Tài liệu Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2016 Thái Nguyên, năm 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN ĐÌNH DUY KHANH Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR TET-OFF MANG GENE ĐIỀU KHIỂN TÍNH TRẠNG GIỚI TÍNH TRÊN MUỖI AEDES AEGYPT” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Lớp : K44 CNSH Khoa : CNSH-CNTP Khóa học : 2011-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Văn Hạnh Phòng Công nghệ phôi – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. ThS. Vi Đại Lâm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2016 i LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này với sự nỗ lực của cá nhân, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: TS. Nguyễn Văn Hạnh, Th.S. Vi Đại Lâm, Th.S. Đỗ Trung Kiên và Th.S. Lê Bắc Việt, người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, các anh chị làm việc tại phòng Công nghệ phôi - Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên,20 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Đình Duy Khanh ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài .............................................. 15 Bảng 3.2: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-2 ................................................ 18 Bảng 3.3: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 và P2 tạo đoạn gene P1-2 ............. 18 Bảng 3.4: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P5-6 ................................................ 20 Bảng 3.5:Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P5 và P6 để tạo đoạn gene P5-6 ......... 21 Bảng 3.6: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt đối với sản phẩm tinh sạch PCR của đoạn gene P1-2 và P5-6 ..................................................................................................... 21 Bảng 3.7: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P1-6 ................................................ 22 Bảng 3.8: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P1 và P6 để tạo đoạn P1-6 ................. 23 Bảng 3.9: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đoạn gene P3-4 ................................................ 23 Bảng 3.10: Chu trình nhiệt PCR sử dụng mồi P3 và P4 để tạo đoạn P3-4 ............... 24 Bảng 3.11: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt đối với sản phẩm tinh sạch PCR của đoạn gene P1-6 và P3-4 ..................................................................................................... 24 Bảng 3.12: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt của vector pTet-Dual OFF bằng hai enzyme BamHI và HindIII ........................................................................................ 25 Bảng 3.13: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt của P16-34 và pTRE-Tight-BI bằng hai enzyme BamHI và HindIII ........................................................................................ 26 Bảng 3.14: Tỉ lệ thành phần PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 ............. 27 Bảng 3.15: Chu trình nhiệt PCR tạo đầu nối cho pTRE-Tight-BI-P16-34 ............... 27 Bảng 3.16: Tỉ lệ thành phần phản ứng cắt của DNA plasmid pTet-Dual OFF và sản phẩm PCR pTRE-Tight-BI bằng hai enzyme PspXI và XhoI .................................. 28 Bảng 3.17: Tỉ lệ thành phần PCR khuẩn lạc E.coli biến nạp .................................... 30 Bảng 3.18: Tỉ lệ thành phần phản ứng nối sau khi cắt bằng enzyme cắt .................. 32 iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc của vector pTet-Dual-OFF (Catalog No. 631113) ....................... 7 Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của pTet-Dual-OFF ........................................................ 8 Hình 2.3: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI (Catalog No. 631068) ............................... 9 Hình 4.1: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết và tinh sạch DN muỗi Aedes aegypti ....................................................................................................................... 