.2. Virút dại .................................................................................................... 5 1.1.3. Dịch tễ học bệnh dại.................................................................................. 8 1.2. Vắcxin phòng bệnh dại ................................................................................ 13 1.2.1. Các vắcxin thế hệ thứ nhất ...................................................................... 13 1.2.2. Các vắcxin thế hệ thứ hai ........................................................................ 16 1.2.3. Các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại được đề cập nghiên cứu sử dụng trên thế giới................................................................................... 22 1.3. Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại VABIOTECH ... 27 1.3.1. Tế bào Vero dùng trong sản xuất vắcxin dại .......................................... 27 1.3.2. Quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào tại VABIOTECH .................................................................................................... 29 1.3.3. Căn cứ và cơ sở thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào............................................................................................ 31 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 36 2.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 36 2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 36 2.2.1. Hóa chất................................................................................................... 36 2.2.2. Vắcxin, sinh phẩm, động vật thí nghiệm................................................. 38 2.2.3. Trang thiết bị ........................................................................................... 38 2.2.4. Dụng cụ ................................................................................................... 40 2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 41 2.3.1. Các phương pháp kiểm tra hóa lý ........................................................... 41 i 2.3.1.1. Kiểm tra tính chất vật lý ................................................................... 41 2.3.1.2. Kiểm tra pH ...................................................................................... 41 2.3.1.3. Kiểm tra hàm lượng Thimerosal ....................................................... 42 2.3.1.4. Kiểm tra hàm lượng Protein.............................................................. 44 2.3.1.5. Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư ...................................................... 44 2.3.1.6. Kiểm tra hàm lượng nhôm ............................................................... 47 2.3.2. Các phương pháp kiểm tính an toàn và công hiệu .................................. 48 2.3.2.1. Kiểm tra vô khuẩn ............................................................................ 48 2.3.2.2. Chuẩn độ hiệu giá virút dại trên chuột (LD50/ml) ............................ 48 2.3.2.3. Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phát hiện nucleocapsid của virút dại ( FFD50/0,05ml) ....................... 49 2.3.2.4. Chuẩn độ hiệu giá virút dại bằng phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên Glycoprotein của virút dại ( EL.U/ml) .................................. 52 2.3.2.5. Kiểm tra chất gây sốt........................................................................ 54 2.3.2.6. Kiểm tra an toàn chung chuột nhắt và chuột lang ............................ 54 2.3.2.7. Kiểm tra an toàn đặc hiệu................................................................. 55 2.3.2.8. Kiểm tra công hiệu ........................................................................... 56 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 60 3.1. Kết quả kiểm tra các thành phần hóa lý trong kiểm định vắcxin dại tế bào ......................................................................................................................... 60 3.1.1. Kiểm tra tính chất vật lý .......................................................................... 