Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loại khố sâm mềm (Brucea mollis Wall. Ex Kurz) và Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guilaum) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC MAI HÙNG THANH TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) VÀ CƠM RƯỢU TRÁI HẸP (GLYCOSMIS STENOCARPA (DRAKE) GUILLAUM) Ở VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC MAI HÙNG THANH TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) VÀ CƠM RƯỢU TRÁI HẸP (GLYCOSMIS STENOCARPA (DRAKE) GUILLAUM) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số : 62.44.27.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. NGUYỄN MẠNH CƯỜNG 2. GS.TS. YOUNG HO KIM HÀ NỘI - 2012 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Mai Hùng Thanh Tùng LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường và GS.TS. Young Ho Kim là những người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học và Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, đặc biệt PGS.TS. Phạm Quốc Long, Viện trưởng Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, người đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Cao đẳng công nghiệp Tuy Hòa đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Thảo và các anh chị Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới tập thể cán bộ Phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Tác giả luận án Mai Hùng Thanh Tùng MỤC LỤC Trang Danh mục các hình trong luận án ............................................................................. DM1 Danh mục các bảng trong luận án............................................................................. DM2 Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt..................................................................... DM3 MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu) ................................................................... 3 1.1.1. Sơ lược về chi Brucea ................................................................................ 3 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Brucea........................................................... 3 1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................... 3 1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................................. 3 1.1.2.2.1. Lớp chất quassinoit...................................................................... 4 1.1.2.2.2. Lớp chất ancaloit ......................................................................... 4 1.1.2.2.3. Lớp chất tritecpenoit và steroit .................................................... 5 1.1.2.2.4. Lớp chất flavonoit ....................................................................... 5 1.1.2.2.5. Lớp chất axít béo và loại khác ..................................................... 5 1.1.3. Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Brucea ..................................... 12 1.1.3.1. Hoạt tính chống sốt rét ............................................................................. 12 1.1.3.2. Hoạt tính kháng u và ung thư ................................................................... 13 1.1.3.3. Hoạt tính kháng virus TMV (Tobacco Mosaic Virus)............................. 13 1.1.3.4. Hoạt tính chống tiểu đường...................................................................... 13 1.1.3.5. Hoạt tính kháng ký sinh trùng mũi khoan................................................ 14 1.1.3.6. Hoạt tính kháng amíp ............................................................................... 14 1.1.3.7. Các hoạt tính khác.................................................................................... 14 1.1.4. Sơ lược lớp chất quassinoit ...................................................................... 14 1.1.4.1. Giới thiệu ................................................................................................. 14 1.1.4.2. Phân lập và xác định cấu trúc................................................................... 15 1.1.4.3. Sinh tổng hợp các quassinoit ................................................................... 16 1.1.4.4. Bán tổng hợp các quassinoit .................................................................... 17 1.1.4.5. Tổng hợp toàn phần các quassinoit.......................................................... 18 1.1.4.6. Hoạt tính sinh học của lớp chất quassinoit............................................... 19 1.1.5. Loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz).................................. 20 1.2. Chi Glycosmis................................................................................................. 21 1.2.1. Đặc điểm hình thái và phân bố ................................................................. 21 1.2.2. Sử dụng trong dân gian ............................................................................ 22 1.2.3. Thành phần hóa học chi Glycosmis .......................................................... 23 1.2.3.1. Tecpenoit.................................................................................................. 23 1.2.3.2. Flavonoit .................................................................................................. 24 1.2.3.3. Cumarin.................................................................................................... 25 1.2.3.4. Ancaloit .................................................................................................... 25 1.2.3.5. Các ancaloit dạng amít chứa lưu huỳnh ................................................... 25 1.2.3.6. Glycosid ................................................................................................... 26 1.2.4. Hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Glycosmis ................................ 