33 Hình 4.2a: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P1-2 ....................... 34 Hình 4.2b: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch sau khi PCR của đoạn gene P1-234 Hình 4.3a: Kết quả giải trình tự của đoạn gene P1-2 ................................................ 35 Hình 4.3b: Kết quả so sánh giải trình tự đoạn gene P1-2 với đoạn gene Tra-2 RNAi35 Hình 4.4a: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P3-4 ....................... 36 Hình 4.4b: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của đoạn gene P3-4 ........................... 36 Hình 4.5a: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gene P5-6 ....................... 37 Hình 4.5b: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch sau khi PCR của đoạn gene P5-6 ........................................................................................................................... 37 Hình 4.6a: Kết quả điện di sản phẩm cắt của P1-2 và P5-6 bằng enzyme SalI ........ 38 Hình 4.6b: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch của P1-2 và P5-6 sau khi cắt bằng enzyme SalI ............................................................................................................... 38 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm cắt P3-4 và P5-6 bằng Acc65I ......................... 39 Hình 4.8a: Kết quả điện di sản phẩm nối của đoạn P1-2 và P5-6............................. 40 Hình 4.8b: Kết quả điện di sản phẩm nối của đoạn P3-4 và P5-6 ............................ 40 Hình 4.9a: Kết quả điện di sản phẩm cắt pJET P1-6 bằng enzyme HindIII và Acc65I41 Hình 4.9b: Kết quả điện di sản phẩm cắt pJET P3-4 bằng enzyme HindIII và Acc65I ....................................................................................................................... 41 Hình 4.10a: Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt vector pJET P1-6 và pJET P3-4 bằng enzyme HindIII và Acc65I ........................................................................................ 42 Hình ảnh 4.10b: Kết quả tinh sach DNA plasmid pJET P16-34 sau khi biến nạp ... 42 iv Hình 4.10c: Kết quả điện di sản phẩm pJET P16-34 sau khi cắt bằng enzyme HindIII và BamHI ..................................................................................................... 43 Hình 4.10d: Kết quả tinh sạch đoạn P16-34 (Tra-2 RNAi) sau khi cắt bằng HindIII và BamHI từ DNA plasmid pJET P16-34................................................................. 43 Hình 4.11a: Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt của vector pTRE-Tight-BI và pJET p1634 bằng enzyme BamHI và HindIII .......................................................................... 44 Hình 4.11b: Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt của vector pTRE-Tight-BI và P16-34 bằng enzyme BamHI và HindIII ............................................................................... 44 Hình 4.12a: Kết quả biến nạp vector pTRE-Tight-BI và P16-34 tạo vector pTRETight-BI-P16-34 vào tế bào khả biến E.coli DH5α .................................................. 45 Hình 4.12b: Kết quả PCR kiểm tra từng khuẩn lạc biến nạp tạo vector pTRE-TightBI-P16-34 .................................................................................................................. 45 Hình 4.13: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA plasmid pTRE-TightBI-P16-34 và sản phẩm cắt DNA plasmid pTRE-Tight-BI-P16-34 bằng enzyme BamHI và HindIII để kiểm tra đoạn chèn P16-34 .................................................... 46 Hình 4.14a: Khuẩn lạc E.coli mang vector pTet-Dual OFF ..................................... 47 Hình 4.14b: Kết quả điện di tinh sạch DNA plasmid pTet-Dual OFF ..................... 47 Hình 4.15: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt của vector pTet-Dual OFF bằng BamHI và XhoI ......................................................................................................... 