60 3.1.2. Kiểm tra pH. ............................................................................................ 61 Tiến hành kiểm tra pH vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào ở các giai đoạn chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.1 dưới đây. .................................................... 61 3.1.3. Kiểm tra hàm lượng Thimerosal ............................................................. 62 3.1.4. Kiểm tra hàm lượng protein tổng số ....................................................... 63 3.1.5. Kiểm tra hàm lượng nhôm ...................................................................... 65 3.1.6. Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư ........................................................... 66 3.2. Kết quả kiểm tra tính an toàn và công hiệu trong kiểm định vắcxin dại tế ii bào ......................................................................................................................... 68 3.2.1. Kiểm tra vô khuẩn ................................................................................... 68 3.2.2. Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại ........................................................ 70 3.2.3. Kết quả xác định hàm lượng kháng nguyên glycoprotein virút dại. ....... 74 3.2.4. Kết quả kiểm tra chất gây sốt .................................................................. 75 3.2.5. Kết quả kiểm tra an toàn chung .............................................................. 77 3.2.6. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu ........................................................... 79 3.2.7. Kết quả kiểm tra công hiệu ..................................................................... 81 3.3. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin dại tế bào ................ 82 3.3.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về thành phần hóa học ................................. 82 3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về tính an toàn và công hiệu ........................ 85 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................ 91 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 91 4.2. Kiến nghị ....................................................................................................... 92 TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 93 iii DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ABLV Australian Bat Lyssavirus ADN Deoxyribonucleic Acid Axit Deoxyribonucleic ARN Ribonucleic Acid Axit Ribonucleic ASEAN BSA Association of South East Asian Hiệp hội các nước Đông Nations Nam Á Bovine Serum Albumin BTP CDC Bán thành phẩm Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm soát bệnh Prevention tật và Dự phòng Hoa kỳ CHLB Cộng hoà Liên bang CPE Cytopathic effect Huỷ hoại tế bào CVS Challenge Virus Strain Chủng virút thử thách DĐVN EBLV Dược điển Việt Nam European Bat Lyssavirus ED50 Effective Dose 50 EIA Enzyme Immunoassay ELISA FAT FAVN FBS Liều bảo vệ 50% Enzyme - linked Immunosorbent Assay Fluorescent antibody test Fluorescent antibody virus neutralization Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bê iv Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt FFD50 Focus Forming Dose 50% GMP Good Manufacturing Practices HGKT IU Thực hành sản xuất tốt Hiệu giá kháng thể Đơn vị Quốc tế International Unit kDa KiloDalton LD50 Lethal Dose Liều gây chết 50% mARN Messenger RNA ARN thông tin MCB Master Cell Bank Ngân hàng tế bào giống gốc MEM Minimum Essential Media NICVB National Institute for Coltrol of Viện Kiểm định quốc gia Vaccine and Biological vắcxin và sinh phẩm y tế NIH National Institute Of Health PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction Viện sức khỏe quốc gia Hoa PV RFFIT RT-PCR Kỳ Phản ứng chuỗi polymerase Pasteur virus Rapid fluorescent focus inhihition test Reverse Transcription polymerase chain reaction SRID Single Radial Immunodiffusion SSC Saline - sodium citrate v PCR phiên mã ngược Phương pháp miễn dịch khuếch tán đơn Viết tắt TCA Tiếng Anh Tiếng Việt Trichloroacetic acid TCYTTG TE Tổ chức y tế thế giới Tris - EDTA Trách nhiệm hữu hạn một TNHH MTV thành viên Công VABIOTECH TNHH MTV Vắcxin và sinh phẩm số 1 VSDTTƯ WCB ty Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Working Cell Bank Ngân hàng tế bào sản xuất vi DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Số người tiêm vắcxin dại và số ca tử vong do bệnh dại tại Việt Nam 1991-2016.................................................................................................................. 