Tài liệu Nghiên cứu thành phần loài, tính gây bệnh và khả năng phòng chống nấm colletotrichum spp. gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông hồng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN DUY HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN DUY HƯNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI, TÍNH GÂY BỆNH VÀ KHẢ NĂNG PHÒNG CHỐNG NẤM Colletotrichum spp. GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG Chuyên ngành : Bảo vệ thực vật Mã số : 9620112 Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Hà Viết Cường 2. TS. Hoàng Chúng Lằm HÀ NỘI - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố hay dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Tác giả luận án Nguyễn Duy Hưng i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo; sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình; sự tài trợ, sự giúp đỡ cả về vật chất lẫn tinh thần của các tổ chức và cá nhân. Nhân dịp này, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc thầy PGS.TS. Hà Viết Cường, TS. Hoàng Chúng Lằm đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Bộ môn Bệnh cây, Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Rau quả đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Hưng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 1.4. Những đóng góp mới của đề tài 4 1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 2.1. Nguồn gốc, tình hình sản xuất ớt trên thế giới và Việt Nam 6 2.1.1. Lược sử về cây ớt 6 2.1.2. Tình hình sản xuất ớt trên thế giới 7 2.1.3. Tình hình sản xuất ớt ở Việt Nam 8 2.2. Nghiên cứu về bệnh thán thư hại ớt trên thế giới 9 2.2.1. Tầm quan trọng của bệnh thán thư 9 2.2.2. Phân loại nấm Colletotrichum 10 2.2.3. Thành phần nấm Colletotrichum gây hại trên ớt 13 2.2.4. Một số loài nấm Colletotrichum chính gây hại ớt 15 2.2.5. Xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt 22 2.2.6. Khả năng truyền qua hạt ớt của nấm Colletotrichum 24 2.2.7. Đặc điểm sinh thái nấm Colletotrichum gây bệnh trên ớt 25 2.3. Phòng chống nấm Colletotrichum trên ớt 26 2.3.1. Biện pháp canh tác 26 2.3.2. Biện pháp sử dụng giống chống chịu bệnh 26 2.3.3. Biện pháp hóa học 27 iii 2.3.4. Biện pháp sinh học 28 2.4. Những nghiên cứu về bệnh thán thư hại ớt tại Việt Nam 30 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 33 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 33 3.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 34 3.2. Nội dung nghiên cứu 35 3.2.1. Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 35 3.2.2. Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh 3.2.3. 35 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện được 3.2.4. 35 Đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng Bacillus spp và dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện được trong điều kiện in vitro 36 3.3. Phương pháp nghiên cứu 36 3.3.1. Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh thán thư 36 3.3.2. Phương pháp xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt 38 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, tính gây bệnh của các loài Colletotrichum 3.3.4. 41 Phương pháp đánh giá hiệu lực ức chế nấm Colletotrichum của một số loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y và vi khuẩn đối kháng trong điều kiện 3.5. in vitro 46 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 49 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 4.1. Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 51 4.1.1. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng 51 4.1.2. Kết quả điều tra thực trạng bệnh thán thư hại ớt tại các điểm thu thập mẫu 52 4.1.3. Kết quả thu thập mẫu bệnh thán thư ớt 56 4.1.4. Đặc điểm hình thái của các mẫu nấm gây bệnh thán thư ớt 57 4.2. Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh 4.2.1. 59 Định danh nấm dựa trên giải trình tự gen các mẫu nấm đại diện thuộc các nhóm hình thái xác định được 59 iv 4.2.2. Tổng kết thành phần loài Colletotricum phát hiện trên cây ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh 4.2.3. 