47 v DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Ampr Kháng kháng sinh Ampicillin Bp Base pair – Cặp bazơ nitơ cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid DNA Deoxyribonucleic Acid Dox Doxycyline E.coli Escherichia coli Kb Kilo base – Kilo bazơ nitơ LB Lauria Broth miRNA Micro Ribonucleic Acid mRNA Messenger Ribonucleic Acid– RNA thông tin MSC I Multiple cloning site I MSC II Multiple cloning site II PCR Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi trùng hợp RIDL Release of Insects carrying a Dominant Lethal RNA Ribonucleic Acid RNAi Interference Ribonucleic Acid– RNA can thiệp SIRM Sterile Insect Release Method SiRNA Smal interfering Riboncleic Acid SIT Sterile Insect Techmique – Kĩ thuật vô trùng côn trùng TAE Tris-acetate-EDTA Tet Tetracyline Tet-OFF pTet-Dual OFF tTA Tetracycline-repressible transactivato Tra-2 RNAi Transformer-2 Interference Ribonucleic Acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3indoly-β-D-galactoside vi MỤC LỤC PHẦN 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề: ................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu: ................................................................................. 2 1.3. Mục đích nghiên cứu:................................................................................. 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài: .................................................. 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3 2.1. Cơ sở khoa học ........................................................................................... 3 2.1.1. Bối cảnh thực hiện ý tưởng đề tài. .......................................................... 3 2.1.2. Genee biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti ( Transformer-2 RNAi)........................................................................................ 5 2.1.3. Vector Tet-OFF (pTet-Dual OFF) .......................................................... 6 2.1.4. Vector pTRE-Tight-BI ............................................................................ 9 2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .............................................. 11 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 11 2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 12 PHẦN 3: ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 13 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu............................................................ 13 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 13 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................... 13 3.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 13 3.2.1. Hóa chất................................................................................................. 13 3.2.2. Thiết bị .................................................................................................. 15 3.2.3. Vật liệu .................................................................................................. 15 vii 3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................ 16 3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 16 3.5. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 16 3.5.1. Tách chiết và tinh sạch DNA muỗi Aedes aegypti ............................... 16 3.5.2. PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti ............................................................................................................. 17 3.5.3. Thiết kế vector pTet-Dual-OFF mang gene quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti (Tra-2 RNAi kẹp tóc).............................................. 25 3.5.4. Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến để chọn dòng, nuôi sinh khối và tách DNA plasmid. ..................................................................... 28 3.5.5. Phương pháp nối bằng bộ Kit Ligation (M0202) ................................. 32 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 33 4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch DNA muỗi Aedes aegypti ...................... 33 4.2. Kết quả PCR phân lập đoạn gene quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. ................................................................................................. 