10 Bảng 1.2: Các loại vắcxin dại thế hệ thứ nhất được sử dụng cho người và thú y ...... 13 Bảng 1.3: Các loại vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào và quy trình sản xuất ................ 19 Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra pH vắcxin dại tế bào ..................................................... 61 Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Thimerosal .................................................. 63 Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra hàm lượng nhôm ........................................................... 65 Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư BTP tinh khiết vắcxin dại tế bào ................................................................................................................................... 67 Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra vô khuẩn........................................................................ 68 Bảng 3.6: Kết quả chuẩn độ hiệu giá virút dại .......................................................... 71 Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra chất gây sốt ................................................................... 76 Bảng 3.8: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu hoá lý......................................................... 83 Bảng 3.9: Tiêu chuẩn cơ sở các chỉ tiêu an toàn và công hiệu ................................. 85 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại ................................................................................... 7 Hình 1. 2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại ............................................................ 8 Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017 ................................................. 9 Hình 1.4: Phân bố tỷ lệ chết do dại/100000 dân theo khu vực giai đoạn 1996-2017 ................................................................................................................................... 12 Hình 1.5: Phân bố số ca bệnh dại theo tỉnh năm 2017-2018 .................................... 12 Hình 1.6: Nguồn gốc của các chủng dại cố định được sử dụng để sản xuất vắcxin trên nuôi cấy tế bào. .................................................................................................. 18 Hình 1.7: Quy trình sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero tại Vabiotech ... 29 Hình 3.1: Kết quả kiểm tra tính chất vật lý Vắcxin dại tế bào ở các giai đoạn. ....... 60 Hình 3.2: Kết quả kiểm tra hàm lượng Protein tổng số vắcxin dại tế bào BTP tinh khiết .........................................................................................................................644 Hình 3.3:Hình ảnh kiểm tra hàm lượng AND tồn dư loạt sản xuất 0314 ................. 67 Hình 3.4: Hình ảnh ống thử nghiệm vô khuẩn vắcxin loạt 0215 trước và sau 14 ngày theo dõi ...................................................................................................................... 69 Hình 3.5: Hình ảnh chuột liệt do virus dại và hình ảnh nhiễm virút dại vào tế bào vero dưới kính hiển vi huỳnh quang trong các thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá ....... 73 Hình 3.6: Kết quả xác định hàm lượng glycoprotein. ............................................... 75 Hình 3.7: Đồ thị phân tích tổng nhiệt tăng của các loạt ........................................... 77 Hình 3.8: Kết quả kiểm tra an toàn chung vắcxin dại tế bào thành phẩm ................ 