Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TRÊN THỊ TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TRÊN THỊ TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Hoàng Tuấn 2. TS. Phương Thiện Thương Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội 2. Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Hoàng Tuấn và TS. Phương Thiện Thương, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược liệu đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài; các anh, chị trong khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2013. Sinh viên TRẦN THỊ HẰNG AN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 Chương I. TỔNG QUAN ...................................................................................... 2 1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ..................................................................... 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật ............................................................................... 2 1.1.2. Phân bố, sinh thái ................................................................................ 3 1.1.3. Cách trồng .......................................................................................... 3 1.1.4. Thu hái và chế biến ............................................................................. 3 1.2. Thành phần hóa học .................................................................................... 3 1.2.1. Các diterpenoid ................................................................................... 4 1.2.2. Các alkaloid ........................................................................................ 5 1.2.3. Các flavonoid ...................................................................................... 6 1.2.4. Các triterpenoid................................................................................... 7 1.2.5. Các steroid .......................................................................................... 7 1.3. Tác dụng dược lý......................................................................................... 8 1.3.1. Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng khuẩn ......................... 8 1.3.2. Tác dụng chống viêm .......................................................................... 8 1.3.3. Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ................................ 8 1.3.4. Tác dụng ức chế SIRT1 ....................................................................... 9 1.3.5. Tác dụng trên tế bào tạo xương ........................................................... 9 1.4. Công dụng ................................................................................................. 10 1.4.1. Công dụng ........................................................................................ 10 1.4.2. Bài thuốc........................................................................................... 10 1.5. Tiêu chuẩn định tính, định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá trong Dược điển Việt Nam IV .................................................................................................... 11 1.5.1. Định tính ........................................................................................... 11 1.5.2. Chất chiết được trong dược liệu ........................................................ 12 Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 13 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu .......................................................... 13 2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................. 13 2.1.2. Hóa chất và dung môi ....................................................................... 14 2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu ......................................................... 14 2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 15 2.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học ................................................ 