33 4.3. Kết quả thiết kế vector pTET-Dual-OFF, lai ghép chèn đoạn DNA quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti vào vector. ....................... 43 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 48 5.1. Kết luận .................................................................................................... 48 5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 55 I. Tài liệu Tiếng Việt ....................................................................................... 49 II. Tài liệu Tiếng Anh...................................................................................... 50 III. Tài liệu Internet ......................................................................................... 50 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề: Trên thế giới, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ước tình hằng năm có khoảng 2,5 – 3 tỷ người có nguy cơ mắc bệnh do muỗi truyền nhiễm như sốt rét, sốt vàng da, sốt nhiệt đới (sốt dengue), đặc biệt cuối năm 2015 và đầu 2016 đến nay suất hiện bệnh virus Zika. Trong 50- 100 triệu người mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti, khoảng 500.000 trường hợp mắc bệnh do muỗi Aedes aegypti phải điều trị, trong đó 90% là trẻ em dưới 15 tuổi, tỉ lệ tử vong do muỗi Aedes aegypti là 5%. Bệnh lưu hành nhiều nhất ở vùng Đông Nam Á và Thái Bình Dương trên 100 nước thuộc khu vực khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới [8], [1]. Hiện nay Việt Nam là một trong những nước có bệnh dịch lưu hành, bệnh chiếm tỉ lệ cao trong các bệnh truyền nhiễm ở Việt Nam, là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong cho trẻ và tình trạng quá tải cho các bệnh viện trong mùa dịch. Từ năm 1960 đến nay dịch có xu hướng lan rộng và phát triển. Ở Tây Nguyên những năm có dịch lớn 1983, 1987,1988, 1991, 1995 và 2004 với số mắc từ 54,80 đến 553,38/100.000 dân số và chết từ 0,08 – 1,34/100.000 dân [6], [4], [5],[3]. Năm 2008, các tỉnh phía Nam, 78.414 trường hợp mắc, 85 trường hợp chết, tỉnh Cà Mau có số bệnh nhân là 8.284, tử vong 8 trường hợp [20]. Năm 2009 cả nước có số bệnh nhân chết là 105.370/87 [21]. Để giải quyết vấn đề trên, nhiều hướng nghiên cứu đã được thử nghiệm và áp dụng. Các nhà khoa học trên thế giới đã thành công trong việc tạo ra muỗi biến đổi gene bằng kĩ thuật DNA tái tổ hợp. Những con muỗi đực biến đổi gene sẽ được thả ra ngoài môi trường và giao phối với muỗi cái tự nhiên tạo ra thế hệ muỗi con bị khiếm khuyết và chết trước khi trưởng thành [19], [20]. Các nhà khoa học Mỹ tại Đại học Rocckefeller đã nghiên cứu tạo muỗi biến đổi gene không phát hiện được mùi của người, hạn chế quá trình lây truyền bệnh tật qua loài trung gian này [19]. Ở Việt Nam hiện nay, ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp không còn là một vấn mới mẻ, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu áp dụng Công nghệ Sinh học để tạo sinh vật biến đổi gene nhằm tạo ra những sản phẩm ứng dụng vào thực tiễn. Xuất phát từ tính cấp thiết của các căn bệnh nguy hiểm lây truyền qua muỗi 2 Aedes aegypti và dựa vào các bước phát triển mới nhất của Công nghệ Sinh học hiện đại, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thiết kế vector Tet– OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu lâu dài của đề tài nghiên cứu - Thiết kế vector Tet-OFF điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. Mục tiêu trƣớc mắt của đề tài nghiên cứu - Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số của muỗi Aedes aegypti. - Phân lập được đoạn gene Tra-2 RNAi quy định tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. - Bước đầu gắn lõi Tra-2 RNAi vào vector pTRE-Tight-BI để chuẩn bị gắn vào vector đích pTet-Dual OFF. - Nắm được các phương pháp PCR; Phương pháp thiết kế tạo vector; Phương pháp cắt và nối các đoạn DNA vào vector; Phương pháp biến nạp vào tế bào E.coli khả biến. 1.3. Mục đích nghiên cứu: - Thiết kế thành công vector Tet-OFF có khả năng hoạt động định hướng điều khiển tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiến của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Điều khiển chủ động tính trạng giới tính của muỗi Aedes aegypti, tạo tiền đề cho các nghiên cứu về sự biểu hiên tính trạng trên muỗi Aedes aegypti. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Sản phẩm của nghiên cứu góp phần mở ra hướng nghiên cứu mới giúp tiêu diệt hoặc làm giảm số lượng quần thể muỗi Aedes aegypti trong tự nhiên. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cơ sở khoa học 2.1.1. Bối cảnh thực hiện ý tưởng đề tài Hiện nay có nhiều phương pháp để kiểm soát quần thể côn trùng nói chung và loài muỗi nói riêng. Điển hình như phương pháp SIT (Công nghệ tạo côn trùng vô sinh) hay còn gọi với cái tên SIRM (Phương pháp giải phóng côn trùng vô sinh). Mô hình của SIRM dựa trên các thông số quần thể thu được từ một thử nghiệm quy mô lớn để tiêu diệt ấu trùng ruồi lần đầu tiên được phát triển bởi Ito. Các phương pháp SIT tạo ra côn trùng đực vô sinh và thả chúng vào môi trường sống tự nhiên các con đực sẽ tìm kiếm con cái tự nhiên để giao phối. Những con cái sẽ bị vô sinh hoặc đẻ con mà không thể phát triển lên đến giai đoạn có hại. Tuy nhiên, các côn trùng được tạo ra bằng phương pháp SIT cần phải trải qua một bước để loại bỏ phân hóa giới tính giới cái. Lý do là ở nhiều loài côn trùng, con cái thậm chí vô sinh, nếu được phát hành, nó sẽ tìm kiếm thức ăn là dịch huyết và có thể truyền bệnh (ở muỗi) hoặc gây thiệt hại hoa quả (ở ruồi Địa Trung Hải). Trong cách tiếp cận khác, tia X và tia Gamma được sử dụng để dời một đoạn nhiễm sắc thể mang gene mã hóa cho các màu sắc khác biệt của tinh trùng đực và trứng. Tuy nhiên, các chủng đột biến tạo ra bởi bức xạ thường đi kèm với một sự suy giảm đáng kể trong khả năng cạnh tranh giao phối so với con đực trong tự nhiên của nó. Điều này có thể dẫn đến thất bại trong chiến lược kiểm soát nếu áp dụng cho việc giải phóng côn trùng đực biến đổi gene vào tự nhiên. Bên cạnh đó, phương pháp phóng xạ đang không chuyên biệt cho những mục tiêu nhất định, các bức xạ không chỉ gây ra những đột biến lớn trong các hệ thống nhiễm sắc thể của sinh vật mục tiêu mà còn có thể nguy hiểm cho người sản xuất. Đây cũng là một phương pháp đắt tiền với nhiều hạn chế. Để tránh ảnh hưởng từ bức xạ, một phương pháp mới có tên RIDL (Release of Insects carrying a dominant lethal) đã được báo cáo trong một bằng sáng chế. Các RIDL cung cấp một giải pháp cho các hạn chế, nhiều nhược điểm của SIT 4 truyền thống đã áp dụng cho muỗi như đã đề cập ở trên. RIDL khác với SIT thông thường trong đó các loài côn trùng giải phóng không được xử lý bằng bức xạ nhưng vô sinh, là kết quả của một homozygote (đồng hợp tử) cho một gene gây tử vong chi phối. Hiệu quả hệ thống RIDL đã được chứng minh lần đầu tiên trong mô hình ruồi giấm và gần đây là ruồi Địa Trung Hải. Hệ thống này khai thác một nhóm Tetracycline - repressible transactivator (tTA) để kiểm soát biểu hiện những ảnh hưởng gây chết. Các nhóm Tetracycline (Tet) tạo môi trường nuôi ấu trùng hoặc thức ăn, Tet liên kết với tTA ngăn không cho nó liên kết với chuỗi TetO (Tetracycline operator) và thúc đẩy gene mục tiêu. Các trình tự TetO đóng vai trò điều hành tetracycline sẽ được tự do để ngăn chặn gene gây tử vong. Trong trường hợp không có Tet, protein tTA liên kết với các trình tự điều hành và gene mục tiêu sẽ được tự do biểu hiện. Trong môi trường tự nhiên, nếu Tet vắng mặt, phát tán con đực chuyển gene giao phối với con cái hoang dã, con cái của nó sẽ bị chết bởi sự kích hoạt gene mục tiêu. Trong muỗi Aedes aegypti, RIDL đã được chứng minh là có hiệu quả, trong đó những con đực được tạo ra chưa bị từ chối kết đôi với loài của chúng khi cạnh tranh với các con đực ngoài tự nhiên. Tuy nhiên, phương pháp RIDL có một thiếu sót nghiêm trọng đó là vẫn tạo ra con ở cả hai giới. Do đó nó cần một bước bổ sung phân biệt giới tính để loại bỏ con cái trước khi giải phóng. Một phương pháp mới được đưa ra để kiểm soát quần thể muỗi, khắc phục những nhược điểm của các phương pháp trước đó. Sử dụng các nguyên tắc của phương pháp RIDL kết hợp với một phát hiện của nhiễm sắc thể X (m), mang tác dụng giết chết tinh trùng loại X (male) có nhiễm sắc thể X nhận từ con đực do hệ thống gene Tra-2 RNAi. Do đó, các con muỗi culicinae biến đổi gene được sản xuất hơn 90% con đực. Loài muỗi mang một hoặc nhiều locus của cấu trúc Tra-2 RNAi. Các biểu hiện Tra-2 RNAi là có điều kiện, trong đó các biểu hiện gây ra một hiệu ứng knockdown (khóa, câm lặng) vào gene nội sinh Tra-2. Kết quả giết chết tinh trùng loại X(m), tinh trùng loại Y(M) sống sót và tạo ra 100% muỗi đực mang thông tin di truyền Tra-2 RNAi [14]. 