78 Hình 3.9: Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu BTP sau bất hoạt và BTP tinh khiết vắcxin dại tế bào........................................................................................................ 80 Hình 3.10: Kết quả kiểm tra công hiệu vắcxin dại tế bào ......................................... 81 viii MỞ ĐẦU Bệnh dại là bệnh nhiễm virút cấp tính của hệ thống thần kinh trung ương do virút thuộc họ Rhabdoviridae, giống Lyssavirus từ động vật lây sang người bởi chất tiết, thông thường là nước bọt của chó bị nhiễm virút dại. Hầu hết các trường hợp bị nhiễm virút dại đều qua vết cắn, vết liếm trên da, niêm mạc bị tổn thương. Kể cả người và động vật khi đã bị bệnh dại đều dẫn tới tử vong. Bệnh dại thuộc nhóm B trong Luật Phòng, chống bệnh truyền nhiễm [2], [5], [6]. Bệnh dại phổ biến trên toàn cầu, cả ở châu Âu, châu Á, châu Phi, châu Mỹ La tinh, trừ một số vùng không có bệnh dại như Vương quốc Anh, Nhật Bản, vùng Bắc cực, châu Đại Dương được gọi là những vùng đất “biệt lập”. Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) hàng năm có khoảng 55000 - 70000 người chết vì bệnh dại, trong đó hơn 90% được thông báo từ các nước đang phát triển ở châu Phi và châu Á. Ở Đông Nam Á (ASEAN) bệnh dại đang có xu hướng diễn biến phức tạp và có chiều hướng gia tăng trong những năm gần đây [2], [6]. Bệnh dại chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, do đó biện pháp tiêm vắcxin phòng bệnh dại để chủ động gây miễn dịch là phương thức hữu hiệu nhất trong phòng và điều trị bệnh dại hiện nay. Tại Việt Nam, trước năm 1974, vắcxin phòng bệnh dại cho người chủ yếu là vắcxin sản xuất từ não cừu, dê (Fermi, Semple). Từ năm 1974, Viện Vệ sinh dịch tễ học Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất vắcxin dại trên não chuột ổ theo phương pháp của Fuenzalida-Palacios được chuyển giao kỹ thuật từ Viện Pasteur Paris (Pháp). Tuy nhiên, theo kết quả báo cáo từ các Trung tâm Y tế Dự phòng trên cả nước, trên 80% các trường hợp sau khi tiêm vắcxin Fuenzalida có các phản ứng không mong muốn, các phản ứng không mong muốn nghiêm trọng như viêm não tủy gây liệt vĩnh viễn và tử vong gặp với tỷ lệ 1-2 trường hợp/10000 mũi tiêm, nên từ năm 2007, Bộ Y tế đã ra quyết định ngừng việc sử dụng vắcxin dại Fuenzalida trên toàn quốc thay thế bằng các vắcxin nhập ngoại sản xuất trên nuôi cấy tế bào trong đó chủ yếu là vắcxin Verorab của Hãng Aventis Pasteur. Tỷ lệ bệnh nhân được tiêm phòng bằng vắcxin trên nuôi cấy tế bào được nhập ngoại trước đây chỉ chiếm 15% số người được tiêm vắcxin dại và giá thành cho một liệu trình tiêm 1 loại vắcxin này rất đắt do đó cơ hội để các bệnh nhân nghèo, vùng sâu, vùng xa được tiêm loại vắcxin này là rất hạn chế. Do vậy, phát triển các vắcxin dại cho người đang đặt ra như là một yêu cầu rất cấp bách hiện nay Nhận được sự hợp tác và giúp đỡ của của Trung tâm Kiểm soát bệnh tật và Dự phòng Hoa kỳ (CDC) trong việc cung cấp các chủng giống sản xuất vắcxin dại, công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) đã nghiên cứu phát triển thành công quy trình công nghệ sản xuất vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero ở quy mô phòng thí nghiệm. Theo yêu cầu của các cơ quan quản lý, các nhà sản xuất thuốc và dược phẩm sinh học nói chung phải kiểm soát tối đa các sản phẩm, đảm bảo được chất lượng và các tiêu chuẩn kĩ thuật. Nhằm quản lý và đảm bảo chất lượng tốt tất cả các công đoạn trong quy trình sản xuất cũng như đảm bảo về an toàn và công hiệu cho người sử dụng vắcxin dại sản xuất trên nuôi cấy tế bào Vero thì yêu cầu cấp bách đặt ra là cần thiết lập được các phương pháp cũng như đưa ra các tiêu chuẩn trong kiểm định chất lượng vắcxin dại sản xuất trên tế bào Vero, do vậy chúng tôi thực hiện đề tài "Nghiên cứu thiết lập phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm" Các mục tiêu nghiên cứu của Đề tài 1. Thiết lập được các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm bằng cách tiến hành các phương pháp kiểm tra chất lượng vắcxin dại đã được khuyến cáo bởi các tổ chức (WHO, DĐVN4) ở điều kiện kiểm tra thực tế. 