70 Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum gây hại trên cây ớt 4.2.4. 72 Xác định thành phần, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh bằng PCR 4.3. Đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt được thu thập 4.3.1. 89 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum 4.3.2. 89 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 4.3.3. 93 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 4.3.4. Tính gây bệnh của các loài Colletotrichum thu thập 4.3.5. Xác định khả năng tồn tại của bào tử các loài nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt 4.4. 84 97 101 111 Đánh giá hiệu lực của một số loại thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng Bacillus spp và dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum được phát hiện trong điều kiện in vitro 4.4.1. 114 Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến khả năng sinh trưởng, phát triển của các loài nấm Colletotrichum phát hiện được trong điều kiện in vitro 4.4.2. Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng Bacillus spp đến sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 4.4.3. 115 136 Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của nấm C. siamense và C. truncatum trên môi trường PDA 140 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 143 5.1. Kết luận 143 5.2. Kiến nghị 145 Danh mục các công trình công bố 146 Tài liệu tham khảo 147 Phụ lục 162 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ bp Base pair (Cặp bazơ) BVTV Bảo vệ thực vật C. Colletotrichum CBTB Cấp bệnh trung bình CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) CSB Chỉ số bệnh CT Công thức CTAB cetyltrimethylammonium bromide ĐBSH Đồng bằng sông Hồng DNA Deoxyrobonucleic acid FAO Food and agriculture organization (Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hiệp Quốc) ha Hecta ITS Internal transcribed spacer kb Kilo base PCA Potato Carrot Agar PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) PDA Potato Glucose Agar QCVN Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia s.l sensu lato = phức hợp loài s.s sensu stricto = loài đúng TT Số thứ tự TLB Tỷ lệ bệnh WA Water agar µl Microliter vi DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1. Diện tích, năng suất và sản lượng ớt của thế giới (năm 2009 - 2018) 7 2.2. Diện tích, năng suất và sản lượng ớt Việt Nam (năm 2009 - 2017) 8 2.3. Thành phần loài Colletotrichum trên ớt tại một số quốc gia 14 3.1. Các mồi được sử dụng trong định danh phân tử nấm Colletotrichum 38 4.1. Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong vụ xuân hè từ năm 2015 - 2017 4.2. 52 Mức độ phổ biến của bệnh thán thư hại ớt tại đồng bằng sông Hồng trong vụ thu đông từ năm 2015 - 2017 52 4.3. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2015 54 4.4. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2016 55 4.5. Tình hình bệnh thán thư hại ớt tại một số tỉnh năm 2017 55 4.6. Triệu chứng mẫu bệnh thán thư thu thập tại các địa điểm 56 4.7. Đặc điểm hình thái các mẫu nấm thán thư hại ớt thu thập 58 4.8. Kết quả tìm kiếm trên Ngân hàng gen 10 mẫu nấm Colletotrichum dựa trên trình tự vùng ITS 4.9. 60 Mức đồng nhất trình tự vùng ITS của 10 mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại thu tại Việt Nam với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và các loài đã công bố gây bệnh thán thư ớt 61 4.10. Kết quả tìm kiếm trên GenBank 9 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt dựa trên trình tự vùng ApMat 65 4.11. Mức đồng nhất trình tự vùng ApMat của 9 mẫu Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh với các loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 67 4.12. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. truncatum dựa trên trình tự ITS của các loài Colletotrichum đã được công bố gây bệnh thán thư ớt 73 4.13. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. gloeosporioides s.s dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 74 4.14. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. siamense dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l vii 75 4.15. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. fructicola dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 76 4.16. Đặc điểm 4 cặp mồi được thiết kế nhằm phát hiện C. truncatum, C. fructicola, C. siamense và C. gloeosporioides s.s 78 4.17. Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp của 4 cặp mồi thiết kế 80 4.18. Kết quả PCR so sánh hai phương pháp chiết DNA mẫu nấm 83 4.19. Phát hiện các loài Colletetotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập bằng PCR 85 4.20. Phân bố mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh 87 4.21. Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên các môi trường dinh dưỡng 92 4.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum 96 4.23. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum 100 4.24. Kết quả lây nhiễm nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt 106 4.25. Kết quả lây nhiễm các loài nấm Colletotrichum trên quả của một số ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư 109 4.26. Khả năng tồn tại của nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt sau lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp gây tổn thương 111 4.27. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 118 4.28. Ảnh hưởng của thuốc Azony 25SC đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum 120 4.29. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 123 4.30. Ảnh hưởng của thuốc Antracol 70WP đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum 126 4.31. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 128 4.32. Ảnh hưởng của thuốc Tiptop 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum 131 viii 4.33. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 133 4.34. Ảnh hưởng của thuốc Score 250EC đến khả năng nảy mầm bào tử của các loài nấm Colletotrichum 135 4.35. Ảnh hưởng của một số mẫu vi khuẩn đối kháng đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA 138 4.36. Ảnh hưởng của một số dịch chiết địa y đến khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường PDA ix 140 DANH MỤC HÌNH TT 2.1. Tên hình Trang Cây phân loại các loài nấm Colletotrichum dựa trên phân tích trình tự các chuỗi gen CHS-1 (251 bp), ACT (305 bp), TUB2 (545 bp) và ITS (599 bp) với 9 nhóm (clade) được chỉ rõ bằng các màu khác nhau 12 2.2. Đặc điểm hình thái của nấm C. truncatum 15 2.3. Phức hợp loài C. gloeosporioides s.l gồm 23 loài 16 2.4. Đặc điểm hình thái của nấm C. siamense 18 2.5. Đặc điểm hình thái của nấm C. fructicola 19 2.6. Đặc điểm hình thái của nấm C. aeschynomenes 20 2.7. Đặc điểm hình thái nấm C. acutatum s.s: mẫu chuẩn (BRIP 52652) 21 2.8. Đặc điểm hình thái nấm C. acutatum s.s: mẫu chuẩn (CBS 112996) 22 2.9. Quá trình xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum 23 2.10. Cách xâm nhiễm gây bệnh của nấm Colletotrichum bằng cách hình thành sợi nấm dưới biểu bì 24 2.11. Nấm C. capsici hình thành tiền đĩa cành 25 3.1. Kỹ thuật cấy trên lam để quan sát hình thái đĩa áp nấm Colletotrichum 42 4.1. Số lượng mẫu bệnh thán thư ớt thu thập tại các địa điểm từ 2015 - 2017 56 4.2. Triệu chứng bệnh thán thư điển hình do nấm Colletotrichum spp. gây hại trên quả ớt 4.3. 57 Đặc điểm bào tử phân sinh (a, b, c) và đĩa áp (d, e, f) của nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng. Đại diện 3 nhóm hình thái C4 (a,d); C29 (b,e) và C25 (c,f) 4.4. 59 Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS của các mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l và các loài được công bố gây bệnh thán thư ớt 4.5. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ApMat của các mẫu nấm Colletotrichum thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l 4.6. 64 69 Đặc điểm hình thái 5 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định được tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh x 72 4.7. PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi đặc hiệu Colletotrichum 4.8. 