5 2.1.2. Genee biểu hiện tính trạng giới tính trên muỗi Aedes aegypti ( Transformer-2 RNAi). RNAi là một quá trình sinh học trong đó RNA phân tử ức chế biểu hiện gene, thường bằng cách gây ra sự phá hủy của mRNA phân tử. Về mặt lịch sử, nó được gọi bằng tên khác, bao gồm cả đồng ức chế, sự câm lặng sau phiên mã gene. Chỉ sau khi các quá trình dường như không liên quan đã được hoàn toàn hiểu rõ nó trở nên rõ ràng rằng tất cả các quá trình đều mô tả các hiện tượng can thiệp RNA. Andrew Fire và Craig C. Mello chia sẻ năm 2006 giải Nobel Sinh lý học và Y học cho công việc của họ về sự can thiệp RNA ở giun. Kể từ khi phát hiện ra các RNAi (RNA can thiệp) và tiềm năng điều tiết của nó, nó đã trở nên rõ ràng rằng RNAi có tiềm năng to lớn trong việc ức chế gene mong muốn. RNAi bây giờ được gọi là chính xác, hiệu quả, ổn định và tốt hơn so với công nghệ antisense ức chế gene. Hai loại axit ribonucleic (RNA): Phân tử- microRNA (miRNA) và RNA can thiệp (siRNA)- là các yếu tố trung tâm của sự can thiệp RNA. RNA là những sản phẩm trực tiếp của gene và các RNA nhỏ có thể gắn kết với các RNA nhất định (mRNA) và tăng hoặc giảm các hoạt động của chúng, ví dụ bằng cách ức chế một mRNA không tạo ra được một protein. RNAi có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào chống lại virut và transposon [17]. RNAi là một công cụ nghiên cứu có giá trị, cả trong nuôi cấy tế bào và trong các sinh vật sống, bởi vì tổng hợp RNA mạch kép đưa vào tế bào chọn lọc, có thể gây ức chế gene quan tâm. RNAi có thể được sử dụng cho các mô hình có quy mô lớn có thể giúp xác định các thành phần cần thiết cho một quá trình của tế bào cụ thể hoặc một sự kiện như phân chia tế bào. RNAi cũng được sử dụng như một công cụ thiết thực trong công nghệ sinh học, y học và thuốc trừ sâu [15]. Gene Transformer-2 (Tra-2) là gene tác động đến giới tính của loài côn trùng nói chung và loài muỗi nói riêng. Tra-2 tác động vào tế bào soma và sự sinh tinh của con đực. Gene Tra-2 còn là một trong số ít gene xác định giới tính ở các loài côn trùng, ví dụ loài ruồi giấm Drosophila melanogaster [11]. Các chức năng của Tra-2 là cần thiết trong tế bào soma của con cái, cùng với transforner (Tra), cho 6 biểu hiện của các gene doublesex (DSX) ở con cái. Thiếu các chức năng Tra-2 hoặc Tra dẫn đến một sự biểu hiện tạo thành con đực của gene DSX [16]. Dẫn đến sự biến đổi giới tính của con cái (XX) thành con đực vô sinh, gọi là pseudomales (con đực giả). Đột biến gene Tra hoặc Tra- 2 không ảnh hưởng tới sự phân biệt giới tính của các tế bào soma của con đực (XY). Điều khiển thành công các gene Tra-2 ở muỗi là cần thiết để tạo ra dòng chuyển gene vĩnh viễn với cấu trúc Tra-2 RNAi, do đó các hiệu ứng giao thoa sẽ được biểu hiện ổn định trong các giai đoạn sinh tinh. Chúng tôi thấy rằng knockdown (khóa, câm lặng) gene Tra-2 trong muỗi có thể gây chết tinh trùng mang nhiễm sắc thể X(m) và do đó chỉ có tinh trùng mang nhiễm sắc thể Y(M) là sống sót và sẽ sinh ra con đực. Những con đực mang nhiễm sắc thể aY. Con đực được tạo ra bằng phương pháp này là không vô sinh nhưng nó sản xuất tinh trùng chứa nhiễm sắc thể Y khỏe mạnh. Về mặt lý thuyết, những con đực này sẽ phát triển thành quần thể tự nhiên, cho đến khi quần thể đã tuyệt diệt [10]. Đoạn gene Tra-2 RNAi là sự kết hợp của ba đoạn gene exon được phân lập từ gene Tra-2 của muỗi Aedes aegypti. Trong đó có hai đoạn gene có cùng trình tự nhưng ngược chiều nhau, còn đoạn gene thứ ba nằm xen giữa hai đoạn gene. Ở muỗi, gene Tra-2 có vùng tương đồng cao nhất là RRMs (RNA recognition motives) với chiều dài khoảng 240bp và 150bp, có thể khuyếch đại thành công khi sử dụng một số mồi được thiết kế. Hai đoạn gene tương đồng ngược chiều nhau được sử dụng để tạo đoạn gene Tra-2 RNAi sẽ là vùng có kích thước 240bp. Còn đoạn xen kẽ thứ ba có kích thước 150bp. Mục đích của việc thiết kế đoạn gene Tra-2 RNAi là tạo ra RNAi kẹp tóc thông qua quá trình phiên mã, nhằm gây chết tinh trùng X (m) và chỉ tạo ra dòng muỗi đực [18]. 