2. Xây dựng được bảng tiêu chuẩn cơ sở cho vắcxin dại trên nuôi cấy tế bào Vero sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh dại 1.1.1. Sơ lược về lịch sử bệnh dại Bệnh dại là một trong những căn bệnh cổ xưa nhất của động vật có thể truyền sang người một cách rủi ro khi có tiếp xúc với virút dại qua da hoặc niêm mạc bị tổn thương. Bệnh dại (rabies) xuất phát từ chữ Latin có nghĩa là “cuồng bạo, điên rồ”. Những người Hy Lạp cổ đã mô tả bệnh dại bằng từ lyssa nghĩa là “chứng điên khùng, rồ dại”. Bệnh dại là bệnh viêm não tuỷ cấp và viêm màng não nguyên phát của động vật có vú. Bệnh có thể truyền sang người qua niêm mạc hoặc da bị tổn thương. Từ hàng nghìn năm trước công nguyên, những người thầy thuốc cổ phương Đông đã viết về căn bệnh tương tự bệnh dại – bệnh sợ nước, sợ gió mà chó và người mắc phải. Bệnh dại cũng được người da đỏ, người Ả rập và người Do Thái cổ đề cập trong y văn với 5 dấu hiệu bệnh dại ở chó: mõm há, chảy nước dãi, tai rủ, đuôi cụp, giọng khàn và khuyến cáo nếu gặp các con vật có biểu hiện này phải tiêu diệt ngay bằng cung tên. Ở Ai Cập, Hy Lạp, La Mã người ta coi bệnh dại là sự trừng phạt của thượng đế vì sự bí mật của căn nguyên gây bệnh cũng như sự khủng khiếp của các triệu chứng lâm sàng [2], [5], [6]. Một trăm năm sau công nguyên, Celse đã biết rằng độc tố đã được truyền từ chó sang người và muốn loại bỏ độc tố này cần phải đốt vết thương bằng que sắt nung đỏ. Hai trăm năm sau công nguyên, Galien đã đề ra phương pháp phẫu thuật cắt bỏ phần cơ thể bị vết cắn để ngăn ngừa sự phát bệnh dại. Đầu thế kỷ 19, Zinke đã chứng minh được tính lây nhiễm có trong nước dãi của chó dại. Tại viện Lion, Galtier đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm trên thỏ và thử nghiệm gây miễn dịch cho cừu bằng cách tiêm nước bọt của con vật bị bệnh dại vào tĩnh mạch cón vật lành. Năm 1884, Louis Pasteur đã thành công trong việc nghiền não tuỷ của chó mắc bệnh dại sau đó gây nhiễm dưới màng cứng não thỏ. Tiếp tục nghiền não thỏ đã gây nhiễm truyền cho thỏ tiếp theo 3 và cứ tiếp tục như vậy sau hơn 100 lần tiêm truyền liên tiếp trên não thỏ ông đã thu được chủng virút có thời gian ủ bệnh thu ngắn và cố định 6 - 7 ngày, ông gọi đó là “virút dại cố định”. Pasteur cũng đã phát minh ra phương pháp bất hoạt virút dại gây nhiễm não tuỷ thỏ bằng cách làm khô dưới KOH tinh thể. Ông đã dùng não tuỷ thỏ bất hoạt này tiêm cho chó, sau đó dùng virút dại sống thử thách cho những con chó này và kết quả thí nghiệm đã giúp Pasteur tìm ra cách sản xuất vắcxin dại. Ngày 6 tháng 7 năm 1885, lần đầu tiên Pasteur đã dùng vắcxin não thỏ bất hoạt tiêm cho cậu bé 9 tuổi Joseph Meister, bị một con chó lên cơn dại cắn nhiều vết. Sau khi được tiêm 13 mũi vắcxin dại của Pasteur, cậu bé đã được cứu thoát khỏi bệnh dại. Trong vòng một năm sau đó có khoảng 2500 người bệnh đã được điều trị bằng vắcxin này và chỉ có 12 người bị chết [5], [6]. Vào những năm 80, ứng dụng tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử và sự phát triển của công nghệ sinh học người ta đã sử dụng kỹ thuật kháng thể đơn dòng để chẩn đoán các chủng virút dại gây bệnh ở người và động vật. Bằng kỹ thuật PCR, sequencing người ta đã có thêm nhiều hiểu biết về trật tự sắp xếp các gen và trình tự nucleotide của virút dại. Hiện nay, chẩn đoán bệnh dại trên người chủ yếu dựa vào các triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh và tiền sử phơi nhiễm với virút dại. Chẩn đoán xác định bệnh dại bằng các kỹ thuât xét nghiệm: phát hiện kháng nguyên (FAT), phân lâp virút, kỹ thuât sinh học phân tử (RT-PCR), phát hiện kháng thể (ELISA, RFFIT, FAVN). Tuy nhiên, trên thực tế do tính nguy hiêm của bệnh dại, nên khi bị động vât nghi dại cắn, ngươi bệnh phải được giám sát và điều trị dự phòng khẩn cấp mà không chờ chẩn đoán xác định bệnh dại ở động vât bằng xét nghiệm [2], [6]. Bệnh dại bản chất là bệnh thú y và lây nhiễm sang người qua vết cắn và vết cào xuyên da của động vật nhiễm. Lây truyền cũng có thể xảy ra khi chất lây nhiễm thường là nước bọt xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc hoặc tổn thương