Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài hải miên smenospongia cerebriformis duchassaing & michelotti, 1864

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- LÊ THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI HẢI MIÊN Smenospongia cerebriformis DUCHASSAING & MICHELOTTI, 1864 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ----------------------------- LÊ THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LOÀI HẢI MIÊN Smenospongia cerebriformis DUCHASSAING & MICHELOTTI, 1864 Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số : 62440114 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Phan Văn Kiệm 2. PGS.TS. Nguyễn Văn Đậu Hà Nội - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phan Văn Kiệm và PGS.TS. Nguyễn Văn Đậu. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả Lê Thị Huyền i LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS. TS. Phan Văn Kiệm và PGS.TS. Nguyễn Văn Đậu - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là TS. Nguyễn Xuân Nhiệm, TS. Bùi Hữu Tài và ThS. Đan Thị Thúy Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi trong việc thử hoạt tính kháng viêm. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và đồng nghiệp của tôi tại PTN Hóa dược – Khoa Hóa học, tới Ban lãnh đạo Khoa, Phòng Tổ chức cán bộ và Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà nội đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi cũng xin được được cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài VAST.TĐ.DLB.01/16-18 và chương trình 911 của Chính phủ Việt Nam đã giúp tôi hoàn thành Luận án này. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình tôi, đặc biệt là chồng và hai con trai đã luôn là điểm tựa vững chắc, chia sẻ mọi khó khăn trong cuộc sống; tới bạn bè và các chị em thân thiết đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Lê Thị Huyền ii MỤC LỤC MỤC LỤC .................................................................................................... iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... vi DANH MỤC MỤC BẢNG .......................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... x ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ....................... 3 1.1. Giới thiệu về hải miên ............................................................................ 3 1.1.1. Giới thiệu chung về hải miên .......................................................... 3 1.1.2. Giới thiệu chung về giống Smenospongia ...................................... 4 1.2. Tình hình nghiên cứu về giống Smenospongia trên thế giới ................. 5 1.2.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài hải miên thuộc giống Smenospongia ................................................................................. 5 1.2.2. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của giống Smenospongia .. 18 1.3. ..........................................Tình hình nghiên cứu các loài hải miên ở Việt Nam Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 32 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 33 2.2.1. Phương pháp phân lập các chất..................................................... 33 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ....................................... 34 2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học ..................................... 35 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .......................................... 44 3.1. Phân lập các hợp chất từ loài S. cerebriformis ................................... 44 3.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất ................................ 49 3.2.1. Hợp chất SM1: Smenohaimien A (hợp chất mới) ........................ 49 iii 27 3.2.2. Hợp chất SM2: Smenohaimien B (hợp chất mới) ........................ 49 3.2.3. Hợp chất SM3: Smenohaimien C (hợp chất mới) ........................ 49 3.2.4. Hợp chất SM4: Smenohaimien D (hợp chất mới) ........................ 50 3.2.5. Hợp chất SM5: Smenohaimien E (hợp chất mới) ........................ 50 3.2.6. Hợp chất SM6: Smenohaimien F (hợp chất mới)......................... 50 3.2.7. Hợp chất SM7: Smenocerones A (hợp chất mới)......................... 51 3.2.8. Hợp chất SM8: Smenocerones B (hợp chất mới) ......................... 51 3.2.9. Hợp chất SM9: Dictyoceratin-C ................................................... 51 3.2.10. Hợp chất SM10: Polyfibrospongol A ......................................... 51 3.2.11. Hợp chất SM11: Polyfibrospongol B ......................................... 51 3.2.12. Hợp chất SM12: 19-hydroxy-polyfibrospongol B ..................... 52 3.2.13. Hợp chất SM13: Ilimaquinone ................................................... 