2.1.3. Vector Tet-OFF (pTet-Dual OFF) Cấu trúc của vector pTet-Dual OFF như hình 2.1: 7 Hình 2.1: Cấu trúc của vector pTet-Dual-OFF (Catalog No. 631113) - PCMV IE (Promoter của cytomegalovirus): 7 – 606 - Tet-Off Advanced: 634 – 1380 - IRES2 (vị trí tương tác với ribosome thu nhận từ encephalomyocarditis): 1389–1973 - ZsGreen1 (protein Zoanthus sp huỳnh quang màu xanh): 1979-2674 - SV40 PolyA: 2712-2901 - ColE1 ori (khởi đầu sao chép): 3077-3501 - Ampr (Gene kháng ampicillin; Beta-Lactamase): 3842-4837 pTet Dual OFF đồng biểu hiện chất kích hoạt phiên mã Tet OFF Advance, liên quan đến quá trình kiểm soát sự tương tác với Tet và protein fluorescent xanh ZsGreen 1. Tet-OFF Advanced là một tổ hợp của chất ức chế Tet với 3 domains nhỏ có chức năng kích thích phiên mã của loại F (F-type), thu nhận từ protein VP16 của virut herpes (gây bệnh mụn rộp). Gene mã hóa cho Tet-OFF Advanced được tổng hợp hoàn toàn không có các vị trí cắt nối (splice sites) và sử dụng các codon thuận lợi cho sự biểu hiện bền vững trong các tế bào động vật có vú. ZsGreen 1 là một biến thể đã được tối ưu hóa có nguồn gốc từ protein fluorescent xanh của loài xan 8 hô Zoanthus sp (ZsGreen) mà đã được cải biến để cho fluorescent mạnh hơn (ngưỡng phát xạ tối đa: 493-505 nm). Vector đồng biểu hiện cả ZsGreen 1 và Tet-OFF Advanced từ một sản phẩm phiên mã mRNA dạng bicistronic (biểu hiện cả hai sản phẩm protein độc lập trên một phân tử mRNA). Sự biểu hiện đạt được một cách mạnh mẽ nhờ promoter PCMV IE của cytomegalovirus (CMV một loại virus ở người, ít khi phát hiện triệu chứng, nguy hiểm ở phụ nữ mang thai). Ở giữa Tet-OFF Advanced và ZsGreen 1đặt một vị trí tương tác với ribosome có tên là IRES2 thu nhận từ con virus có DNA sợi đơn tên là EMCV (encephalomyocarditis virus), hỗ trợ trong việc dịch mã một cách độc lập protein ZsGreen 1 với một vị trí bắt đầu tại điểm nối IES2/ZsGreen 1. Việt này đảm bảo cho tỉ lệ biểu hiện cao của protein ZsGreen 1 cùng với việc biểu hiện Tet-OFF Advanced, điều này cho phép ZsGreen 1 được dùng như một chất chỉ thị cho một quá trình chuyển nhiễm hiệu quả và như một marker cho việc chọn lọc bằng kĩ thuật flow cytometry. Vector này nó cũng chứa điểm khởi đầu sao chép tên là CoIE 1 và một gene kháng kháng sinh Ampicillin (Ampr ) để cho phép việc nuôi cấy nhân giống và chọn lọc ở vi khuẩn E.coli. Cơ chế hoạt động của hệ thống pTet-Dual OFF như hình 2.2: Hình 2.2: Cơ chế hoạt động của pTet-Dual-OFF 9 Promoter PCMV của hệ thống pTet-OFF khởi đầu quá trình phiên mã của tetR và VP16, tổ hợp của hai gene này gọi là tTA. Khi bổ xung Doxycyline (Dox) hoặc Tetracyline (Tet) vào môi trường, kháng sinh sẽ kết hợp với tTA làm thay đổi cấu hình không gian của tTA, ngăn cản sự liên kết của tTA vào TRE làm cho hoạt động của promoter PminCMV bị ức chế, ngăn cản phiên mã của gene đích (hình 2.2). Khi môi trường không có Dox, tTA liên kết vào TRE làm cho promoter PminCMV hoạt động khởi đầu quá trình phiên mã của gene mục tiêu. Vector pTet- Dual OFF được sử dụng để phát triển các dòng tế bào ổn định biểu hiện Tet-OFF Advanced. Các dòng tế bào này được sử dụng kết hợp với các vector đáp ứng với Tet như là pTRE- Dual2, để tạo thành hệ thống biểu hiện gene được điều hòa cảm ứng bởi kháng sinh Doxycyline, hệ thống này biểu hiện một gene quan tâm nào đó dưới sự kiểm soát của yếu tố tương tác Tet (TRE) trong promoter Ptight. ZsGreen 1 là protein fluorescent xanh thương mại hóa phát tín hiệu màu mạnh nhất. Việc xuất hiện của protein này cho phép yếu tố chuyển nhiễm được phát hiện bằng mắt thường dưới kính hiển vi huỳnh quang và được phân loại bằng kĩ thuật flow cytometry với một tập hợp các màng lọc chuẩn FITC ( ZSGreen 1 có ngưỡng kích thích tối đa là 493nm và phát xạ tối đa 505nm) [12]. 2.1.4. Vector pTRE-Tight-BI Cấu trúc của vector pTRE-Tight-BI như hình 2.3: Hình 2.3.: Cấu tạo vector pTRE-Tight-BI (Catalog No. 631068) 10 - Ptight Tet-responsive promoter: –70–322 - Tet response element (TREmod): 3–252 - Fragment containing PminCMV-1: 258–317 - Fragment containing PminCMV-2: 2856–2788 - Multiple cloning site I (MCS I): 335–405 - Multiple cloning site II (MCS II): 2782–2726 - Fragment containing SV40 polyA signal-1: 417–617 - Fragment containing SV40 polyA signal-2: 2726–2533 - Fragment containing ColE1 origin of replication: 780–1379 - Ampicillin resistance genee (β-lactamase): 2536–1540 pTRE-Tight-BI là một plasmid pTRE-Tight hai chiều mà có thể được sử dụng để cảm ứng biểu hiện hai gene, trong hai gene đó một gene có thể là gene marker còn gene kia là gene đích quan tâm hoặc cả hai đều là gene quan tâm. Plasmid này được sử dụng trong hệ thống biểu hiện gene Tet ON/ Tet OFF và trong các dòng tế bào, hai gene được biểu hiện đồng thời. Hệ thống biểu hiện Tet vào các dòng tế bào cung cấp những cách tiếp cận có sẵn với hệ thống biểu hiện được biểu hiện bằng Tetracyline. Vector pTRE-Tight-BI chứa một yếu tố tương tác với Tet đã được sử lý (TREmod), chứa bẩy đoạn lặp trực tiếp của một trình tự dài 36bp trong đó chưa 19bp là trình tự của operator Tet ( TetO). Hai promoters mini CMV thiếu enhancer (trình tự tăng cường) ở bên cạnh của TREmod, hai promoter này là thành phần của promoter CMV. Các vị trí nhân dòng I (multiple cloning sites-MCS I) và MCS II có vị trí ở bên cạnh của promoter PTight tương tác với Tet. Cả hai gene được chèn vào MCS I và MCS II sẽ tương ứng với các protein điều hòa tTA và rtTA trong hệ thống Tet-OFF và Tet-ON. Chú ý rằng đoạn chèn được nhân dòng phải chứa bộ ba mở đầu ATG. Trong nhiều trường hợp có sự thêm vào của trình tự dẫn đầu Kozak, có thể tăng cường các mức độ biểu hiện; tuy nhiên nhiều cDNA đã được biểu hiện hiệu quả trong hệ thống Tet mà không có sự thêm vào của các trình tự Kozak. pTRE-Tight-BI nên được đồng chuyển nhiễm với marker Linear Hygromycin hoặc 11 marker Linear Puromycin cho phép lựa chọn những yếu tố chuyển nhiễm ổn định [13]. 2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Việc tạo ra muỗi biến đổi gene được tiến hành từ 20 năm trước nhưng chỉ gần đây phương án sử dụng loại muỗi này mới được các quan chức y tế ủng hộ. Điển hình là Malaysia, đất nước đầu tiên ở châu Á có kế hoạch thả thử nghiệm muỗi biến đổi gene vào môi trường, nhằm đối phó với đại dịch sốt xuất huyết. Viện nghiên cứu y học của quốc gia này đã hoàn tất kế hoạch thả hàng nghìn muỗi đực biến đổi gene để chúng giao phối với muỗi cái bình thường, tạo ra loại muỗi có tuổi đời ngắn hơn và không có khả năng truyền bệnh. Muỗi biến đổi gene vốn là sản phẩm của Công ty Công nghệ Sinh học Oxitec (có trụ sở tại Anh) và Viện Nghiên cứu Y học Malaysia. Ý tưởng nghiên cứu loại muỗi này dựa trên hoạt động giao phối của muỗi. Muỗi chuyển gene được bổ sung hai đặc điểm mới so với loại muỗi thường là chúng chứa gene phát huỳnh quang và gene gây chết có điều kiện (còn gọi là gene làm giảm sức đề kháng). Đặc điểm phát huỳnh quang hoạt động như một dấu hiệu để nhận diện muỗi biến đổi gene trong khi gene gây chết sẽ làm muỗi và các ấu trùng chết trong những điều kiện nhất định. Khi muỗi biến đổi gene đực giao phối với muỗi cái trong tự nhiên, gene gây chết sẽ được truyền lại cho thế hệ con cháu và các ấu trùng, kết quả là chúng sẽ chết trong điều kiện thiếu vắng kháng sinh tetracyline. Nhằm thử nghiệm các kết quả nghiên cứu về muỗi biến đổi gene, từ tháng 5 đến tháng 10 năm 2010, các nhà khoa học của Oxitec đã thả ba đợt muỗi biến đổi gene chủng OX513A Aedes aegypti trên diện tích 16 ha tại quần đảo Cayman thuộc Anh. Lượng muỗi nơi đây đã giảm 80% so với các khu vực lân cận chỉ trong vòng 6 tháng. Nếu được áp dụng phổ biến, phương án muỗi biến đổi gene được xem là triển vọng, có thể giúp ngăn chặn đáng kể dịch sốt xuất huyết, sốt vàng da, virut zika trên toàn cầu. Được kì vọng là phương án sẽ tạo nên bước đột phá trong ngành y học và nông nghiệp nhưng công nghệ muỗi biến đổi gene cũng gây không ít tranh