15 2.3.2. Chiết xuất, phân lập .......................................................................... 15 2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng 01 ent-kauran diterpenoid đã phân lập trong lá và cành cây Khổ sâm cho lá...................... 16 2.3.4. Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả .................... 18 Chương III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN .................................. 19 3.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học ....................................... 19 3.1.1. Định tính alkaloid ............................................................................. 19 3.1.2. Định tính flavonoid ........................................................................... 19 3.1.3. Định tính coumarin ........................................................................... 20 3.1.4. Định tính tanin .................................................................................. 20 3.1.5. Định tính saponin .............................................................................. 21 3.1.6. Định tính glycosid tim ....................................................................... 21 3.1.7. Định tính chất béo, sterol, caroten .................................................... 22 3.1.8. Định tính acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid, acid amin .............. 23 3.2. Chiết xuất, phân lập ................................................................................... 24 3.2.1. Chiết xuất.......................................................................................... 24 3.2.2. Phân lập ............................................................................................ 25 3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học chất CT-1 ................................................ 27 3.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng chất CT-1 từ lá và cành cây Khổ sâm cho lá ................................................................................................ 29 3.3.1. Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng .................................................................................................... 29 3.3.2. Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao ..................................................................................................... 31 3.3.3. Xây dựng phương pháp định lượng chất CT-1 trong dược liệu Khổ sâm cho lá bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao .................................................. 32 3.4. Bàn luận .................................................................................................... 38 3.4.1. Định tính các nhóm chất chính .......................................................... 38 3.4.2. Định tính và định lượng hoạt chất CT-1 ............................................ 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Một số ent -kauran phân lập được từ C. tonkinensis 4 Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng 13 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Khổ sâm cho lá 23 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR chất CT-1 28 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 33 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 34 Hình 3.5: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 35 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 36 Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD 36 Bảng 3.8: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu lá và cành 37 Khổ sâm cho lá DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) 2 Hình 1.2: Cấu trúc phân tử khung ent-kaur-16-en-15-on 4 Hình 1.3: Một số diterpen phân lập được từ Khổ sâm cho lá 5 Hình 1.4: Các flavonoid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7 Hình 1.5: Các steroid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7 Hình 2.1: Nguyên liệu nghiên cứu lá, cành non, cành già cây Khổ sâm cho lá 13 Hình 3.1: Sơ đồ chiết và phân đoạn cao lá Khổ sâm cho lá 25 Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CT-1 27 Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CT-1 29 Hình 3.4: Sắc ký đồ chất CT-1, lá và cành cây Khổ sâm cho lá 30 Hình 3.5: Sắc ký đồ HPLC của chất CT-1 (Hình A), lá Khổ sâm cho lá 32 (Hình B), cành Khổ sâm cho lá (Hình C) Hình 3.6: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 34 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT EtOAC Ethyl acetat EtOH Ethanol MeOH Methanol Hex Hexan SKLM Sắc ký lớp mỏng Rf Hệ số lưu UV Phổ tử ngoại (Ultra violet) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MS Phổ khối (Mass Spectroscopy) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) DĐVN Dược điển Việt Nam M Khối lượng phân tử ( Mass) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard devition) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) RAW 264,7 Dòng tế bào bạch cầu mono của chuột bị bệnh bạch cầu (Mouse leukaemic monocyte macrophage cell line) 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của ngành dược phẩm Việt Nam, việc mua bán, trao đổi dược liệu phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe và sản xuất chế phẩm đông dược ngày càng nhiều. Tuy nhiên, hệ thống quản lý và kiểm tra chất lượng dược liệu của nước ta còn nhiều hạn chế và chưa được các cơ quan có thẩm quyền quan tâm đứng mức. Vì vậy, việc xây dựng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đưa chúng vào các tài liệu là cơ sở pháp lý của việc kiểm nghiệm như Dược điển Việt Nam là rất cần thiết. Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài, ăn không tiêu, chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1]. Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây Khổ sâm cho lá đã khẳng định các diterpen thuộc nhóm ent-kauran có tác dụng chống ung thư và chống viêm rất mạnh [21]. Trong DĐVN IV đã có chuyên luận về dược liệu Khổ sâm cho lá. Tuy nhiên, trong chuyên luận chưa có tiêu chí về định tính, định lượng ent-kauran [3]. Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc Khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường”. Với 3 mục tiêu: - Định tính các thành phần hóa học có trong lá cây Khổ sâm cho lá. - Chiết xuất, phân lập 01 ent-kauran chính trong Khổ sâm cho lá dùng làm chất đối chiếu trong định tính, định lượng. - Xây dựng phương pháp định tính, định lượng ent-kauran phân lập được trong dược liệu Khổ sâm cho lá. 2 Chương I. TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 1.1.1. Đặc điểm thực vật Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) (Hình 1.1) [1], [4], [5], [7]. Tên khác: Khổ sâm cho lá, Cù đèn, Co chạy đón (Thái) [1]. Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Khổ sâm cho lá là cây nhỏ, mọc thành bụi cao từ 1-2 m [1], [7]. Lá mọc so le, gần như mọc đối 3-6 lá chụm lại thành kiểu vòng giả. Lá hình mũi mác hẹp, hơi tù ở gốc, đầu nhọn, dài và có mỏ, mép nguyên dài 5-9 cm, rộng 13 cm, cả hai mặt lá đều có lông hình khiên óng ánh (kiểu lông ở lá cây nhót), dày hơn ở mặt dưới. Ba gân chính tỏa ra từ gốc lá cùng với hai tuyến dạng răng nhỏ, cuống phủ lông hình khiên, có cuống lá kèm rụng sớm. Khi phơi khô mặt lá ở dưới có màu trắng bạc, mặt trên có màu nâu đen [1], [7]. Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành tạo thành chùm dài 2-7 cm, gồm cả hoa đực và hoa cái hoặc hoa đực và hoa cái riêng. Hoa đực có cuống màu bạc, 5 lá đài 3 hình bầu dục, tràng 5 cánh hoa, thuôn hình dải có lông mịn ở mép, 12 nhị, chỉ nhị có lông tơ ở phần dưới. Hoa cái có 5 lá đài hình bầu dục-mũi mác, bầu hình cầu, thuôn dần ở đỉnh. Ba vòi nhụy xẻ đôi đến tận giữa, tỏa rộng ra [1], [7]. Quả nang hình cầu, khi khô nứt thành 3 mảnh, trên đỉnh mỗi mảnh có một bướu nhỏ, màu hung đỏ, có lông ánh bạc [1], [7]. Hạt hình trứng, màu nâu hung, có mỏ ở đỉnh, mồng rất bé. Cây ra hoa và kết quả từ tháng 5 đến tháng 8 [1], [7]. 