52 3.2.14. Hợp chất SM14: Neodactyloquinone ......................................... 52 3.2.15. Hợp chất SM15: Dactyloquinone C ........................................... 53 3.2.16. Hợp chất SM16: Dactyloquinone D ........................................... 53 3.2.17. Hợp chất SM17: Dactylospongenone A ..................................... 53 3.2.18. Hợp chất SM18: Dactylospongenone B ..................................... 53 3.2.19. Hợp chất SM19: Dactylospongenone C ..................................... 54 3.2.20. Hợp chất SM20: Dactylospongenone D ..................................... 54 3.2.21. Hợp chất SM21: Amijiol ............................................................ 54 3.2.22. Hợp chất SM22: Isoamijiol......................................................... 54 3.2.23. Hợp chất SM23: Indole-3-aldehyde ........................................... 55 3.2.24. Hợp chất SM24: Indole-3-carboxylic methyl ester .................... 55 Chƣơng 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ ....................................................... 56 4.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất..................................................... 56 4.1.1. Hợp chất SM1: Smenohaimien A (hợp chất mới) ........................ 56 4.1.2. Hợp chất SM2: Smenohaimien B (hợp chất mới) ........................ 64 4.1.3. Hợp chất SM3: Smenohaimien C (hợp chất mới) ........................ 72 4.1.4. Hợp chất SM4: Smenohaimien D (hợp chất mới) ........................ 78 4.1.5. Hợp chất SM5: Smenohaimien E (hợp chất mới) ........................ 85 4.1.6. Hợp chất SM6: Smenohaimien F (hợp chất mới)......................... 92 4.1.7. Hợp chất SM7: Smenocerone A (hợp chất mới) .......................... 99 4.1.8. Hợp chất SM8: Smenocerone B (hợp chất mới) ........................ 104 iv 4.1.9. Hợp chất SM9: Dictyoceratin C ................................................. 110 4.1.10. Hợp chất SM10: Polyfibrospongol A ....................................... 112 4.1.11. Hợp chất SM11: Polyfibrospongol B ....................................... 114 4.1.12. Hợp chất SM12: 19-hydroxy-polyfibrospongol B ................... 117 4.1.13. Hợp chất SM13: Ilimaquinone ................................................. 120 4.1.14. Hợp chất SM14: Neodactyloquinone ....................................... 122 4.1.15. Hợp chất SM15: Dactyloquinone C ......................................... 125 4.1.16. Hợp chất SM16: Dactyloquinone D ......................................... 127 4.1.17. Hợp chất SM17: Dactylospongenone A ................................... 129 4.1.18. Hợp chất SM18: Dactylospongenone B ................................... 132 4.1.19. Hợp chất SM19: Dactylospongenone C ................................... 134 4.1.20. Hợp chất SM20: Dactylospongenone D ................................... 136 4.1.21. Xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất SM17-SM20 .... 138 4.1.22. Hợp chất SM21: Amijiol .......................................................... 140 4.1.23. Hợp chất SM22: Isoamijiol....................................................... 142 4.1.24. Hợp chất SM23: Indole-3-aldehyde ......................................... 145 4.1.25. Hợp chất SM24: Indole-3-cacboxylic methyl ester .................. 146 4.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học ........................................................... 149 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất .............. 149 4.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất ................... 153 KẾT LUẬN ................................................................................................. 156 KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 158 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN…………………………………………………………... 159 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 160 v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu 13 C-NMR 1 H-NMR A-498 A-549 CD COSY DEPT DMSO DNA DPPH ESI-MS FBS Glc HeLa Hep G2 HL-60 HMBC HPLC HR-ESIMS HSQC HT-29 HCT-116 Tiếng Anh Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Human kidney carcinoma Human lung carcinoma Circular dichroism Correlation Spectroscopy Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Dimethylsulfoxide Deoxyribo Nucleic Acid 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl Diễn giải Ph cộng hưởng t hạt nhân carbon 13 Ph cộng hưởng t hạt nhân proton Ung thư biểu mô thận người Ung thư ph i người Ph lưỡng sắc tròn Ph COSY DEPT (CH3)2SO Deoxyribo Nucleic Acid 1,1diphenyl-2picrylhydrazyl Electrospray Ionization Mass Ph khối ion h a phun m Spectrometry