da mới của nạn nhân. Bệnh dại rất hiếm xảy ra do hít phải các chất tiết có chứa virút hoặc cấy ghép phủ tạng nhiễm bệnh. Đối với các ca bệnh ở người, giai đoạn ủ bệnh thường từ vài tuần đến vài 4 tháng nhưng cũng có thể thay đổi từ dưới 1 tuần đến trên 1 năm. Thời gian ủ bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng virút lây nhiễm, mức độ tổn thương và vị trí gần với thần kinh trung ương không của nơi virút xâm nhập [17], [59]. Virút lây nhiễm di chuyển vào hệ thống thần kinh trung ư ơng qua các dây thần kinh ngoại vi, khi đến não bộ virút nhân lên và phát tán ngược trở ra hệ thống thần kinh và nhiều phủ tạng khác nhau như tuyến nước bọt. Virút dại lan truyền đến toàn bộ cơ thể thì bắt đầu các triệu chứng khởi phát tuy nhiên lúc đó cơ thể không có được đáp ứng miễn dịch với virút [56]. Hiện chưa có thử nghiệm nào được sử dụng để chẩn đoán bệnh dại ở người trước khi bệnh khởi phát trên lâm sàng. Do vậy, chẩn đoán bệnh sẽ chỉ dựa trên tiền sử bệnh, các biểu hiện và triệu chứng có liên quan đến tình hình dịch tễ của bệnh trên động vật. Biểu hiện đầu tiên của bệnh dại thường là sốt nhẹ, đau và dị cảm tại vết thương. Khi virút lan truyền vào hệ thần kinh trung ương, viêm não tiến triển sẽ xuất hiện có các đặc trưng là sợ nước hoặc sợ gió, tăng động và mất ngủ, co giật toàn thân, sau đó một vài ngày sẽ ngừng thở ngừng tim. Bệnh dại gây liệt có thể xảy ra ở 30% ca bệnh ở người, tiến triển ít trầm trọng hơn tuy nhiên kết cục cuối cùng cũng là tử vong. Dạng bệnh dại này thường bị chẩn đoán nhầm là bệnh lý khác [59]. Các chất kháng virút, interferon và liều lượng cao huyết thanh kháng dại được sử dụng trong điều trị các ca bệnh ở người nhưng thường không tránh được nguy cơ tử vong. Cho dù hiện đã có 1 trường hợp bệnh dại lây truyền từ dơi được cứu sống sau khi dùng các thuốc gây ức chế thần kinh và thuốc kháng virút nhưng liệu trình điều trị tích cực này lại gặp thất bại khi áp dụng trên một số bệnh nhân khác cũng bị nhiễm dại do dơi [56]. 1.1.2. Virút dại Virút dại thuộc họ Rhabdoviridae, chi Lyssavirus, có vât liệu di truyền là ARN, vỏ ngoài là lipid. Có hơn 100 chủng phân bố trong tự nhiên có thể gây nhiễm cho động vật và thực vật. Virút dại có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ; dễ bị phá hủy bởi các chất hòa tan lipid (xà phòng, ether, chloroform, 5 acetone); rất nhạy cảm với tia cực tím và bị bất hoạt nhanh chóng trong dung dịch cồn và cồn iốt [2], [5], [6]. Trong chi Lyssavirus, virút dại cổ điển (các chủng virút hoang dại ở chó, mèo… và các chủng virút dại cố định) thuộc genotype đầu tiên trong 7 genotype của nhóm. Các virút thuộc các genotype còn lại thường gây bệnh ở động vật, tuy nhiên đã có những trường hợp tử vong do nhiễm các virút này ở người như nhiễm Lyssavirus dơi Úc (ABLV) hay nhiễm Lyssavirus dơi châu Âu (EBLV) [50], [56]. Hình thái: Virút dại có hình viên đạn một đầu tròn, đầu kia dẹt với đường kính trung bình 75 nm, chiều dài dao động từ 100 - 300 nm. Sự thay đổi về độ dài phản ánh sự hiện diện các hạt trung gian có cấu trúc không hoàn chỉnh với độ dài ngắn hơn khoảng từ 20 - 50% so với hạt virút hoàn chỉnh. Các hạt trung gian có bộ gen bị cắt xén và vì thế thiếu hụt một số chức năng của virút, chúng nhân lên một cách nhanh chóng và cạnh tranh tích cực với các virút có bộ gen bình thường trong quá trình tạo thành lớp vỏ bao [6]. Cấu trúc: Cấu trúc virút dại gồm lõi bên trong là chuỗi xoắn ribonucleoprotein, bao bọc bên ngoài là một lớp vỏ lipoprotein gồm 2 màng mỏng phospholipid. Trên bề mặt có những protein G tạo những chồi gai có chiều dài 10 nm (Hình 1.1). Đây là kháng nguyên chủ yếu kích thích cơ thể tạo ra kháng thể trung hoà và là ngưng kết tố hồng cầu. Thành phần hoá học của virút dại gồm có 67% protein, 26% lipid, 1% ARN và 3% cacbonhydrat [6]. 6 Hình 1.1: Cấu trúc hạt virút dại Các protein cấu trúc của virút dại: Mỗi hạt virút dại gồm có ARN sợi đơn và 5 protein [6]. 1. Protein L (180 kDa) là ARN polymerase phụ thuộc ARN, hoạt động như một emzym trong quá trình tổng hợp ARN. 2. Glycoprotein: Protein G (62-67 kDa) có hai đoạn kỵ nước tạo khả năng xuyên màng của virút, chịu trách nhiệm tiếp xúc, nhận biết và gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào cảm thụ. Protein G có vai trò sinh bệnh học của virút dại, chúng tạo nên khả năng ái tính với tế bào thần kinh, kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể trung hoà và ngưng kết hồng cầu. 3. Nucleoprotein N: (54 Da) Protein N đóng vai trò cấu trúc chính trong quá trình tạo vỏ cho ARN gen và bảo vệ bộ gen. Ngoài ra, nó còn có thể điều hoà sự cân bằng giữa phiên mã và sao mã. Protein N là protein có tính bảo tồn nhất trong các protein của virút dại, trình tự nucleotide của gen mã hoá cho protein N có độ tương đồng cao trong cùng một genotype, nhưng lại rất khác nhau giữa các genotype khác nhau. Chính vì vậy mà gen N được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh dại bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, đồng thời cũng được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hoá cũng như dịch tễ học phân tử của nhóm Lyssavirrus. 7 4. Phosphoprotein NS hay M1 (37 kDa): Protein M có vai trò điều hoà ARN polymerase phụ thuộc ARN trong quá trình polymer hoá. 5. Protein màng M2: (24 kDa) protein M2 chịu trách nhiệm về hình thái và tiếp xúc qua lại với protein của tế bào. Cấu trúc hệ gen: Hệ gen của virút dại là một chuỗi ARN sợi âm, không phân nhánh có hằng số lắng 45S và trọng lượng phân tử 4,6 x 106 Dalton, chứa khoảng 12000 nucleotide. Sợi ARN chứa 5 gen có trật tự sắp xếp được bắt đầu từ 3’-N-M1-M2-GL-5’. ARN sợi âm không có khả năng trực tiếp dịch mã tổng hợp protein của virút mà phải thông qua việc tổng hợp ARN sợi dương bổ trợ (mARN). Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virút dại ARN của virút dại không có khả năng lây nhiễm. ARN genome của chủng PV (Pasteur virus) có 11932 nucleotide, 58 nucleotide đầu tiên từ vị trí 3’ của toàn bộ genome là vùng không mã hóa và cũng chính là vùng mở đầu sao chép. Vùng mở đầu sao chép này được hoạt hóa bởi bộ ba N, P và L protein. Ngay sau khi vùng mở đầu sao chép được phiên mã thì 5 mARN mã hóa cho 5 protein cấu trúc của virút là N, M1, M2, G và L lần lượt được tổng hợp và cuối cùng là vùng đuôi không mã hóa gồm 70 nucleotide tận cùng ở phía đầu 5’ [6], [50], [56]. 1.1.3. Dịch tễ học bệnh dại Trên thế giới Bệnh dại phổ biến trên toàn cầu, lưu hành ở trên 150 nước trên thế giới với 3,3 tỷ dân sống tại các vùng dịch lưu hành, từ châu Âu đến châu Á, châu Phi, Mỹ La Tinh, trừ một số vùng không có bệnh dại như Vương Quốc Anh, Nhật Bản, vùng 8 Bắc Cực, Úc hay châu Đại Dương là những vùng đất “biệt lập”. Theo thống kê của TCYTTG, hàng năm có khoảng 60000 người chết vì bệnh dại (99% trường hợp tử vong này là do lây truyền virút dại từ chó, cứ 10 người chết vì bệnh dại thi có tới 4 trẻ em dưới 15 tuổi, 95% ca tử vong là ở châu Á và châu Phi) và 15 triệu người bị phơi nhiễm bệnh dại phải đi điều trị dự phòng (trong đó 40% là trẻ em từ 5-14 tuổi ở các nước châu Á và châu Phi), gây tổn thất kinh tế toàn cầu ước tính là 8,6 tỷ đô la Mỹ mỗi năm. Cũng theo TCYTTG, nếu không được điều trị dự phòng, con số tử vong có thể lên tới hơn 330 nghìn ngươi mỗi năm chiếm tới 80% số ca tử vong vì bệnh này trên toàn thế giới. Số ca tử vong tâp trung ở các nước đang phát triển thuộc khu vực Châu Phi (40%), Châu Á (55%). Các nước có số ca tử vong do bệnh dại cao là Ấn Độ (20000 ngươi), Trung Quốc (3300), Băng-la-đét (1500), Nê-pan (200). Trong khu vực Đông Nam Á, 8/11 nước có lưu hành bệnh dại (trừ Sing-gapo, Ma-lai-xi-a và Brunei). Từ năm 2004 đến nay bệnh dại tại các nước Châu Á, đặc biệt khu vực Đông Nam Á đang có chiều hướng gia tăng, diễn biến phức tạp. Ở Châu Á, mỗi năm có khoảng 26 triệu người được điều trị dự phòng sau phơi nhiễm, trong đó riêng Trung Quốc là 15 triệu. Hình 1.3: Lưu hành bệnh dại trên thế giới năm 2017 Tại châu Âu số lượng người đi điều trị dự phòng hằng năm chỉ khoảng 71500 người, bệnh dại chủ yếu xảy ra ở các nước CHLB Đức, Áo, Thuỵ Sĩ, Pháp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ba Lan, Tiệp Khắc, Hung Ga Ry. Các quốc gia này mặc dù thường 9
- Xem thêm -