1.1.2. Phân bố, sinh thái Khổ sâm cho lá được trồng ở khắp nơi, trong các vườn gia đình hoặc vườn thuốc, chủ yếu các tỉnh phía Bắc Việt Nam [5]. Khổ sâm cho lá thuộc loại cây bụi, ưa sáng và có thể hơi chịu hạn. Cây rụng lá hàng năm về mùa đông, sinh trưởng mạnh vào mùa hè thu, ra quả nhiều, tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt và cây chồi sau khi chặt [1]. 1.1.3. Cách trồng Khổ sâm cho lá được trồng rải rác ở nhiều nơi để làm thuốc và làm cảnh. Trồng bằng cành hoặc bằng hạt vào tháng 2-3. Cây không kén đất, chỉ cần không úng ngập. Trồng ở vườn với khoảng cách 1-1,5 m hoặc trồng trong chậu. Cây có khả năng chịu hạn tốt, không bị sâu bệnh [1]. 1.1.4. Thu hái và chế biến Thu hoạch lá và ngọn non quanh năm, rửa sạch, cắt thành từng đoạn dài khoảng 1 cm đến 3 cm, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô. Khi dùng sao vàng [3]. Thu hái khi cây đang có hoa, đem phơi hoặc sấy khô, khi dùng đem sao vàng [1], [4], [5], [7]. 1.2. Thành phần hóa học Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Khổ sâm cho lá cho biết thành phần hóa học chính của C. tonkinensis là các diterpen thuộc nhóm ent-kauran. Ngoài ra có các nhóm chất khác như flavonoid [13], alkaloid [12], steroid, triterpenoid [10]. 4 1.2.1. Các diterpenoid Đến nay đã xác định được cấu trúc của rất nhiều diterpen phân lập từ cây C. tonkinensis, hầu hết chúng là các chất thuộc dẫn xuất hydroxy của bộ khung entkaur-16-en-15-on (Hình 1.2). Một số crotonkin chính đã phân lập được gọi tên (Bảng 1.1) và công thức cấu tạo (Hình 1.3). Hình 1.2: Cấu trúc phân tử khung ent-kaur-16-en-15-on Bảng 1.1: Một số ent-kauran phân lập được từ C. tonkinensis STT Tên khoa học CTPT M Tài liệu 1 ent-18-acetoxy-7β-hydroxy kaur16-en-15-on C22H32O4 360 [11], [23] C22H32O5 376 [31] C20H30O3 318 [25] C22H32O5 376 [25] C20H30O3 318 [32] C22H34O3 346 [26] C24H36O5 404 [28] C24H34O6 418 [28] C24H34O6 418 [26] C24H34O6 418 [26] 9 ent-1α-acetoxy-7β,14α-dihydroxy kaur-16-en-15-on ent-7β,14α-dihydroxy kaur-16-en15-on ent-18α-acetoxy-7β,14α – dihydroxy kaur-16-en-15-on ent-7β,18α-dihydroxy kaur-16-en15-on ent-18α-acetoxy-7β-hydroxy kauran-15-on ent-7β,18α-diacetoxy kauran-15on ent-11α,18α-diacetoxy-7β hydroxy kaur-16-en-15-on ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxy kaur-16-en-15-on 10 ent-1α,7β-diacetoxy-14α-hydroxy kaur-16-en-15-on 2 3 4 5 6 7 8 5 ent-18-acetoxy-7β-hydroxy ent-1α-acetoxy-7β,14α- ent-7β,14α-dihydroxy kaur- kaur-16-en-15-on dihydroxy kaur-16-en-15-on 16-en-15-on ent-18α-acetoxy-7β,14α- ent-7β,18α-dihydroxy kaur- ent-18α-acetoxy-7β-hydroxy dihydroxy kaur-16-en-15-on 16-en-15-on kauran-15-on ent-7β,18α-diacetoxy kauran- ent-11α,18α-diacetoxy-7β - ent-1α,14α-diacetoxy-7β- 15-on hydroxy kaur-16-en-15-on hydroxy kaur-16-en-15-on ent-1α,7β-diacetoxy-14αhydroxy kaur-16-en-15-on Hình 1.3: Một số diterpen phân lập được từ Khổ sâm cho lá [21] 1.2.2. Các alkaloid Cho đến nay đã phân lập và nhận dạng được 4 nhóm alkaloid chính từ C. tonkinensis với bộ khung rất phong phú đó là: 6  Alkaloid khung berbin: corytenchin, corytenchirin [9], [12]. H3CO R N Tên chất R H3CO H -H Corytechin -CH3 Corytenchirin OCH3 OH  Alkaloid khung protoberberin: dehydrocorytenchin [14].  Alkaloid khung benzyltetrahydroisoquinolin: laudanidin [14].  Alkaloid khung aporphin: corunnin, oxoglaucin [15]. H3CO N R1 R3 R1 R2 R3 Tên chất =O -O-CH3 -CH3 Corunnin -O-CH3 -O-CH3 Oxoglaucin H3CO R2 1.2.3. Các flavonoid Các flavonoid đã phân lập được từ cây C. tonkinensis là kaempferol, vitexin, và isovitexin (Hình 1.4) [9], [13]. Kaempferol là một flavonol gặp rất phổ biến trong giới thực vật, có hoạt tính chống viêm nhiễm, lợi tiểu, chống oxy hoá. Vitexin chỉ có hoạt tính yếu với nấm Aspergillius niger, còn isovitexin thì không có hoạt tính [9]. 