81 Phản ứng PCR so sánh 2 phương pháp chiết DNA (CTAB và NaOH) từ nấm Colletotrichum với 4 cặp mồi đặc hiệu 4.9. Phân bố các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt từ tất cả các địa điểm (A) và các tỉnh đồng bằng sông Hồng (B) 4.10. 87 Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên các môi trường dinh dưỡng 4.11. 83 93 Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau 97 4.12. Khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum ở các mức pH khác nhau 101 4.13. Lây bệnh nhân tạo các loài nấm Colletotrichum trên một số giống ớt 105 4.14. Lây bệnh nhân tạo các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt trên quả chín của một số loại ký chủ hay nhiễm bệnh thán thư 4.15. Lây nhiễm nhân tạo bào tử nấm C. siamense và C. truncatum trên lá ớt giống Demon bằng phương pháp gây tổn thương 4.16. 134 Khả năng đối kháng của 2 mẫu vi khuẩn HT1 và N2 đối với các loài nấm Colletotrichum 4.22. 129 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Score 250EC ở các nồng độ khác nhau 4.21. 124 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Tiptop 250EC ở các nồng độ khác nhau 4.20. 119 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Antracol 70WP ở các nồng độ khác nhau 4.19. 114 Khả năng sinh trưởng của các loài nấm Colletotrichum trên môi trường dinh dưỡng chứa thuốc Azony 25SC ở các nồng độ khác nhau 4.18. 112 Đặc điểm của bào tử nấm C. siamense và C truncatum trên bề mặt lá ớt giống Demon được lây nhiễm bằng phương pháp gây tổn thương 4.17. 110 139 Khả năng ức chế sinh trưởng của dịch chiết địa y đối với một số loài nấm Colletotrichum 141 xi TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Duy Hưng Tên Luận án: Nghiên cứu thành phần loài, tính gây bệnh và khả năng phòng chống nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9 62 01 12 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Xác định được thành phần loài, đánh giá được một số đặc điểm sinh học chủ yếu của nấm Colletotrichum hại ớt tại đồng bằng sông Hồng (ĐBSH). Phương pháp nghiên cứu * Nội dung nghiên cứu Luận án thực hiện 4 nội dung nghiên cứu: 1) Điều tra đánh giá tác hại và thu thập mẫu bệnh thán thư ớt. 2) Xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt tại ĐBSH và một số tỉnh. 3) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện được. 4) Đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng đối và dịch chiết địa y với các loài Colletotrichum được phát hiện trong điều kiện in vitro. * Vật liệu Các mẫu nấm Colletotrichum được thu thập trên đồng ruộng. Các nguồn vi khuẩn đối kháng và dịch chiết địa y được cung cấp bởi bộ môn Bệnh cây và bộ môn Hóa (Học viện Nông nghiệp Việt Nam). Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu phòng chống là các thuốc trừ nấm nằm trong danh mục được phép sử dụng tại Việt Nam. * Phương pháp nghiên cứu - Phân lập nấm theo qui trình của Cai et al. (2009). Bảo quản mẫu nấm theo phương pháp của Abd-Elsalam et al. (2010). - Phương pháp chiết DNA mẫu nấm được thực hiện theo Doyle & Doyle (1987) và Wang et al. (1993). Định danh mẫu nấm được thực hiện bằng cặp mồi: ITS4 & ITS5 (White et al., 1990) và AM-F & AM-R (Silva et al., 2012). - Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự gen đã công bố về các loài chuẩn (Cannon et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012). Các trình tự lựa chọn được phân tích bằng phần mềm ClustalX 2.0 (Larkin et al., 2007). - Đặc điểm tản nấm, hình dạng bào tử, đĩa áp được đánh giá theo phương pháp của Cai et al. (2009), Than et al. (2008a) và Johnston & Jones (1997). - Xác định tính gây bệnh của các loài được thực hiện theo phương pháp của Montri et al. (2009) và Than et al. (2008b). Đánh giá khả năng tồn tại của một số loài Colletotrichum trên lá ớt được thực hiện theo phương pháp của Ranathunge et al. (2016). - Đánh giá ảnh hưởng của một số loại thuốc hóa học, dịch chiết địa y và vi khuẩn đối kháng đến với các loài nấm Colletotrichum trong điều kiện invitro được thực hiện theo phương pháp của Gopinath et al. (2006) và Kumar et al. (2012). Hiệu lực ức chế được tính theo công thức Abbott (1925). xii - Các số liệu thí nghiệm khác được xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng phần mềm IRRISTAT 5.0. Kết quả chính và kết luận Điều tra đồng ruộng từ 2015 đến 2017 đã xác định được bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. là bệnh phổ biến, gây hại trên tất các thời vụ trong năm trên cây ớt tại ĐBSH. Bệnh gây hại từ giai đoạn cây ớt thu hoạch quả lứa 1 và tăng nhanh ở các lứa quả tiếp theo. Tổng số 52 mẫu nấm thán thư ớt thu thập tại 9 tỉnh ĐBSH và 4 tỉnh khác đã được phân lập thuần từ đơn bào tử. Các phân tích hình thái dựa trên đặc điểm bào tử phân sinh và đĩa áp đã xác định được chúng thuộc 3 nhóm hình thái. Các phân tích trình tự vùng ITS của 10 mẫu nấm đại diện cho 3 nhóm hình thái xác định được 2 mẫu nấm là loài C. truncatum và 8 mẫu nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l. Để định danh chính xác tới mức loài của các mẫu nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l, trình tự vùng liên gen ApMat của 9 mẫu nấm thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l đã được phân tích. Kết quả phân tích đã xác định được 4 loài C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola và C. aeschynomenes. Tất cả 4 loài này là những loài lần đầu tiên được phát hiện, công bố tại Việt Nam. Dựa trên kết quả định danh, 4 cặp mồi đặc hiệu 4 loài Colletotrichum chính gây bệnh thán thư ớt (C. gloeosporioides s.s; C. fructicola; C. siamense; C. truncatum) đã được thiết kế. Nhiệt độ gắn mồi, thông số quan trọng nhất trong phản ứng PCR, cho từng cặp mồi đã được tối ưu. Ở điều kiện nhiệt độ gắn mồi tối ưu, cả 4 cặp mồi đã chứng tỏ phát hiện đặc hiệu 4 loài tương ứng. Đặc biệt phương pháp chiết nhanh DNA từ mẫu nấm dùng NaOH và đệm Tris đã lần đầu được áp dụng đối với nấm Colletotrichum. Phương pháp được chứng tỏ rất phù hợp để chuẩn bị DNA nhóm nấm này cho phản ứng PCR. Kỹ thuật PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được áp dụng để định danh tất cả 52 mẫu nấm thu thập được. Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH và một số tỉnh gồm 5 loài, trong đó C. siamense là loài phổ biến nhất, chiếm 51,9%, tiếp theo là C. fructicola chiếm 21,2%, C. truncatum chiếm 15,4%, C. gloeosporioides s.s chiếm 9,6% và loài C. aeschynomenes chiếm 1,9%. Các đặc điểm sinh học quan trọng của 5 loài nấm đã được đánh giá trong điều kiện in vitro. Tính gây bệnh của 5 loài Colletotrichum trên ớt và một số loại quả đã được đánh giá bằng lây nhiễm nhân tạo. Đặc biệt, đã xác định được bào tử phân sinh của loài C. siamense và C. truncatum có khả năng nảy mầm, hình thành đĩa áp, xâm nhập trực tiếp qua tầng cutin, duy trì trạng thái ngủ nghỉ/ nội sinh sau khi xâm nhập và không gây triệu chứng trên lá ớt sau lây nhiễm 6 tuần. Phát hiện này đã giúp xác định được một vị trí tồn tại quan trọng của nguồn bệnh thán thư trên đồng ruộng, đồng thời giải thích được tại sao trên đồng ruộng khó quan sát thấy bệnh thán thư trên lá ớt. Kết quả nghiên cứu của luận án đã xác định được các hoạt chất Difenoconazole (Score 250EC) và Propiconazole (Tiptop 250EC) có hiệu lực cao đối với 5 loài nấm Colletotrichum trong điều kiện in vitro. Ở nồng độ khuyến cáo, Score 250EC ức chế hoàn toàn sinh trưởng tản nấm và nảy mầm bào tử của 5 loài nấm; Tiptop 250 EC có hiệu lực ức chế tản nấm đạt 82,2 - 100% và nảy mầm bào tử đạt 69,1 - 100%. xiii THESIS ABSTRACT Doctoral candidate: Nguyen Duy Hung Dissertation title: Species composition, pathogenicity and prevention measures of Colletotrichum spp. causing anthracnose of chili peppers in the Red River Delta (RRD). Field: Plant Protection Code: 9 62 01 12 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA). Research Objectives: To identify species composition and to characterize important biological features of Colletotrichum spp. causing anthracnose of chili peppers in the RRD. Materials and Methods * Research aspects The dissertation studied four aspects as follow: 1) Investigating and evaluating damage of Colletotrichum and collecting pepper samples infected with anthracnose. 2) Determining the composition of Colletotrichum in chili pepper in the RRD and other provinces. 3) Studying biological characteristics, pathogenicity of detected Colletotrichum species. 4) Evaluating effectiveness of some plant protection chemicals, antagonistic bacteria and lichen extracts to detected Colletotrichum species under in vitro condition. * Materials Colletotrichum samples were collected in chilli fields. Antagonistic bacteria and lichen extracts were provided by Departments of Plant Pathology and Chemistry (VNUA). Chemicals used in inhibition experiment were all approved by Vietnam authority. * Method - Fungal isolation according to Cai et al. (2009); storage of samples according to the method of Abd-Elsalam et al. (2010). - DNA extraction according to Doyle & Doyle (1987) and Wang et al. (1993); identification of samples was carried out with primers: ITS4 & ITS5 (White et al., 1990) and AM-F & AM-R (Silva et al., 2012). - Designation of specific primers according to published gene sequences on standard species (Cannon et al., 2012; Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012). Analysis of selected sequences by ClustalX 2.0 software (Larkin et al., 2007). - Evaluation of fungal characteristics, spore and sporangium shapes according to Cai et al. (2009), Than et al. (2008b) and Johnston and Jones (1997). - Evaluation of inhibitory effect of plant protection chemicals, lichen extracts and antagonistic bacteria to Colletotrichum under in vitro conditions according to Gopinath et al. (2006) and Kumar et al. (2012). - Calculation of effectiveness of plant protection chemicals, antagonistic bacteria, lichen extract to Colletotrichum according to Abbott's formula (1925). - Statistically processing of other experimental data by variance analysis method and IRRISTAT 5.0 software. xiv Main findings and conclusions Field surveys during period from 2015 to 2017 determined the anthracnose is the most common disease of chili, occurring in all cropping seasons in RRD. The disease occurred from the first fruit harvest and rapidly expanded in the following harvests to the end of the harvest cycle. Total 52 Colletotrichum isolates were collected from 9 provinces of RRD and 4 other provinces. All isolates were single spore isolated for further studies. Morphological analyses, based on conidial and appressorial characteristics grouped all isolates into 3 morphological groups. ITS sequence analyses of 10 representatives of morphological groups identified 2 isolates belonging to C. truncatum and 8 remaining isolates belonging to C. gloeosporioides s.l complex. Further sequence analyses of 9 isolates of the C. gloeosporioides s.l complex using the ApMat gene identified they belong to 4 species, C. gloeosporioides (sensu stricto), C. siamense, C. fructicola and C. aeschynomenes. All of these species are firstly identified in Vietnam. Based on identified species, 4 sets of primers specific to 4 common Colletotrichum species (C. gloeosporioides s.s; C. fructicola; C. siamense; C. truncatum). Annealing temperature, the most important PCR parameter, of all primer sets were optimized. At optimal annealing temperatures, all 4 primer sets were demonstrated to detect specifically corresponding Colletotrichum species. Remarkably, DNA extraction technique using NaOH and Tris buffer was firstly applied for Colletotrichum. The technique demonstrated to be very suitable to prepare DNA of Colletotrichums for PCR. PCR using the specific primer pairs were used to identify all collected 52 Coletotrichum isolates. PCR tests identified composition of Colletotrichum species causing anthracnose in chili peppers in RRD and other provinces encompassing 5 species, of which C. siamense was the most common species that accounted for 51.9%, followed by C. fructicola (21.2%), C. truncatum (15.4%), C. gloeosporioides s.s (9.6%) and C. aeschynomenes (1.9%). The key biological characteristics of 5 species of Colletotrichum were evaluated under invitro condition. Pathogenicity of 5 species on chili and some fruits was evaluated by artificial inoculation. Particularly, inoculation experiment showed conidia of C. siamense and C. truncatum were able to germinate, form appressoria, and penetrate directly through cutin layer, remain dormant state inside leaves without causing any symptoms at 6 weeks after inoculation. The results revealed an important source of the fungal pathogen in the field. Active ingredients Difenoconazole (Score 250EC) and Propiconazole (Tiptop 250EC) were identified to be highly effective for Colletotrichum control under in vitro conditions. At the recommended concentration, Score 250EC completely inhibited the growth and spore germination of the 5 fungal species; Tiptop 250 EC restricted 82.2 100% fungal growth and 69.1 - 100% spore germination of the 5 fungal species. xv PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây ớt (Capsicum sp) thuộc chi Capsicum, họ cà (Solanaceae) có xuất xứ từ Mehico, Goatemala và từ trung tâm khởi nguyên Đông Nam Á. Có hai nhóm ớt phổ biến là ớt cay (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum annuum L.). Trong nhóm cây trồng thuộc họ cà (Solanaceae), cây ớt có tầm quan trọng thứ hai chỉ sau cây cà chua. Ngày nay, ớt được trồng rộng rãi trên toàn thế giới từ 55o vĩ độ bắc đến 55o vĩ độ nam đặc biệt là ở các nước châu Mỹ và một số nước châu Á như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Hàn Quốc, Indonesia, Việt Nam, Malaysia. Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH) là một trong những vùng sản xuất ớt hàng hóa tập trung lớn của nước ta. Theo Tổng cục thống kê, đến năm 2017 diện tích trồng ớt của ĐBSH đạt 5.049 ha và sản lượng là 79.640 tấn. Hiện nay, cây ớt được xem là một trong những cây trồng quan trọng, mang lại hiệu hiệu quả kinh tế cao cho người sản xuất. Cũng như nhiều cây trồng khác, cây ớt bị tấn công bởi nhiều dịch hại. Trong số các dịch hại ớt, nấm Colletotrichum spp. (gây bệnh thán thư) được xem là nguy hiểm nhất (Than et al., 2008a). Tại Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan bệnh làm giảm từ 10 - 80% năng suất, cá biệt tại bang Ohio, Mỹ bệnh đã làm giảm gần 100% năng suất của cây ớt (Kumar, 2014; Sheu, 2013; Than et al., 2008a). Tại Việt Nam, tất cả các vùng trồng ớt tập trung như Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Nghệ An, Thanh Hóa, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế ... đều bị bệnh thán thư phá hại nặng. Cho tới năm 2008, thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt công bố trên thế giới khá đa dạng, bao gồm ít nhất 7 loài C. gloeosporioides, C. capsici, C. acutatum, C. coccodes, C. dematium, C. nigrum và C. atramentarium. Thành phần loài Colletotrichum gây bệnh thán thư trên cây ớt ở các quốc gia, các vùng khác nhau là khác nhau. Đến nay, đã có nhiều kết quả nghiên cứu về các loài được ghi nhận song vẫn còn nhiều điều cần được nghiên cứu thêm về quá trình lây bệnh và về mối quan hệ phức hợp giữa các loài (Than et al., 2008a). Tại Việt Nam, trước khi thực hiện đề tài này, ít nhất 4 loài là C. acutatum, C. capsici, C. gloeosporioides, C. nigrum đã được công bố gây bênh thán thư ớt (Don et al., 2007; Ngô Bích Hảo, 1991, 1992). 1 Việc định danh nấm Colletotrichum hại ớt (cũng như các loài Colletotrichum khác) dựa vào đặc điểm hình thái (màu sắc, tốc độ phát triển và cấu trúc tản nấm; hình dạng, kích thước bào tử phân sinh, đĩa áp ...) đã có quá nhiều nhầm lẫn. Nguyên nhân là do đặc điểm hình thái của các loài Colletotrichum có sự phụ thuộc cao vào điều kiện môi trường (Hyde et al., 2009a). Theo Weir et al. (2012) và Damm et al. (2012a) C. gloeosporioides và C. acutatum thực chất là các phức hợp loài, trong đó C. gloeosporioides gồm ít nhất 23 loài khác nhau và C. acutatum gồm ít nhất 31 loài khác nhau. Đối với nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư trên ớt, các nghiên cứu phân loại mới gần đây, dựa trên phân tích phân tử, cho thấy đã có thay đổi lớn về thành phần loài so với công bố trước đây. Tại Ấn Độ, định danh lại 52 mẫu nấm C. gloeosporioides sensu lato (s.l) cho thấy chúng thuộc 2 loài là C. fructicola và C. siamense (Sharma & Shenoy, 2013). Tại Thái Lan, 4 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt đã được xác định là C. gloeosporioides sensu stricto (s.s), C. siamense, C. acutatum và C. truncatum (Suwannarat et al., 2017). Tại Trung Quốc, phân tích trình tự của các mẫu nấm Colletotrichum thu tại 29 tỉnh đã xác định được 15 loài trong đó có 5 loài phổ biến là C. fioriniae, C. fructicola, C. gloeosporioides s.s, C. scovillei và C. truncatum (Diao et al., 2017). Tại Úc, 5 loài C. siamense, C. simmondsii, C. queenslandicum, C. truncatum và C. cairnsense đã được xác định gây bệnh thán thư ớt (De Silva et al., 2017a). Xác định chính xác thành phần cũng như định danh đúng nấm Colltetotrichum có vai trò quan trọng không những về mặt khoa học mà còn trong thực tiễn quản lý bệnh vì quan hệ giữa nấm với cây ký chủ cũng như tính mẫn cảm với thuốc hóa học khác nhau theo loài. Kim et al. (2004) đã cho thấy C. acutatum và C. gloeosporioides có thể nhiễm trên quả ớt ở mọi giai đoạn phát triển quả nhưng thường không gây bệnh trên lá và thân. Trái lại C. coccodes và C. dematium gây hại chủ yếu trên lá và thân cây ớt, đặc biệt cây con. Các loài Colltetotrichum cũng có tính gây bệnh khác nhau theo giai đoạn phát triển của quả ớt. Chẳng hạn, C. capsici gây hại phổ biến trên quả ớt đã chín đỏ, trong khi C. acutatum và C. gloeosporioides gây hại phổ biến trên cả quả ớt xanh và chín (Hong & Hwang, 1998; Kim et al., 1999). Các loài Colletotrichum có thể tồn tại ngoài tự nhiên dưới dạng các kiểu gây bệnh và chúng có tính gây bệnh khác nhau trên ớt. Hiện tại, việc phòng trừ bệnh thán thư hại ớt ngoài sản xuất chủ yếu được thực hiện bằng thuốc hóa học và chưa thu được hiệu quả như mong muốn. Nguyên nhân chủ yếu là: (i) thiếu thông tin đầy đủ, cập nhật và chính xác về thành phần 2 loài Colletotrichum gây bệnh, đặc biệt khi các tiêu chí phân loại chi nấm này đang thay đổi nhanh chóng; (ii) thiếu thông tin về các đặc điểm sinh học của các loài/ kiểu gây bệnh của nấm Colletotrichum phổ biến nhất, trong đó quan trọng là tính gây bệnh trên các giống ớt và phản ứng với các thuốc trừ nấm khác nhau. Việc xác định các thông tin trên có vai trò quan trọng vì nó sẽ là cơ sở khoa học chủ yếu để đề xuất các biện pháp kỹ thuật nhằm phòng chống hiệu quả bệnh thán thư hại ớt tại Việt Nam. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xác định được thành phần loài cũng như đánh giá được một số đặc điểm sinh học chủ yếu của nấm Colletotrichum hại ớt tại ĐBSH. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Đánh giá được hiện trạng gây hại của bệnh thán thư ớt tại ĐBSH. - Xác định được thành phần, mức độ phổ biến và phương pháp chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum chính hại ớt tại ĐBSH. - Xác định được tính gây bệnh của các loài nấm Colletotrichum chính phát hiện được trên cây ớt tại ĐBSH. - Đánh giá được hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng và dịch chiết địa y đối với các loài Colletotrichum chính phát hiện được trong điều kiện in vitro. 1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Bệnh thán thư gây hại trên cây ớt do nấm Colletotrichum spp. gây ra. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu về thành phần loài, một số đặc tính sinh học, tính gây bệnh và đánh giá hiệu lực của một số thuốc hóa học, vi khuẩn đối kháng, dịch chiết địa y với các loài nấm Colletotrichum spp. chính phát hiện được trong điều kiện in vitro. 1.3.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu Điều tra, đánh giá tác hại, thu thập mẫu bệnh thán thư hại ớt tại 9 tỉnh thuộc ĐBSH (Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam) và một số tỉnh khác (Sơn La, Bắc Giang, Thái Nguyên và Tiền Giang). 3