điện Fetal bovine serum Huyết thanh nhau thai bò Glucose Glucozơ Human epitheloid cervix Tế bào ung thư c tử cung carcinoma người Hepatocellular carcinoma Ung thư biểu mô gan người Human promyelocytic leukemia Ung thư máu người Heteronuclear Multiple Bond Ph tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography High Resolution Electrospray Ph khối lượng phân giải cao Ionization Mass Spectrometry phun m điện Heteronuclear Single-Quantum Ph tương tác dị hạt nhân qua Coherence 1 liên kết Human colon adenocarcinoma Ung thư ruột kết người Human colon carcinoma Ung thư đại tràng người vi HEK-293 IC50 IL iNOS KB LPO LPS LU-1 L-NMMA MCF-7 MTT Mult. NOESY PACA-2 PC-3 RPMI S SK-MEL2 SRB SW-480 TLC TMS TNF-α Tế bào thận phôi người Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Interleukin Interleukin Inducible nitric oxide synthase Một enzyme tạo ra nitric oxide t amino L-arginine acid Human epidemoid carcinoma Ung thư biểu mô người Lipid peroxide Lipid peroxide Lipopolysaccharide Lipopolysaccharide Human lung carcinoma Ung thư ph i người N-monomethyl-L-arginine N-monomethyl-L-arginine monoacetate monoacetate Human breast carcinoma Ung thư vú người 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium 2,5-diphenyltetrazolium bromide bromide Multiple Độ bội Nuclear Overhauser Ph NOESY Enhancement Spectroscopy Human Pancreatic Carcinoma Ung thư biểu mô tuyến tụy người Human Prostate Ung thư tuyến tiền liệt người Adenocarcinoma Roswell Park Memorial Institute Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI Smenospongia Smenospongia Human Melanoma cell line Ung thư da người Sulforhodamine B Sulforhodamine B Human colon adenocarcinoma Ung thư tuyến tụy người Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng Tetramethylsilane (CH3)4Si Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u Human Embryo Kidney cell Inhibitory concentration at 50% vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất sesquiterpene t giống Smenospongia ............................................. 6 Bảng 1.2. Các hợp chất sesterterpene t giống Smenospongia .............................................. 8 Bảng 1.3. Các hợp chất indole alkaloid t giống Smenospongia ......................................... 12 Bảng 1.4. Các hợp chất thiazole t giống Smenospongia ..................................................... 16 Bảng 1.5. Các hợp chất khác t các loài thuộc giống Smenospongia .................................. 17 Bảng 4.1. Số liệu ph NMR của hợp chất SM1 và hợp chất tham khảo ............................. 59 Bảng 4.2. Số liệu ph NMR của hợp chất SM2 và hợp chất tham khảo SM1 ................... 65 Bảng 4.3. Số liệu ph NMR của hợp chất SM3 và hợp chất tham khảo ............................. 73 Bảng 4.4. Số liệu ph NMR của hợp chất SM4 và hợp chất tham khảo ............................. 81 Bảng 4.5. Số liệu ph NMR của hợp chất SM5 và hợp chất tham khảo ............................. 87 Bảng 4.6. Số liệu ph NMR của hợp chất SM6 và hợp chất tham khảo ............................. 94 Bảng 4.7. Số liệu ph NMR của hợp chất SM7 và hợp chất tham khảo ........................... 101 Bảng 4.8. Số liệu ph NMR của hợp chất SM8 .................................................................. 106 Bảng 4.9. Số liệu ph NMR của hợp chất SM9 và hợp chất tham khảo ........................... 111 Bảng 4.10. Số liệu ph NMR của hợp chất SM10 và hợp chất tham khảo ....................... 113 Bảng 4.11. Số liệu ph NMR của hợp chất SM11 và hợp chất tham khảo ....................... 115 Bảng 4.12. Số liệu ph NMR của hợp chất SM12 và hợp chất tham khảo ....................... 118 Bảng 4.13. Số liệu ph NMR của hợp chất SM13 và hợp chất tham khảo ....................... 121 Bảng 4.14. Số liệu ph NMR của hợp chất SM14 và hợp chất tham khảo ....................... 124 Bảng 4.15. Số liệu ph NMR của hợp chất SM15 và hợp chất tham khảo ....................... 126 Bảng 4.16. Số liệu ph NMR của hợp chất SM16 và hợp chất tham khảo ....................... 128 Bảng 4.17. Số liệu ph NMR của hợp chất SM17 và hợp chất tham khảo ....................... 131 Bảng 4.18. Số liệu ph NMR của hợp chất SM17, SM18 và hợp chất tham khảo ..... 133 Bảng 4.19. Số liệu ph NMR của hợp chất SM19 và hợp chất tham khảo ....................... 135 Bảng 4.20. Số liệu ph NMR của hợp chất SM20 và hợp chất tham khảo ....................... 137 Bảng 4.21. Số liệu ph NMR của hợp chất SM21 và hợp chất tham khảo ....................... 141 Bảng 4.22. Số liệu ph NMR của hợp chất SM22 và hợp chất tham khảo ....................... 144 viii Bảng 4.23. Số liệu ph NMR của hợp chất SM23 và hợp chất tham khảo ....................... 146 Bảng 4.24. Số liệu ph NMR của hợp chất SM24 và hợp chất tham khảo ....................... 146 Bảng 4.25.Thống kê hợp chất phân lập được t loài S.cerebriformis ................................ 148 Bảng 4.26. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất .................................... 149 Bảng 4.27. % tế bào chết theo chương trình ........................................................................ 152 Bảng 4.28. Tác dụng ức chế sự sản sinh NO trong đại thực bào ........................................ 153 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh một số loài hải miên thuộc giống Smenospongia ................................... 5 Hình 2.1. Hình ảnh loài hải miên Smenospongia cerebriformis........................................... 32 Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất t loài S. cerebriformis............................................ 47 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của SM1 và các hợp chất tham khảo ........................................ 56 Hình 4.2. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất SM1 ................. 59 Hình 4.3. Ph CD thực nghiệm của hợp chất SM1 và ph CD tính toán của 4 đồng phân lập thể SM1a-SM1d................................................................................................................ 60 Hình 4.4. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM1...................................................................... 61 Hình 4.5. Ph 1H-NMR của hợp chất SM1 ........................................................................... 61 Hình 4.6. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM1 .......................................................................... 62 Hình 4.7. Ph DEPT của hợp chất SM1 ................................................................................ 62 Hình 4.8. Ph HSQC của hợp chất SM1 ............................................................................... 63 Hình 4.9. Ph HMBC của hợp chất SM1 .............................................................................. 63 Hình 4.10. Ph 1H-1H COSY của hợp chất SM1 .................................................................. 64 Hình 4.11. Ph NOESY của hợp chất SM1 .......................................................................... 64 Hình 4.12. Cấu trúc h a học của SM2 và hợp chất tham khảo SM1................................... 64 Hình 4.13. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất SM2 ............... 66 Hình 4.14. Ph CD thực nghiệm của hợp chất SM2 và ph CD tính toán của 4 đồng phân lập thể SM1a-SM1d................................................................................................................ 67 Hình 4.15. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM2 ................................................................... 68 Hình 4.16. Ph 1H-NMR của hợp chất SM2 ......................................................................... 68 Hình 4.17. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM2 ........................................................................ 69 Hình 4.18. Ph DEPT của hợp chất SM2 .............................................................................. 69 Hình 4.19. Ph HSQC của hợp chất SM2 ............................................................................. 70 Hình 4.20. Ph HMBC của hợp chất SM2 ............................................................................ 71 Hình 4.21. Ph NOESY của hợp chất SM2 .......................................................................... 71 Hình 4.22. Ph 1H-1H COSY của hợp chất SM2 .................................................................. 71 Hình 4.23. Cấu trúc h a học của SM3 và hợp chất tham khảo ............................................ 72 x Hình 4.24. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất SM3 ............... 73 Hình 4.25. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM3 ................................................................... 75 Hình 4.26. Ph 1H-NMR của hợp chất SM3 ......................................................................... 75 Hình 4.27. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM3 ........................................................................ 76 Hình 4.28. Ph HSQC của hợp chất SM3 ............................................................................. 76 Hình 4.29. Ph HMBC của hợp chất SM3 ............................................................................ 77 Hình 4.30. Ph NOESY của hợp chất SM3 .......................................................................... 77 Hình 4.31. Ph 1H-1H COSY của hợp chất SM3 .................................................................. 78 Hình 4.32. Cấu trúc h a học của SM4 và hợp chất tham khảo ............................................ 78 Hình 4.33. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất SM4............................. 81 Hình 4.34. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM4 ................................................................... 82 Hình 4.35. Ph 1H-NMR của hợp chất SM4 ......................................................................... 83 Hình 4.36. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM4 ........................................................................ 83 Hình 4.37. Ph HSQC của hợp chất SM4 ............................................................................. 84 Hình 4.38. Ph HMBC của hợp chất SM4 ............................................................................ 84 Hình 4.39. Ph NOESY của hợp chất SM4 .......................................................................... 85 Hình 4.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất SM5 và hợp chất tham khảo SM11 ................. 85 Hình 4.41. Các tương tác HMBC, NOESY và COSY chính của hợp chất SM5 ............... 88 Hình 4.42. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM5 ................................................................... 89 Hình 4.43. Ph 1H-NMR của hợp chất SM5 ......................................................................... 90 Hình 4.44. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM5 ........................................................................ 90 Hình 4.45. Ph HSQC của hợp chất SM5 ............................................................................. 90 Hình 4.46. Ph HMBC của hợp chất SM5 ............................................................................ 91 Hình 4.47. Ph 1H-1H COSY của hợp chất SM5 .................................................................. 91 Hình 4.48. Ph NOESY của hợp chất SM5 .......................................................................... 92 Hình 4.49. Cấu trúc h a học của hợp chất SM6 và hợp chất tham khảo SM16 ................. 92 Hình 4.50. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất SM6............................. 94 Hình 4.51. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM6 ................................................................... 96 Hình 4.52. Ph 1H-NMR của hợp chất SM6 ......................................................................... 96 xi Hình 4.53. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM6 ........................................................................ 97 Hình 4.54. Ph DEPT của hợp chất SM6 .............................................................................. 97 Hình 4.55. Ph HSQC của hợp chất SM6 ............................................................................. 98 Hình 4.56. Ph HMBC của hợp chất SM6 ............................................................................ 98 Hình 4.57. Ph NOESY của hợp chất SM6 .......................................................................... 99 Hình 4.58. Cấu trúc h a học của hợp chất SM7 và hợp chất tham khảo ............................. 99 Hình 4.59. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất SM7........................... 101 Hình 4.60. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM7 ................................................................. 102 Hình 4.61. Ph 1H-NMR của hợp chất SM7 ....................................................................... 102 Hình 4.62. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM7 ...................................................................... 103 Hình 4.63. Ph HSQC của hợp chất SM7 ........................................................................... 103 Hình 4.64. Ph HMBC của hợp chất SM7 .......................................................................... 104 Hình 4.65. Ph NOESY của hợp chất SM7 ........................................................................ 104 Hình 4.66. Cấu trúc h a học của hợp chất SM8 và các hợp chất tham khảo .................... 104 Hình 4.67. Các tương tác HMBC chính của hợp chất SM8 ............................................... 106 Hình 4.68. Ph HR-ESI-MS của hợp chất SM8 ................................................................. 107 Hình 4.69. Ph 1H-NMR của hợp chất SM8 ....................................................................... 108 Hình 4.70. Ph 13 C-NMR của hợp chất SM8 ...................................................................... 108 Hình 4.71. Ph HSQC của hợp chất SM8 ........................................................................... 109 Hình 4.72. Ph HMBC của hợp chất SM8 .......................................................................... 110 Hình 4.73. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM9......... 110 Hình 4.74. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM10 ...... 112 Hình 4.75. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM11 ...... 115 Hình 4.76. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM12 ...... 117 Hình 4.77. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM13 ...... 120 Hình 4.78. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM14 ...... 122 Hình 4.79. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM15 ...... 125 Hình 4.80. Cấu trúc hóa học của hợp chất SM16................................................................ 127 Hình 4.81. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM17 ...... 129 xii Hình 4.82. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM18 ...... 132 Hình 4.83. Cấu trúc h a học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM19 ...... 134 Hình 4.84. Cấu trúc h a học của hợp chất SM20................................................................ 136 Hình 4.85. Ph CD thực nghiệm của SM17-SM20 và ph CD theo tính toán của 4 đồng phân lập thể ............................................................................................................................ 139 Hình 4.86. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất SM21 ...... 140 Hình 4.87. Cấu trúc h a học của hợp chất SM22 và chất tham khảo SM21 .................... 142 Hình 4.88. Các tương tác HMBC, NOESY chính và phân tích cấu dạng của vòng cyclohexanol của hợp chất SM22......................................................................................... 144 Hình 4.89. Cấu trúc h a học của hợp chất SM23................................................................ 145 Hình 4.90. Cấu trúc h a học của hợp chất SM24................................................................ 146 Hình 4.91. Các hợp chất phân lập được t loài S.cerebriformis ......................................... 148 Hình 4.92. Mức độ apoptosis thể hiện bằng ảnh huỳnh quang của nhân tế bào LU-1 nhuộm bằng Hoechst 33342 (độ ph ng đại 200 lần) ....................................................................... 152 Hình 4.93. Khả năng kích thích caspase 3 của SM8 và SM16 .......................................... 153 xiii ĐẶT VẤN ĐỀ T đầu nh ng năm 90 của thế k trước, các nhà khoa học biển đ c c ng một mối quan tâm đ là khám phá nguồn tài nguyên sinh vật vô c ng phong phú dưới đáy đại dương. Tuy nhiên các nghiên cứu tại thời điểm đ chưa đầy đủ và thiếu tính hệ thống. T đ dẫn tới hàng loạt tranh c i gi a các nhà khoa học, bởi một số loài được xác định bằng nhiều tên khoa học khác nhau, thậm chí hàng chục lần, khiến con số thống kê không chính xác. Nh ng câu hỏi về sự đa dạng loài, nơi các sinh vật biển sinh sống và các mối quan hệ phức tạp gi a các loài sinh vật biển đ đưa đến một yêu cầu mới, cấp thiết về một nghiên cứu một các-h c hệ thống toàn cầu. Đến đầu năm 2000, một chương trình nghiên cứu thống kê khoa học c quy mô toàn cầu đ được thực hiện. Chương trình thống kê sinh vật biển Census of Marine Life đ được tiến hành trong vòng 10 năm, c quy mô lớn tại khắp 5 châu lục với sự tham gia của 2700 nhà khoa học đến t hơn 80 quốc gia trên thế giới. Theo số liệu mới được công bố của chương trình này vào ngày 4-10-2010, c khoảng t 230.000 – 250.000 loài sinh vật sinh sống ở dưới đại dương tuy nhiên c đến 80% số loài sinh vật biển vẫn chưa được phát hiện. Các nhà khoa học đ làm việc trong dự án này tin rằng phần lớn các loài sống ở đại dương vẫn đầy bí ẩn. Hơn 70% số loài cá đ được ghi nhận, nhưng với hầu hết các nh m sinh vật biển khác, c thể chưa đến 1/3 số loài đ được biết. Hàng năm, c đến 1650 loài được phát hiện trong đ các loài thân mềm (379 loài/năm) và có vỏ (452 loài/năm) c t lệ phát hiện nhiều nhất, tiếp đến là bọt biển (59/năm) và da gai (30 loài/năm). Việt Nam là quốc gia c ba mặt tiếp giáp biển với bờ biển dài 3.260 km chạy dọc t Bắc vào Nam, hàng nghìn hòn đảo ven biển. Thêm vào đ , Việt Nam c bốn mùa khí hậu rõ rệt. Các điều kiện này đ tạo ra nguồn tài nguyên 1 sinh vật biển phong phú với khoảng 12.000 loài bao gồm 2.000 loài cá, 6.000 loài động vật đáy, 635 loài rong biển và hàng ngàn loài động thực vật ph du... Tuy nhiên, hiện nay trong phát triển kinh tế biển Việt Nam chủ yếu chỉ tiếp cận tới nh ng loài sinh vật biển c giá trị thực phẩm, mà chưa chú ý nhiều đến các loài cung cấp các chất c hoạt tính sinh học cao để phát triển thuốc. Trong nh ng năm gần đây, với sự h trợ của các k thuật tiên tiến, nhiều hợp chất c hoạt tính sinh học t các loài hải miên, san hô mềm đ được phân lập, xác định cấu trúc, đánh giá hoạt tính sinh học. Nhiều hợp chất trong số đ đ được nghiên cứu phát hiện và đang được sử dụng làm thuốc điều trị bệnh ung thư như: cytarabine (ara-C), variabilin và agosterol A, ... Nghiên cứu, khảo sát thành phần h a học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển n i chung, các loài hải miên n i riêng đ và đang là vấn đề thời sự được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Các nghiên cứu về thành phần h a học và hoạt tính sinh học trên thế giới đ chỉ ra các loài hải miên c cấu trúc h a học đa dạng và phong phú, nhiều hợp chất đ được phát hiện c hoạt tính sinh học lí thú. Chính vì vậy, chúng tôi đ lựa chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài hải miên Smenospongia cerebriformis Duchassaing & Michelotti, 1864”. Đề tài bao gồm các nội dung sau: - Phân lập các hợp chất t loài hải miên Smenospongia cerebriformis; - Xác định cấu trúc h a học của các hợp chất phân lập được t loài hải miên Smenospongia cerebriformis; - Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HẢI MIÊN 1.1.1. Giới thiệu chung về hải miên Hải miên là các loài động vật thuộc ngành Porifera (động vật ăn lọc – pore bearer). Cơ thể của chúng bao gồm một lớp trung mô dạng thạch được kẹp gi a hai màng tế bào mỏng. Trong khi tất cả các loài động vật khác c các tế bào chưa biệt h a c thể chuyển thành các dạng tế bào chuyên biệt khác nhau thì duy nhất các loài hải miên c một số tế bào đ được biệt h a mà vẫn c thể chuyển thành các dạng tế bào khác. Thông thường chúng di chuyển gi a các màng tế bào cơ bản và lớp trung mô. Hải miên không c hệ thần kinh, hệ tiêu h a hoặc hệ tuần hoàn. Thay vào đ , hầu hết chúng dựa vào việc duy trì một dòng nước n định chảy qua cơ thể để thu nhận thức ăn và oxy cũng như thải các chất cặn b , hình dáng cơ thể của chúng thích nghi tối đa với việc duy trì hiệu quả của dòng nước chảy qua cơ thể. Tuy c một số loài hải miên nước ngọt, còn lại đa phần hải miên là các loài động vật biển, phân bố rộng khắp t các v ng triều cho tới tận độ sâu hơn 8800 m. Trong khi hầu hết trong số khoảng t 5.000 đến 10.000 loài hải miên được biết đến sống dựa vào nguồn thức ăn là các vi khuẩn và các mảnh vụn trong nước, một số vi khuẩn chủ t ng hợp quang năng thường sản xuất thức ăn và oxy nhiều hơn số chúng tiêu thụ. Một số loài hải miên sống trong các môi trường nghèo dinh dưỡng và trở thành động vật ăn thịt, sống dựa vào các loài giáp xác nhỏ. Hải miên được chia thành ba lớp chính, dựa trên thành phần cấu tạo bộ khung cơ thể của chúng: - Lớp Hexactinellida (hải miên đá – glass sponge) có các nhánh silicat, nhánh lớn nhất c sáu cánh c thể tách rời hoặc đính với nhau. Thành phần cơ thể 3 chính của chúng là hợp bào (syncytia) trong đ phần lớn các tế bào c chung một màng ngoài đơn. - Lớp Calcarea c bộ khung cơ thể tạo bởi calci, một dạng calci carbonate, c thể tạo thành các nhánh riêng biệt hoặc thành mạng lưới lớn. Tất cả các tế bào c một nhân và màng. - Lớp Demospongiae: Hầu hết c các nhánh silicat hoặc sợi xốp hoặc h n hợp cả hai trong các mô mềm của chúng. Tuy nhiên, một số loài c chứa cơ quan ngoài đặc tạo nên bởi aragnoit, một dạng khoáng chất khác của calci carbonate khác. Tất cả các tế bào c một nhân và màng. Ngoài ra, còn c lớp Archeocyatha chỉ được biết đến qua các h a thạch t thời Cambri 1.1.2. Giới thiệu chung về giống Smenospongia Hải miên giống Smenospongia thuộc họ Thorectidae, bộ Dictyoceratida, phân lớp Keratosa, lớp Demospongiae. Cho đến nay, các nhà sinh thái và hải dương học đ xác định được giống Smenospongia bao gồm 11 loài: S. aurea, S. cerebriformis, S. conulosa, S. coreana, S. dysodes, S. echina, S. musicalis, S. nuda, S. ramose, S. maynadii và S. lamellate [5]. Qua t ng quan tài liệu nghiên cứu đ được công bố cho thấy giống Smenospongia chứa chủ yếu các hợp chất thuộc khung sesquiterpene, sesterterpene và indole alkaloid. Các hợp chất trao đ i thứ cấp này gi vai trò quan trọng cho sự sống của hải miên với các chức năng bảo vệ, cạnh tranh, sinh sản và nhiều chức năng pheromone. Dưới đây là hình ảnh một số loài hải miên thuộc giống Smenospongia: 4 S. aurea S. echina S. conulosa S. cerebriformis Hình 1.1. Hình ảnh một số loài hải miên thuộc giống Smenospongia 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ GIỐNG SMENOSPONGIA TRÊN THẾ GIỚI 1.2.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài hải miên thuộc giống Smenospongia Qua t ng quan tài liệu cho thấy có 4 loài thuộc giống Smenospongia và một số Smenospongia sp (chưa xác định được chính xác tên khoa học) đ được nghiên cứu về thành phần hóa học, bao gồm: S. aurea, S. cerebriformis, S. conulosa và S. echina. Thành phần h a học chính của giống Smenospongia 5