7 Kaempferol Vitexin Isovitexin (3,4’,5,7- (apigenin-8C-β-D- (apigenin-6C-β-D- tetrahydroxyflavon) glucopyranosid) glucopyranosid) Hình 1.4: Các flavonoid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 1.2.4. Các triterpenoid Hai hợp chất triterpenoid được phát hiện từ C. tonkinensis đó là α-Amyrin acetat và Acetyl aleuritolic acid [10]. AcO AcO α-Amyrin acetat Acetyl aleuritolic acid (urs-12-en-3β-yl acetat) (3β-hydroxy taracer-14-en-28-oic acid) 1.2.5. Các steroid Nhóm chất steroid tìm thấy trong dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của C. tonkinensis, chủ yếu thuộc loại sterol C29 với bộ khung 3β-ol, Δ5-pregnan, có mạch nhánh với cấu hình và cấu dạng khác nhau. Đó là các β-sitosterol, poriferasterol, βsitosterol-3-O-β-D-glucopyranosyl (Hình 1.5) [9]. R2 R 1O Hình 1.5: Các steroid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá R1 R2 Tên chất H β-sitosterol H Poriferasterol C6H12O5 β-sitosterol-3O-β-Dglucopyranosyl 8 1.3. Tác dụng dược lý 1.3.1. Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng khuẩn Phân đoạn alkaloid toàn phần chiết từ lá C. tonkinensis có tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum và P. berghei trên in-vitro và trên chuột [19]. Một số dịch chiết (cồn, aceton, ethyl acetat và nước) và các phân đoạn alkaloid, flavonoid có tác dụng kháng một số dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, E. coli, Klebsiella, Staphylococcus aureus, nhưng không có tác dụng đến hai chủng Samonella typhy và Shigella [19]. Năm 2006, Phan Minh Giang và cộng sự đã cho biết tác dụng kháng tụ cầu khuẩn (S. aureus) của các ent-kauran diterpen phân lập từ lá C. tonkinensis [29]. Các chất 1, 4 (Hình 1.3) cho tác dụng mạnh nhất trên S. aureus và S. aureus đã kháng methicillin [29]. 1.3.2. Tác dụng chống viêm Những kết quả nghiên cứu đã khẳng định rằng các ent-kauran diterpenoid có tác dụng chống viêm mạnh. Năm 2003, bốn diterpen 1-4 (Hình 1.3) được phát hiện có tác dụng ức chế quá trình kích thích NF-κB và ức chế tổng hợp ra nitric oxid (NO) trên tế bào RAW 264,7 được kích hoạt bởi lypopolysachrid (LPS), mạnh hơn nhiều hai chất đối chứng là parthenolid và aminoguanidin [25]. Chúng còn ức chế sự hoạt động của enzym NADPH oxidase (NOX), một tác nhân quan trọng trong quá trình gây viêm. Hai grayanan diterpenoid tách từ Khổ sâm cho lá cũng thể hiện tác dụng chống viêm khi ức chế sự hóa enzym Cyclooxygenase 2 (COX-2), tuy nhiên, cả hai chất đều có tác dụng ức chế COX-2 kém hơn chất 1 (Hình 1.3) [21], [34]. Như vậy, 1 là chất có tác dụng chống viêm mạnh nhất trong dược liệu Khổ sâm cho lá. 1.3.3. Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư Dịch chiết phân đoạn dicloromethan từ Khổ sâm cho lá có tác dụng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2, ung thư màng tử cung người (FI), ung thư biểu mô (KB), ung thư vú MCF-7, ung thư phổi NCI-H460, SF-268 [34]. Phân lập các hoạt chất theo định hướng thử hoạt tính. Kết quả thu được cho 9 thấy cấu trúc 16-en-15-one (O = C − CH = CH −), nhóm OH ở vị trí số 7, và nhóm acetyl ở vị trí số 18 rất quan trọng đối với tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [33], [36]. Cơ chế của tác dụng chống ung thư có thể là ức chế NF-B, ức chế sự tăng sinh mạch máu, hay theo cơ chế apoptosis [21]. Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng 1 không có độc tính đối với các nguyên bào sợi. Điều này có nghĩa khi điều trị bằng 1 tế bào bình thường ít bị ảnh hưởng hơn so với các tế bào khối u, do cơ chế chống ung thư tạo ra bởi 1 tập trung vào các tế bào khối u [36]. 1.3.4. Tác dụng ức chế SIRT1 Các chất 1-5, 9 và 10 (Hình 1.3) có tác dụng ức chế Sirt1 mạnh hơn chất đối chiếu dương là nicotinamid. Giống ba tác dụng trước, cấu trúc 16-en-15-one (O=C−CH=CH−) kết hợp với nhóm thế (OH hoặc OAc) tại vị trí số 7 đặc biệt quan trọng cho tác dụng ức chế Sirt1. Có nhiều chất tự nhiên và tổng hợp ức chế Sirt1 đã được tìm thấy, nhưng việc tìm ra các diterpen nhóm ent-kauran có tác dụng mạnh hơn so với nicotinamid đã đưa ra một nhóm chất mới có tác dụng ức chế protein Sirt1 [25]. Sirt1 (hay sir2) là một thành viên của Sirtuin được tìm thấy trong tế bào của người, đó là một nhóm protein chứa các enzym histone deacetylase hoặc mono-ribosyl transferase. Sirtuin đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh các quá trình sinh học trong sinh vật, có ảnh hưởng đến các quá trình sao chép, lão hóa, apoptosis. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các chất có ức chế Sirt1 có thể có tác dụng chống ung thư. Như vậy, tác dụng ức chế Sirt1 có thể gợi ý một cơ chế tác dụng chống ung thư mới của các ent-kauran diterpen phân lập từ C. tonkinensis [21]. 1.3.5. Tác dụng trên tế bào tạo xương Các diterpenoid ent-kauran từ Khổ sâm cho lá còn có tác dụng kích thích trực tiếp vào nguyên bào xương. Đó là các phân tử điều trị tiềm năng chống lại các bệnh về xương như loãng xương [35]. Phương Thiện Thương và cộng sự đã chứng minh ent-7-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl acetat (1) là chất thường có tác dụng tốt nhất đối với tất cả các nghiên cứu về kháng khuẩn, ức chế các enzym nitric oxide synthetase và NADPH 10 oxidase (NOX), ức chế sự hoạt động của các protein NF-B và Sirt1, và độc đối với các tế bào ung thư [21]. Vì vậy, việc xây dựng phương pháp định tính và định lượng hàm lượng 1 trong các mẫu Khổ sâm cho lá trên thị trường là rất cần thiết. 1.4. Công dụng 1.4.1. Công dụng Khổ sâm cho lá được dùng trị ung nhọt, sang lở, chốc đầu (sắc uống và rửa ngoài), đau bụng khó tiêu, lỵ, viêm loét dạ dày, tá tràng. Ngoài ra, Khổ sâm cho lá còn được dùng trong các phương thuốc chữa mẩn ngứa, phong hủi, vảy nến, viêm âm đạo trùng roi và sa sinh dục (sắc uống và rửa ngoài). Liều dùng hàng ngày là 1224 g, có khi tới 40 g, dạng thuốc sắc [1], [19]. 1.4.2. Bài thuốc 1.4.2.1. Chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1], [7], [19] a. Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 50 g; Bồ công anh 20 g. Sắc uống. b. Lá Khổ sâm cho lá, Bồ công anh, Nhân trần, mỗi vị 12 g; Lá khôi, Chút chít, mỗi vị 10 g. Tán bột, mỗi ngày uống 30 g với nước đun sôi để nguội. c. Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 40 g; Bồ công anh 20 g; Uất kim, Hậu phác, mỗi vị 12 g; Ngải cứu 8 g; Cam thảo 4 g. Sắc uống hoặc nấu cao pha siro uống. 1.4.2.2. Chữa đau bụng không rõ nguyên nhân [1] Nhai mấy lá Khổ sâm cho lá tươi với muối, nếu có nôn hay sôi bụng thêm miếng gừng tươi. 1.4.2.3. Chữa lỵ cấp tính, tiêu chảy [1], [19] a. Lá Khổ sâm cho lá, lá Phèn đen, mỗi thứ một nắm sắc uống. b. Khổ sâm cho lá, Rau sam, Cỏ sữa, Cỏ nhọ nồi, lá Mơ lông, mỗi vị 10 g, sắc uống ngày 1 thang. c. Khổ sâm cho lá 16 g; Hương phụ 10 g; củ Sả 6 g; vỏ Quýt 6 g; Gừng khô 3 lát. Sắc uống ngày 1 thang. 11 1.4.2.4. Chữa viêm da thần kinh thể phong nhiệt mới mắc [1] a. Khổ sâm cho lá 12 g; Sinh địa, Thổ phục linh, mỗi vị 16 g; Cúc hoa, Kim ngân hoa, Ké đầu ngựa, mỗi vị 12 g; Đan bì 8 g. Sắc uống ngày một thang. b. Khổ sâm cho lá 12 g ; Kinh giới, Sinh địa, mỗi vị 16 g; Phòng phong, Kim ngân, Cúc hoa, Tạo giác thích, mỗi vị 12 g; Thuyền thoái 6 g. Sắc uống ngày một thang. 1.4.2.5. Chữa bệnh phong hủi [19] a. Khổ sâm cho lá 500 g; lá Xoan 300 g; rượu trắng 1 lít. Ngâm rượu uống. b. Khổ sâm cho lá 600 g; Tạo giác bỏ vỏ 1000 g; Hà thủ ô trắng 200 g; Phòng phong 100 g. Hoàn to bằng hạt ngô, ngày uống 3-4 lần, mỗi lần 20 viên. 1.4.2.6. Chữa vảy nến [1] Khổ sâm cho lá, Huyền sâm, Kim ngân, Sinh địa, mỗi loại 15 g; quả Ké 10 g. Làm thành viên, ngày uống 20-25 g. 1.5. Tiêu chuẩn định tính, định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá trong Dược điển Việt Nam IV [3]. DĐVN IV đã có riêng một chuyên luận về Khổ sâm cho lá trong đó trình bày các phần: mô tả thực vật, đặc điểm vi học (vi phẫu, soi bột), độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất, tỉ lệ thân cành, chế biến, bảo quản, tính vị-quy kinh, công năng-chủ trị, cách dùng-liều lượng và có cả các tiêu chuẩn để định tính theo phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng và tiêu chuẩn định lượng theo chất chiết được trong dược liệu. 1.5.1. Định tính A. Lấy khoảng 2 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 25 ml dung dịch acid sulfuric 2% (TT). Đun cách thủy ở 1000C trong 10 phút, lọc. Lấy khoảng 1 ml dịch lọc cho vào chén sứ trắng. Thêm 5 giọt đến 6 giọt thuốc thử Dragendoff (TT). Để yên khoảng 1 phút sẽ có tủa màu cam sậm. Lấy khoảng 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT), xuất hiện màu nâu đen. B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng