Tài liệu Nghiên cứu thay đổi lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao tt

1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Bệnh võng mạc đái tháo đường là nguyên nhân hàng đầu gây giảm thị lực trong dân số trong độ tuổi lao động. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng màng đáy mao mạc dày lên là dấu hiệu mô học của bệnh võng mạc đái tháo đường và có thể thúc đẩy quá trình chết tế bào mạch máu. Ngoài ra, màng đáy dày góp phần làm tổn thương hàng rào máu võng mạc dẫn đến hiện tượng tăng tính thấm thành mạch và rò rỉ mạch máu võng mạc, một dấu hiệu lâm sàng của bệnh võng mạc đái tháo đường. Mặc dù những thay đổi về mô học và chức năng đi kèm với bệnh lý vi mạch do đái tháo đường đã được biết khá đầy đủ, nhưng các cơ chế nội bào và ngoại bào cụ thể liên quan đến những thay đổi này dần dần dẫn đến rối loạn chức năng trong bệnh võng mạc đái tháo đường vẫn chưa được hiểu rõ. Lysyl oxidase (LOX) là một enzyme ngoại bào đã được chứng minh là rất cần thiết cho sự hình thành và hoàn thiện chức năng của màng đáy. Nghiên cứu của Song và cộng sự chỉ ra rằng hàm lượng LOX tăng trong võng mạc của chuột đái tháo đường và điều hoà LOX giúp ngăn ngừa tổn thương võng mạc do đái tháo đường. Ngoài ra, báo cáo gần đây cũng cho thấy LOX được điều hòa bởi các yếu tố gây thiếu oxy (HIFs), một nhân tố quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình tân mạch võng mạc trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Nghiên cứu mới đây trên mẫu dịch kính bệnh nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường. Tuy nhiên, cơ chế gây ra những rối loạn này cũng như những bất thường LOX ở cấp độ tế bào còn chưa rõ ràng. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu " Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao" với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá thay đổi mức độ biểu hiện LOX của tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. 2. Phân tích sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. 2 2. Những đóng góp mới của luận án: - Đây là nghiên cứu đầu tiên phân tích đầy đủ những biến đổi LOX và những rối loạn liên quan ở cấp độ tế bào của tế bào nội mô mao mạch võng mạc chuột liên quan nồng độ glucose cao. - Nghiên cứu chỉ ra rằng enzym LOX tăng trong protein toàn phần, protein chất nền ngoại bào, trong khi lượng LOX quay trở lại tế bào giảm và lượng LOX trong môi trường ngoại bào biến thiên theo thời gian tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. - Sự rối loạn enzym LOX gây tăng độ thẩm thấu qua màng tế bào và kích hoạt hiện tượng chết tế bào theo chương trình. Các chất ức chế LOX như LOXsiRNA và BAPN giúp ngăn ngừa các hiện tượng trên. - Nghiên cứu cũng chỉ ra được cơ chế gây những rối loạn này là do tăng bám dính của LOX với các protein chất nền ngoại bào. Môi trường nồng độ glucose cao kích thích liên kết giữa LOX với protein chất nền ngoại bào bên ngoài tế bào và làm giảm lượng LOX trong tế bào. Điều này tạo nên tín hiệu ngược gây tăng sản sinh LOX dẫn đến tăng hàm lượng LOX gặp trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Những phát hiện đem lại những hiểu biết sâu hơn về cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường và mở ra các hướng nghiên cứu phát hiện và điều trị sớm bệnh lý này. 3. Bố cục của luận án: Luận án có 102 trang, gồm Đặt vấn đề (2 trang), 4 chương: Chương 1: Tổng quan (27 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (23 trang), Chương 3: Kết quả nghiên cứu (27 trang), Chương 4: Bàn luận (21 trang), Kết luận (2 trang). Ngoài ra còn có: phần tài liệu tham khảo, 15 phụ lục, bảng, biểu đồ và hình ảnh minh họa kết quả của thử nghiệm. 3 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm mô học của mao mạch võng mạc Thành mao mạch võng mạc mỏng, từ trong ra ngoài gồm có 3 lớp: lớp nội mô, màng đáy và tế bào quanh mạch. 1.1.1. Lớp nội mô Lớp nội mô là một hàng tế bào đa giác dẹt lợp mặt trong thành mao mạch. Các tế bào nội mô liên kết với nhau bởi mối liên kết khe. 1.1.2. Màng đáy Màng đáy là lớp màng mỏng dày khoảng 50nm, nằm giữa lớp tế bào nội mô và tế bào quanh mạch của mao mạch. Màng đáy mao mạch chứa các protein chất nền ngoại bào được sắp xếp một cách có tổ chức để hình thành giá đỡ cho tế bào. Màng đáy mao mạch đóng vai trò là chất nền để gắn các tế bào, tạo nên hàng rào có tính thấm chọn lọc và điều hoà sự sống của tế bào. Màng đáy có cấu trúc nhiều lớp tạo bởi rất nhiều thành phần trong đó các thành phần chính là collagen IV (Coll IV), fibronectin (FN), laminin và heparan sulfate proteoglycans được sắp xếp theo trình tự nghiêm ngặt để đảm bảo chức năng và tính toàn vẹn của màng đáy. 1.1.3. Tế bào quanh mạch Tế bào quanh mạch có những nhánh bào tương dài bao quanh thành mạch và màng đáy bao lấy chúng ở cả phía trong và phía ngoài. 1.1.4. Bất thường mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường Hiện nay, chuột được sử dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm do có kích thước nhỏ, dễ thực hiện các kỹ thuật và chi phí không cao. Tuổi thọ của chuột ngắn, sự khởi phát tăng đường huyết và các triệu chứng của bệnh võng mạc đái tháo đường xuất hiện sớm cho phép thực hiện nghiên cứu trong thời gian ngắn. Thêm vào đó, kỹ thuật bảo quản, nuôi cấy tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột không quá phức tạp và tỷ lệ thành công cao. Đặc biệt, các nghiên cứu cơ chế sinh bệnh chủ yếu được thực hiện trên chuột do chúng biểu hiện tổn thương võng mạc đái tháo đường giai đoạn sớm tương tự con người. Các tổn thương đó bao gồm tăng số lượng tế bào hình sao và thần kinh đệm, giảm tốc độ dòng chảy của động mạch và tĩnh mạch, tăng tính thấm thành 4 mạch, tăng độ dày màng đáy mao mạch, rò rỉ mạch máu võng mạc, mao mạch không có tế bào và chết tế bào ngoại mạch. 1.2. Cơ chế sinh bệnh của các tổn thương mao mạch võng mạc do tình trạng đường huyết cao. Đái tháo đường Tăng đường huyết Rối loạn chức năng ty thể Rối loạn kết nối tế bào-tế bào Dày màng đáy Chết tế bào theo chương trình Mạch máu không có tế bào Rò mạch máu võng mạc Bệnh võng mạc đái tháo đường Hình 1. Cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường. 5 1.3. Lysyl oxidase Lysyl oxidase (LOX) là enzym đóng vai trò thiết yếu cho sự ổn định của mô liên kết và mạch máu. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra vai trò của LOX trong các bất thường liên quan đến mất cân bằng trong tổng hợp và/hoặc giáng hoá chất nền ngoại bào bao gồm các tổn thương xơ hoá ở tim (xơ hóa cơ tim), mạch máu (xơ hoá mạch), phổi (xơ hoá phổi), da (seọ hoá phì đại), thận (bệnh thận do đái tháo đường) và gan (xơ hoá gan). 1.3.1. Cấu trúc LOX còn được gọi là protein-lysine 6-oxidase, là một loại protein được mã hóa bởi gen LOX nằm trên nhánh dài, vị trí 23.3-31.2 của nhiễm sắc thể số 5. LOX trưởng thành được tổng hợp thông qua sự phân tách protein tiền enzyme N-glycosylated (pro-LOX, 50 kDa), thành một protein có hoạt tính (LOX 32 kDa) và LOX-propeptide 18 kDa (LOXPP). Mỗi thành viên của họ protein LOX được đặc trưng bởi một chuỗi axit amin ở đầu tận cùng C của chúng bao gồm vị trí gắn đồng để hình thành yếu tố carbonyl và vùng giống thụ thể cytokine. 1.3.2. Vị trí LOX đã được xác định trong một số mô, bao gồm da, động mạch chủ, tim, phổi, gan, dạ dày, ruột non, đại tràng, sụn, xương, thận, buồng trứng, tinh hoàn, vú, và não. Trong mắt, enzym LOX được phát hiện ở vùng bè, thể mi, thể thuỷ tinh và võng mạc. LOX trưởng thành sau khi được phân tách ở ngoài tế bào, một phần bám vào chất nền ngoại bào xúc tác cho quá trình hình thành liên kết chéo, phần còn lại quay trở lại bào tương và tập trung ở nhân tế bào. 1.3.3. Chức năng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của liên kết chéo qua trung gian LOX đối với tính toàn vẹn và chức năng của mô, đặc biệt là mô mạch máu và mô liên kết. LOX cũng đã được chứng minh đóng vai trò rất quan trọng trong việc duy trì tính ổn định và tính toàn vẹn của màng đáy do các liên kết chéo giữa các sợi collagen và fibronectin qua trung gian LOX giúp màng đáy hoàn thiện chức năng. Ngoài ra, LOX làm tăng biểu hiện và bài tiết các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) vì thế nó liên quan đến sự hình thành tân mạch. 6 1.4. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới Hiện nay ở Việt Nam có khá nhiều nghiên cứu về bệnh võng mạc đái tháo đường, nhưng chủ yếu liên quan đến dịch tễ bệnh, biểu hiện lâm sàng và hiệu quả điều trị. Rất ít nghiên cứu về cơ chế sinh bệnh bệnh võng mạc đái tháo đường và chưa có nghiên cứu nào về thay đổi của LOX. Trên thế giới đã có một số nghiên cứu liên quan đến sự biến đổi và ảnh hưởng của LOX trong bệnh đái tháo đường và các bệnh lý khác. Theo nghiên cứu của Erler và cộng sự, sự tăng biểu hiện LOX trong một số bệnh ung thư xâm lấn có liên quan đến tăng tính thấm của chất nền ngoại bào trong các bệnh lý này so với chất nền ngoại bào bình thường. Nghiên cứu của Le Pape và cộng sự đánh giá collagen màng đáy cầu thận và liên kết chéo qua trung gian LOX trong bệnh đái tháo đường báo cáo tỷ lệ dihydroxylysinonorleucine so với hydroxylysinonorleucine đã tăng lên, chứng tỏ có sự thay đổi liên kết chéo trong bệnh đái tháo đường. Nghiên cứu trên sinh hiển vi điện tử của Ortoland cho thấy có sự biến đổi cấu trúc các sợi collagen trong bệnh đái tháo đường. Những khác biệt này bao gồm tăng mật độ bó sợi fibrin, giảm đường kính bó sợi fibrin và hình thái sợi bất thường với biểu hiện sợi xoắn, cong, chồng chéo, và rối loạn tổ chức, gợi ý đến tăng liên kết chéo quá mức giữa các sợi fibrin. Nghiên cứu khác về đường kính của bó sợi fibrin thể hiện rằng đường kính sợi phụ thuộc vào giai đoạn sắp xếp các sợi fibrin, hoạt động được điều hoà bởi LOX. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các thành phần thiết yếu cho tính toàn vẹn của màng đáy bao gồm sự ổn định, sắp xếp các sợi fibrin và sự phân cực, phụ thuộc phần lớn vào liên kết chéo thích hợp điều hoà bởi LOX. Bất thường hình thái của màng đáy mao mạch võng mạc của bệnh nhân đái tháo đường phản ánh sự thay đổi trong cấu trúc do liên kết chéo tăng quá mức. Sự thay đổi này biểu hiện bởi hiện tượng màng đáy võng mạc dày lên, một trong những đặc điểm nổi bật của bệnh võng mạc đái tháo đường. Theo nghiên cứu của Rodriguez và Lucero, hiện tượng dư thừa các liên kết chéo phụ thuộc LOX gây tích lũy chất nền ngoại bào. Mặc dù mâu thuẫn nhưng nghiên cứu của Paszek đã chứng minh sự gia tăng độ cứng của chất nền ngoại bào có thể gây tăng cường vận chuyển qua chất nền ngoại bào bằng cách thay đổi phức hợp tín hiệu thụ thể bề mặt tế bào. Gần đây, nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng hàm lượng LOX tăng trong võng mạc của chuột mắc đái tháo đường và điều hoà LOX giúp giảm các tổn thương liên quan bệnh võng mạc đái tháo đường. Tuy vậy, những thông tin liên quan đến mức 7 độ biểu hiện, phân bố và điều hoà LOX ở mạch máu võng mạc còn chưa rõ ràng. A: Chuột bình thường. B: Chuột đái tháo đường. Hình chụp qua sinh hiển vi điện tử. Khung tỉ lệ = 100nm. Hình 2. Hiện tượng dày màng đáy mao mạch võng mạc ở chuột đái tháo đường 1.5. Những vấn đề còn tồn tại và lý do thực hiện đề tài Do tính đa dạng về chức năng sinh học, sự bất thường mức độ biểu hiện của LOX có vai trò trong cơ chế sinh bệnh của nhiều bất thường liên quan mất cân bằng tổng hợp và giáng hoá của chất nền ngoại bào. Tuy cùng trong nhóm bệnh tổn thương vi mạch, so với những bệnh lý khác, hiểu biết về LOX trong bệnh võng mạc đái tháo đường vẫn còn rất hạn chế. Nhiều câu hỏi được đặt ra cho các nghiên cứu trong tương lai như: (1) Tình trạng đường huyết cao gây rối loạn sự biểu hiện của enzym LOX như thế nào? (2) Cơ chế tín hiệu tế bào nào điều hoà sự biểu hiện của LOX trong tế bào mao mạch võng mạc? (3) Những yếu tố nào ảnh hưởng tới sự biểu hiện của enzym LOX? (4) Điều hoà mức độ biểu hiện của LOX có giúp ngăn ngừa các tổn thương mao mạch võng mạc do đái tháo đường hay không? Trả lời được những câu hỏi trên giúp hiểu rõ hơn cơ chế sinh bệnh võng mạc đái tháo đường, từ đó mở ra hướng dự phòng và điều trị bệnh võng mạc đái tháo đường liên quan đến rối loạn mức độ biểu hiện của enzym này. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Nhóm nghiên cứu: Các tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao. - Nhóm đối chứng: Các tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose bình thường. 2.2. Địa điểm nghiên cứu Trường Y Đại học Boston, bang Massachusetts, Hoa Kỳ. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thử nghiệm 2.3.2. Mẫu Dựa trên công thức tính cỡ mẫu theo phương pháp "Resource equation" áp dụng cho nghiên cứu thử nghiệm: n= E/(k+1) Trong đó n: số thử nghiệm E: sai lệch giữa các đối tượng (= 10 đến 20) k: số đĩa tế bào trong mỗi thử nghiệm (2-4) Từ đó tính ra giá trị n = 2-7. Do đó trong nghiên cứu này, mỗi loại thử nghiệm định lượng được lặp lại 6 lần và tính giá trị trung bình, mỗi thử nghiệm định tính được chọn ngẫu nhiên 6 vi trường. Tổng cộng 104 thử nghiệm bao gồm 102 thử nghiệm định lượng và 2 thử nghiệm định tính. 2.3.3. Phương tiện nghiên cứu 2.3.4. Cách thức tiến hành 2.3.4.1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy tế bào: Môi trường nồng độ glucose cao (HG, 30mM glucose) và môi trường bình thường (N, 5mM glucose). 2.3.4.2. Mục tiêu 1: Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX 9  Các bước xác định hàm lượng LOX trong protein toàn phần, chất nền ngoại bào và trong tế bào.  Các bước xác định hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào.  Các bước xác định hoạt động LOX.  Các bước xác định mật độ LOX.  Các bước xác định tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX.  Các bước xác định độ thẩm thấu của tế bào.  Các bước xác định hiện tượng chết tế bào theo chương trình. 2.3.4.3. Mục tiêu 2: Thay đổi mức độ bám dính của LOX  Các bước xác định lượng LOX liên kết với Coll IV và FN.  Các bước xác định mật độ LOX liên kết với Coll IV and FN. 2.3.5. Các chỉ số nghiên cứu 2.3.5.1. Mục tiêu 1: Đánh giá sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao a. Thay đổi hàm lượng LOX  Hàm lượng LOX trong protein toàn phần  Hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào  Hàm lượng LOX trong protein tế bào  Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào - Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 1 ngày nuôi cấy - Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 3 ngày nuôi cấy - Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 5 ngày nuôi cấy - Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào sau 7 ngày nuôi cấy b. Thay đổi hoạt động của LOX  Họạt động của LOX c. Thay đổi mật độ của LOX  Mật độ LOX trong protein toàn phần  Mật độ LOX trong protein chất nền ngoại bào d. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX  Hàm lượng của LOX  Hoạt động của LOX e. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động của tế bào 10  Tính thấm màng tế bào  Tỷ lệ pAKT/AKT  Số tế bào chết theo chương trình/1000 tế bào 2.3.5.2. Mục tiêu 2: Đánh giá sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao a. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào  Trong protein toàn phần - Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV - Hàm lượng LOX liên kết với FN  Trong protein chất nền ngoại bào - Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV - Hàm lượng LOX liên kết với FN b. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào  Trong protein toàn phần - Mật độ LOX liên kết với Coll IV - Mật độ LOX liên kết với FN  Trong protein chất nền ngoại bào - Mật độ LOX liên kết với Coll IV - Mật độ LOX liên kết với FN 2.4. Phương pháp thu thập số liệu và xử lý số liệu Số liệu được thu thập bằng các mẫu phiếu và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 18.0. Các biến liên tục được trình bày dưới dạng trung bình. Giá trị của nhóm đối chứng được quy đổi thành 100% và giá trị của nhóm nghiên cứu được tính theo phần trăm của nhóm đối chứng. So sánh trung bình bằng thuật toán kiểm định t-student. So sánh tỷ lệ bằng thuật toán điểm định chi2. So sánh giữa các nhóm được tính theo thuật toán ANOVA và Bonferroni post-hoc. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0.05. 2.5. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu đã được sự thông qua của Hội đồng đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội. 11 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu Nghiên cứu gồm 104 thử nghiệm bao gồm 102 thử nghiệm định lượng (17 kỹ thuật, mỗi kỹ thuật lặp lại 6 lần) và 2 thử nghiệm định tính.  Thử nghiệm định lượng  Hàm lượng LOX trong protein toàn phần  Hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào  Hàm lượng LOX trong tế bào  Hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào 1 ngày  Hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào 3 ngày  Hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào 5 ngày  Hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào 7 ngày  Hoạt động của LOX  Tác động của LOXsiRNA tới hàm lượng của LOX  Tác động của BAPN tới hoạt động của LOX  Tác động của LOXsiRNA tới hoạt động AKT  Tác động của BAPN tới hoạt động AKT  Tác động của LOXsiRNA tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình  Tác động của BAPN tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình  Tác động của chất ức chế LOX tới độ thẩm thấu tế bào  Sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào trong protein toàn phần  Sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào trong chất nền ngoại bào  Thử nghiệm định tính  Mật độ LOX, mật độ LOX liên kết với protein chất nền ngoại bào và tác động của LOXsiRNA tới mật độ LOX trong protein toàn phần  Mật độ LOX và mật độ LOX liên kết với protein chất nền ngoại bào trong chất nền ngoại bào 12 3.2. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao 3.2.1. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao đến mức độ biểu hiện của LOX 3.2.1.1. Hàm lượng LOX * Hàm lượng LOX trong protein toàn phần: Lượng LOX trong protein toàn phần của các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (145±10% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). * Hàm lượng LOX trong protein chất nền ngoại bào: Lượng LOX tại chất nền ngoại bào tăng rõ rệt trong môi trường nồng độ glucose cao (154±9% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). * Hàm lượng LOX trong tế bào: Lượng LOX quay trở lại tế bào giảm đáng kể khi các tế bào được nuôi cấy ở môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào được nuôi cấy ở môi trường bình thường (62 ± 9% nhóm đối chứng; p < 0.05, n=6). * Hàm lượng LOX trong môi trường tế bào Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng LOX tăng nhẹ trong môi trường nồng độ glucose cao 1 ngày (124±8% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) và 5 ngày (117±6% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6), tăng mạnh nhất trong môi trường glucose cao 3 ngày (158±11% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) và giảm trong môi trường glucose cao 7 ngày (78±5% của nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). 200 100 0 HG1 HG3 HG5 HG7 HG1, HG3, HG5 và HG7: Môi trường nồng độ glucose cao 1, 3, 5 và 7 ngày. Biểu đồ 1. Hàm lượng LOX trong môi trường nồng độ glucose cao. 13 3.2.1.2. Mật độ của LOX + Mật độ LOX trong protein toàn phần: Mật độ LOX tăng mạnh ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi cấy ở môi trường bình thường (179±7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). + Mật độ LOX trong protein chất nền ngoại bào: Mật độ LOX tăng rõ rệt tại chất nền ngoại bào của các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với các tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (160 ± 7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). 3.2.1.3. Hoạt động của LOX: Hoạt động của LOX tăng đáng kể khi tế bào được nuôi cấy trong điều kiện glucose nồng độ cao (153±15% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). 3.2.2. Tác động của các chất ức chế LOX tới mức độ biểu hiện của LOX 3.2.2.1. Tác động của LOXsiRNA tới hàm lượng và mật độ LOX + Hàm lượng của LOX: 200 150 100 50 0 N: Môi trường bình thường, HG: Môi trường glucose nồng độ cao, HG+LOXsiRNA: Môi trường glucose nồng độ ủ với LOXsiRNA. Biểu đồ 2. Tác động ức chế mức độ biểu hiện LOX của LOXsiRNA 14 Hàm lượng LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng rõ rệt so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (158 ± 21% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Tác dụng ức chế LOX của LOXsiRNA được thể hiện khi tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với LOXsiRNA, hàm lượng LOX trở về gần mức bình thường (116 ± 13% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). + Mật độ LOX Phân tích hình ảnh thu được qua kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy mật độ LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (179 ± 7% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với LOXsiRNA, mật độ LOX trở về gần mức bình thường (114 ± 6% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). 3.2.2.2. Tác động của BAPN tới hoạt động của LOX: Hoạt động của LOX tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao tăng đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (160 ± 16% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Trong khi đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với BAPN, hoạt động LOX trở về gần mức bình thường (120 ± 9% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). 3.2.3. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới hoạt động của tế bào 3.2.3.1. Độ thẩm thấu tế bào Kết quả phân tích độ thẩm thấu cho thấy độ thẩm thấu tế bào tăng mạnh (299±18% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6) khi được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao. Khi các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao được ủ với chất ức chế LOX (LOXsiRNA 15 hoặc BAPN), độ thẩm thấu tế bào giảm rõ rệt (114± 8% nhóm đối chứng và 132±14% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). 400 300 200 100 0 N: môi trường bình thường. HG: môi trường nồng độ glucose cao, HG+LOXsiRNA: môi trường nồng độ glucose cao ủ với LOX siRNA . Biểu đồ 3. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới độ thẩm thấu của tế bào nội mô mạch máu võng mạc. 3.2.3.2. Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình * Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hoạt động AKT Hoạt động AKT (biểu hiện qua tỷ lệ pAKT/AKT) tại các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao giảm đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (63 ± 8% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với LOXsiRNA hoặc BAPN, hoạt động AKT tăng rõ ràng (87 ± 8% nhóm đối chứng, và 76 ± 10% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). * Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình 16 Số lượng tế bào chết/1000 tế bào tăng rõ rệt trong môi trường nồng độ glucose cao so với môi trường bình thường (4.68 ± 0.9 và 1.48 ± 0.32, tương ứng, p<0.05, n=6) và giảm khi tế bào được ủ LOXsiRNA (2.78 ± 0.37, p<0.05, n=6). Tương tự như vậy, với thử nghiệm BAPN, môi trường nồng độ cao có ủ BAPN ức chế hoạt động của LOX, số lượng tế bào chết/1000 tế bào giảm đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ cao đơn thuần (2.85 ± 0.34 và 4.38 ± 0.84, tương ứng, p<0.05, n=6). 3.3. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao 3.3.1. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào 3.3.1.1. Trong protein toàn phần Nghiên cứu chỉ ra sự tăng đáng kể lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein toàn phần của các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (144±12% nhóm đối chứng và 168±11% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). 3.3.1.2. Trong protein chất nền ngoại bào Lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (138±20% nhóm đối chứng và 156±21% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). 3.2.2. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào 3.3.2.1. Trong protein toàn phần 17 Mật độ LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein toàn phần tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (192±21% nhóm đối chứng, và 183±19% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). 3.3.2.2. Trong protein chất nền ngoại bào Mật độ LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào tăng đáng kể ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (143±10% nhóm đối chứng và 158±15% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). Chương 4: BÀN LUẬN 4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao 4.1.1. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX Màng đáy mao mạch dày lên từ lâu đã được phát hiện trong bệnh võng mạc đái tháo đường và được chứng minh có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh này. Điều nghịch lý là màng đáy mao mạch dày lên lại gây tăng rò rỉ mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Để giải thích cho hiện tượng này, các báo cáo đã đề xuất rằng có sự thay đổi các liên kết chéo giữa các thành phần của màng đáy gây ảnh hưởng đến quá trình hình thành và cấu trúc của màng đáy, do đó tổn hại hàng rào mạch máu võng mạc. Nghiên cứu của Lucero, Rodriguez và Nishioka cho thấy rằng tính toàn vẹn của màng đáy và cấu trúc chất nền ngoại bào đòi hỏi lượng thích hợp liên kết chéo phụ thuộc LOX. LOX là một enzym liên kết chéo đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và trưởng thành của màng đáy. LOX điều hoà quá trình hình thành liên kết cộng hoá trị giữa các sợi collagen tạo thành dạng collagen không bị hoà tan và có độ bền kéo cần thiết cho chức năng của mô liên kết bình thường, từ đó tạo nên lớp chất nền ngoại bào bền vững. Tuy nhiên, nếu các liên kết chéo này quá nhiều có thể dẫn đến dày và tổn hại 18 chức năng màng đáy do hình thành các bó sợi collagen bất thường, gây tích luỹ chất nền ngoại bào. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy có sự biểu hiện quá mức enzym LOX ở võng mạc chuột mắc đái tháo đường. Tuy nhiên sự thay đổi của LOX ở mức độ tế bào cũng như tác động của sự thay đổi đó tới hoạt động của tế bào còn chưa biết rõ. Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá mức độ biểu hiện, hoạt động của LOX và tác động của sự thay đổi này tới độ thẩm thấu tế bào và hiện tượng chết tế bào theo chương trình ở tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong điều kiện môi trường nồng độ glucose cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng nồng độ glucose cao ảnh hưởng đáng kể tới mức độ biểu hiện LOX. Đây là nghiên cứu đầu tiên phân tích chi tiết tác động của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy tới mức độ biểu hiện của LOX ở bên trong và bên ngoài tế bào. Theo đó, lượng LOX trong protein toàn phần tăng, trong khi lượng LOX quay trở lại tế bào giảm sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao. Thêm vào đó, nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy tác động của môi trường nồng độ glucose cao đối với mức độ biểu hiện LOX ở môi trường ngoại bào có sự biến thiên theo thời gian. Ngoài ra môi trường glucose cao cũng gây tăng mật độ LOX và hoạt động LOX. Sự rối loạn này được điều chỉnh bởi các chất ức chế LOX như LOXsiRNA và BAPN. Kết quả này củng cố thêm cho phát hiện trước đây là nồng độ enzym LOX tăng ở võng mạc chuột mắc đái tháo đường và có sự tăng các liên kết chéo phụ thuộc LOX ở collagen da trong đái tháo đường. Hiện nay có rất ít thông tin liên quan đến biểu hiện LOX ở võng mạc bệnh nhân đái tháo đường. Nghiên cứu gần đây trên mẫu dịch kính bệnh nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường. Không có sự khác biệt đáng kể về mức LOX trong dịch kính ở nam và nữ của cả 2 nhóm đái tháo đường và không đái tháo đường. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các phát hiện của chúng tôi, thể hiện nồng độ glucose cao hoặc 19 đường huyết cao gây tăng mức biểu hiện LOX trong các tế bào nội mô mạch máu võng mạc trên thí nghiệm và trong các tế bào mạch máu võng mạc ở chuột đái tháo đường. Dịch kính được coi như bể chứa các chất trung gian của quá trình viêm, hình thành tân mạch võng mạc và các phần khác của mắt. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để xác định liệu mẫu dịch kính của LOX có thể sử dụng như một chất chỉ điểm sinh học và hỗ trợ trong sự xác định quá trình tiến triển bệnh võng mạc đái tháo đường. Thêm nữa, nó cung cấp thông tin cơ bản cho các nghiên cứu sâu hơn để xác định liệu ức chế LOX có thể là phương pháp hữu ích trong ngăn ngừa tổn thương mạch máu võng mạc liên quan tới cơ chế bệnh sinh của bệnh võng mạc đái tháo đường. 4.1.2. Thay đổi hoạt động của tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện của LOX 4.1.2.1. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới độ thẩm thấu tế bào Các kết quả từ nghiên cứu này chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức của LOX trong các tế bào nội mô mao mạch võng mạc liên quan đến môi trường nồng độ glucose cao có liên quan đến tăng độ thẩm thấu tế bào và thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình. Độ thẩm thấu của tế bào tăng rõ rệt khi tế bào được nuôi cấy ở môi trường glucose nồng độ cao và được điều chỉnh khi môi trường này được ủ thêm các chất ức chế LOX như LOXsiRNA hoặc BAPN. Điều này chỉ ra hàm lượng và hoạt động LOX có tác động tới độ thẩm thấu của tế bào. Sự dư thừa liên kết chéo xúc tác bởi LOX hình thành các bó sợi collagen bất thường gây tổn hại sự toàn vẹn siêu cấu trúc màng đáy. Từ đó gợi ý một cơ chế tiềm tàng gây rò mạch võng mạc liên quan đến dày màng đáy trong bệnh võng mạc đái tháo đường. 20 4.1.2.2. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình Trong khi LOX được biết đến chủ yếu với vai trò hình thành các liên kết chéo, các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, tăng lượng LOX có thể khởi động hiện tượng chết tế bào theo chương trình. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng LOX dư thừa góp phần gây chết tế bào theo chương trình bằng cách tổn thương đường tín hiệu AKT. Đặc biệt là khi lượng LOX được điều chỉnh về mức gần bình thường nhờ LOXsiRNA hoặc hoạt động của LOX bị kìm hãm bởi BAPN, hoạt động AKT được cải thiện rõ rệt. Những điều trên chỉ ra rằng có sự liên quan mật thiết giữa sự biểu hiện của LOX và hoạt động AKT. Phát hiện này củng cố thêm cho các nghiên cứu trước đó rằng LOX tăng quá mức làm tổn hại hoạt động AKT góp phần gây chết tế bào theo chương trình. Tương tự trên mô hình động vật trong nghiên cứu của Kim và cộng sự, võng mạc của chuột đái tháo đường cũng biểu hiện tăng lượng LOX và tổn hại hoạt động AKT. Ở chuột LOX +/- mắc đái tháo đường do tiêm Streptozotocin, hoạt động AKT không bị tổn hại đáng kể. Tóm lại, những phát hiện trên đây của chúng tôi chỉ ra rằng, môi trường nồng độ glucose cao gây tăng hàm lượng và hoạt động của LOX liên quan đến rối loạn chức năng tế bào nội mô mạch máu võng mạc và tăng độ thẩm thấu tế bào quá mức. LOXsiRNA và BAPN có tác dụng ức chế sự biểu hiện và hoạt động của LOX giúp bảo vệ hàng rào mạch máu võng mạc. Do đó giảm mức độ biểu hiện của LOX có thể là một mục tiêu đích tiềm năng trong ngăn ngừa các tổn thương liên quan đến bệnh võng mạc đái tháo đường.