27 1.2.5. Loài Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ......... 27 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 30 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ........................................................... 30 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu ............. 30 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết............................... 30 2.1.3. Các phương phương xác định cấu trúc hóa học các hợp chất ................... 30 2.1.3.1. Xác định điểm chảy và góc quay cực ...................................................... 31 2.1.3.2. Phổ khối lượng (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) ...... 31 2.1.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .................................................................... 31 2.1.4. Phương pháp thử hoạt tính gây độc (ức chế) tế bào ung thư in vitro ......... 31 2.1.4.1. Vật liệu ..................................................................................................... 31 2.1.4.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro ...................................................... 31 2.1.4.3. Phép thử sinh học xác định hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxic assay)... 31 2.2. Xử lí mẫu thực vật và chiết tách...................................................................... 32 2.3. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được ................. 40 2.4. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập ......................................... 46 2.4.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư KB........... 47 2.4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LU-1 ........ 47 2.4.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư LNCaP..... 48 2.4.4. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HL-60 ...... 48 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 50 3.1. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm ......... 50 3.2. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập ........................................................ 50 3.2.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm ........................... 50 3.2.2. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ thân và rễ cây Khổ sâm mềm .............. 74 3.2.3. Xác định tên khoa học cây Brucea mollis .............................................. 108 3.2.4. Cấu trúc các hợp chất phân lập từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp .................. 109 KẾT LUẬN................................................................................................................. 137 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC DM-1 DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN ÁN Trang Hình 1.1 Các bộ khung cơ bản của lớp chất quassinoit............................ Hình 1.2 Quassin 117 và neoquassin 118 là hai quassinoit đầu tiên được 15 phân lập từ cây Quassia amara.................................................. 16 Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp các quassinoit................................... 17 Hình 1.4 Bán tổng hợp bruceantin từ bruceoside A.................................. 18 Hình 1.5 Tổng hợp toàn phần bruceantin.................................................. 19 Hình 1.6 Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz)................... 21 Hình 1.7 Cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) 27 Hình 2.1 Sơ đồ phân đoạn các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm............ 33 Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các chất từ lá cây Khổ sâm mềm....................... 36 Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các chất từ thân và rễ cây Khổ sâm mềm.......... 38 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các chất từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp................ 39 Hình 2.5 Tác dụng ức chế tế bào ung thư KB của hợp chất BM.19 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml……………………………………... Hình 2.6 Tác dụng ức chế tế bào ung thư LNCaP của hợp chất BM.17 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml………………………………… Hình 2.7 47 48 Tác dụng ức chế tế bào ung thư HL-60 của hợp chất BM.19 ở các nồng độ 20; 4; 0,8 mg/ml…………………………………. 49 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.01....................................... 51 Hình 3.2 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.02....................................... 52 Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.03....................................... 52 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.04....................................... 52 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.04............................................ 54 Hình 3.6 Phổ DEPT của hợp chất BM.04................................................. 54 Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.05....................................... 56 DM-1 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.05............................................ 56 Hình 3.9 Phổ DEPT của hợp chất BM.05................................................. 57 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.06....................................... 57 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.07....................................... 58 Hình 3.12 Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất BM.08.. 60 Hình 3.13 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.08............................................ 60 Hình 3.14 Phổ DEPT của hợp chất BM.08................................................. 61 Hình 3.15 Phổ HSQC của hợp chất BM.08................................................ 61 Hình 3.16 Phổ HMBC của hợp chất BM.08............................................... 61 Hình 3.17 Phổ COSY của hợp chất BM.08................................................ 62 Hình 3.18 Phổ NOESY của hợp chất BM.08............................................. 62 Hình 3.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.09....................................... 63 1 Hình 3.20 Phổ H-NMR của hợp chất BM.09............................................ 63 Hình 3.21 Phổ DEPT của hợp chất BM.09................................................. 63 Hình 3.22 Các tương tác trong phổ HMBC, COSY và NOESY của hợp chất BM.10................................................................................. 1 66 Hình 3.23 Phổ H-NMR của hợp chất BM.10............................................ 66 Hình 3.24 Phổ DEPT của hợp chất BM.10................................................. 67 Hình 3.25 Phổ HSQC của hợp chất BM.10................................................ 67 Hình 3.26 Phổ HMBC của hợp chất BM.10............................................... 67 Hình 3.27 Phổ COSY của hợp chất BM.10................................................ 68 Hình 3.28 Phổ NOESY của hợp chất BM.10............................................. 68 Hình 3.29 Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất BM.10........ 68 Hình 3.30 Các tương tác HMBC của hợp chất BM.11............................... 69 Hình 3.31 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.11............................................ 69 Hình 3.32 Phổ DEPT của hợp chất BM.11................................................. 70 Hình 3.33 Các tương tác HMBC của hợp chất BM.12............................... 70 1 Hình 3.34 Phổ H-NMR của hợp chất BM.12............................................ 71 Hình 3.35 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM.12........................................... 71 DM-1 Hình 3.36 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.13....................................... 75 Hình 3.37 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.14....................................... 75 Hình 3.38 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.14............................................ 76 Hình 3.39 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM.14........................................... 76 Hình 3.40 Các tương tác trong phổ HMBC, COSY và NOESY của hợp chất BM.15................................................................................. 77 Hình 3.41 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.15............................................ 80 Hình 3.42 Phổ DEPT của hợp chất BM.15................................................. 80 Hình 3.43 Phổ HSQC của hợp chất BM.15................................................ 80 Hình 3.44 Phổ HMBC của hợp chất BM.15............................................... 81 Hình 3.45 Phổ COSY của hợp chất BM.15................................................ 81 Hình 3.46 Phổ NOESY của hợp chất BM.15............................................. 81 Hình 3.47 Các tương tác NOESY của hợp chất BM.16............................. 82 Hình 3.48 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.16............................................ 83 Hình 3.49 Phổ DEPT của hợp chất BM.16................................................. 84 Hình 3.50 Phổ HSQC của hợp chất BM.16................................................ 84 Hình 3.51 Phổ HMBC của hợp chất BM.16............................................... 84 Hình 3.52 Phổ COSY của hợp chất BM.16................................................ 85 Hình 3.53 Phổ NOESY của hợp chất BM.16............................................. 85 Hình 3.54 Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất BM.17............... 86 Hình 3.55 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.17............................................ 87 Hình 3.56 Phổ DEPT của hợp chất BM.17................................................. 88 Hình 3.57 Phổ HSQC của hợp chất BM.17................................................ 88 Hình 3.58 Phổ HMBC của hợp chất BM.17............................................... 88 Hình 3.59 Phổ COSY của hợp chất BM.17................................................ 89 Hình 3.60 Phổ NOESY của hợp chất BM.17............................................. 89 Hình 3.61 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.18....................................... 90 1 Hình 3.62 Phổ H-NMR của hợp chất BM.18............................................ 91 Hình 3.63 Phổ DEPT của hợp chất BM.18................................................. 91 DM-1 Hình 3.64 Các tương tác HMBC chính của hợp chất BM.19..................... 1 92 Hình 3.65 Phổ H-NMR của hợp chất BM.19............................................ 94 Hình 3.66 Phổ DEPT của hợp chất BM.19................................................. 94 Hình 3.67 Phổ HMBC của hợp chất BM.19............................................... 94 Hình 3.68 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC của hợp chất BM.20..... 95 Hình 3.69 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.20............................................ 96 Hình 3.70 Phổ 13C-NMR của hợp chất BM.20........................................... 96 Hình 3.71 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.21....................................... 97 1 Hình 3.72 Phổ H-NMR của hợp chất BM.21............................................ 98 Hình 3.73 Phổ DEPT của hợp chất BM.21................................................. 98 Hình 3.74 Các tương tác HMBC, COSY, NOESY của hợp chất BM.22... 99 Hình 3.75 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.22............................................ 101 Hình 3.76 Phổ DEPT của hợp chất BM.22................................................. 101 Hình 3.77 Phổ HSQC của hợp chất BM.22................................................ 102 Hình 3.78 Phổ HMBC của hợp chất BM.22............................................... 102 Hình 3.79 Phổ COSY của hợp chất BM.22................................................ 102 Hình 3.80 Phổ NOESY của hợp chất BM.22.............................................. 103 Hình 3.81 Phổ ESI-MS của hợp chất BM.22.............................................. 103 Hình 3.82 Cấu trúc hóa học của hợp chất BM.23....................................... 104 Hình 3.83 Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.23............................................ 104 Hình 3.84 Phổ DEPT của hợp chất BM.23................................................. 105 Hình 3.85 Phổ HSQC của hợp chất BM.23................................................ 105 Hình 3.86 Phổ HMBC của hợp chất BM.23............................................... 105 Hình 3.87 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC của hợp chất GP.24 112 Hình 3.88 Phổ IR của hợp chất GP.24........................................................ 112 Hình 3.89 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.24............................................. 112 Hình 3.90 Phổ DEPT của hợp chất GP.24.................................................. 113 Hình 3.91 Cấu trúc hóa học của hợp chất GP.25........................................ 114 Hình 3.92 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.25............................................. 115 DM-1 Hình 3.93 Phổ DEPT của hợp chất GP.25.................................................. 115 Hình 3.94 Phổ HSQC của hợp chất GP.25................................................. 115 Hình 3.95 Phổ HMBC của hợp chất GP.25................................................ 116 Hình 3.96 Phổ COSY của hợp chất GP.25................................................. 116 Hình 3.97 Cấu trúc hóa học của hợp chất GP.26........................................ 117 Hình 3.98 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.26............................................. 118 Hình 3.99 Phổ DEPT của hợp chất GP.26.................................................. 119 Hình 3.100 Phổ HSQC của hợp chất GP.26................................................. 119 Hình 3.101 Phổ HMBC của hợp chất GP.26................................................ 120 Hình 3.102 Phổ COSY của hợp chất GP.26................................................. 120 Hình 3.103 Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GP.26........................................ 121 Hình 3.104 Sơ đồ phân mảnh của hợp chất GP.27 trong phổ ESI-MS......... 123 Hình 3.105 Các tương tác HMBC, COSY và NOESY của hợp chất GP.27 123 Hình 3.106 Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.27............................................. 124 Hình 3.107 Phổ DEPT của hợp chất GP.27.................................................. 124 Hình 3.108 Phổ HSQC của hợp chất GP.27................................................. 124 Hình 3.109 Phổ HMBC của hợp chất GP.27................................................ 125 Hình 3.110 Phổ COSY của hợp chất GP.27................................................. 125 Hình 3.111 Phổ NOESY của hợp chất GP.27............................................... 126 Hình 3.112 Phổ ESI-MS của hợp chất GP.27............................................... 126 DM-2 DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN ÁN Trang Bảng 2.1 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất được phân lập từ cây Khổ sâm mềm trên bốn dòng ung thư......................................... Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư KB của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22...... Bảng 2.3 48 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư HL-60 của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22….. Bảng 3.1 47 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư LNCaP của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22....... Bảng 2.5 47 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư LU-1 của các hợp chất BM.06, BM.07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.22............... Bảng 2.4 46 48 Kết quả thử độc tính tế bào các cặn chiết từ lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall.ex Kurz)............................................ 50 Bảng 3.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.04....................................... 53 Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất BM.05 và chất tham khảo 55 Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.06, BM.07 và chất tham khảo 58 Bảng 3.5 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.10....................................... 64 Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.10 và chất tham khảo......... 65 Bảng 3.7 Tổng hợp các hợp chất phân lập từ lá cây Khổ sâm mềm........... 72 1 Bảng 3.8 Số liệu phổ H-NMR của hợp chất BM.13 và chất tham khảo 74 Bảng 3.9 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15....................................... 78 Bảng 3.10 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15 và chất tham khảo......... 79 Bảng 3.11 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.16 và chất tham khảo......... 83 Bảng 3.12 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.17 và chất tham khảo......... 86 Bảng 3.13 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.18 và chất tham khảo......... 90 DM-2 Bảng 3.14 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.19 và chất tham khảo......... 93 Bảng 3.15 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.20....................................... 95 Bảng 3.16 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.21 và chất tham khảo......... 97 Bảng 3.17 Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.22....................................... 100 Bảng 3.18 Tổng hợp các hợp chất phân lập từ thân và rễ cây Khổ sâm mềm 106 Bảng 3.19 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.24........................................ 111 Bảng 3.20 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.25........................................ 113 Bảng 3.21 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.25 và chất tham khảo.......... 114 Bảng 3.22 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.26 và chất tham khảo.......... 118 Bảng 3.23 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.26........................................ 118 Bảng 3.24 Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.27........................................ 122 Bảng 3.25 Cấu trúc các hợp chất phân lập từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp...... 127 Bảng 3.26 Bảng tổng kết các hợp chất được phân lập từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum)................................. 129 DM-3 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR 13 C- NMR DEPT Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton Carbon -13 Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy cacbon 13 Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ HMBC Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Phổ HSQC Coherence NOESY Nuclear Overhauser Effect Phổ NOESY Spectroscopy 1 H-1H-COSY 1 H -1H - Correlation Phổ tương tác proton Spectroscopy ESI-MS HR-ESI-MS Electron Spray Ionization-Mass Phổ khối ion hóa bằng phun mù Spectroscopy điện tử High Resolution Electron Phổ khối phân giải cao ion hóa Spray Ionization Mass bằng phun mù điện tử Spectroscopy IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại s Singlet d Doublet t Triplet q Quartet dd doublet doublet dt doublet triplet DM-3 b Broad m Multiplet J (Hz) Hằng số tương tác tính bằng Hz δ (ppm) (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng ppm (phần triệu) CC Column Chromatography Sắc ký cột thường TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng HS (%) Hiệu suất so với mẫu khô CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô Hep-G2 Human hepatocellular Ung thư gan người carcinoma MCF-7 Adenocarcinoma Ung thư vú LU-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi người LNCaP Human prostate Ung thư tiền liệt tuyến adenocarcinoma HL-60 Human promyelocytic Ung thư máu cấp tính leukemia IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% Mp Melting point Điểm chảy MeOH Metanol DMSO Dimethylsulfoxide Py Pyridin EtOAc Etyl axetat TMS Tetrametyl Silan BuOH Butanol 1 MỞ ĐẦU Cho đến ngày nay dân số thế giới đã đạt được bảy tỷ người, một con số rất lớn và nhu cầu về khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo. Trong khi đó thì tình trạng sử dụng thuốc bừa bãi không theo hướng dẫn của bác sĩ dẫn đến kháng thuốc, đặc biệt là ở những nước đang phát triển đã vô tình tạo một áp lực lớn đối với ngành y tế thế giới phải cố gắng tìm ra những loại thuốc mới. Thiên nhiên là một kho thuốc khổng lồ, mà cho đến nay thế giới vẫn chưa khám phá hết. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có một hệ động thực vật đa dạng phong phú. Đây chính là tiềm năng to lớn mà chúng ta cần phải tận dụng. Hiện nay, tình trạng đốt phá rừng ngày càng gia tăng và không thể kiểm soát, đồng thời khí hậu thay đổi theo chiều hướng khắc nghiệt hơn, đã và đang làm cho một số lượng lớn các loài suy thóai dần. Nếu chúng ta không nhanh chóng nghiên cứu và bảo vệ nguồn gien này thì đó sẽ là một mất mát to lớn của loài người. Ngày nay, hầu hết các bài thuốc gia truyền đều sử dụng theo kinh nghiệm, phần lớn chưa được chứng minh theo y học hiện đại. Thông thường người ta sử dụng ở dạng sắc lấy nước uống hoặc ở dạng cao, viên. Đó là một hỗn hợp bao gồm nhiều thành phần khác nhau, có những thành phần có khả năng làm tăng hoặc giảm hoạt tính hoặc độc tính của thuốc. Vì vậy, chúng ta cần phải nghiên cứu xác định chính xác tác dụng của từng thành phần hoặc các hợp phần, từ đó tạo cơ sở cho sử dụng tốt hơn cây thuốc và bài thuốc dân tộc. Trong y học dân gian cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) được sử dụng để trị sốt rét, đau bụng, u nhọt, amíp, ghẻ lở...[1]. Trong chương trình hợp tác giữa Việt Nam và Hàn Quốc, nhằm phát hiện các loài thực vật có kháng ung thư, các tác giả đã phát hiện ra dịch chiết MeOH từ lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis) có hoạt tính rất mạnh, ức chế tới 96% tế bào ung thư phổi người A549 [2]. Cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) thu hái tại Việt Nam đã được nghiên cứu từ năm 2004. Từ cây Cơm rượu trái hẹp đã phân lập được một số ancaloit như murrayanin, murrayafoline A. Trong đó, murrayafoline A 2 có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư đại tràng thông qua con đường Wnt/b-catenin [3]. Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hai cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: " Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ở Việt Nam'' với nội dung nghiên cứu như sau: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của hai loài trên 2. Đánh giá hoạt tính kháng ung thư của một số hợp chất phân lập được 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về chi Brucea (Sầu đâu) 1.1.1. Sơ lược về chi Brucea Chi Brucea (Sầu đâu) là một chi thuộc họ Simaroubaceae (Thanh Thất) với sáu loài chính (Brucea javanica, Brucea mollis var. tonkinensis, Brucea guineensis, Brucea sumatrana, Brucea antidysenterica và Brucea amarissima) được phân bố ở các vùng nhiệt đới phía đông bán cầu [4], [5]. Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, chi Brucea có ba loài gồm Brucea javanica, Brucea mollis và Brucea mollis var. tonkinensis [5].Trong đó, có hai loài được sử dụng trong dân gian để làm thuốc là Sầu đâu cứt chuột (Brucea javanica) và Khổ sâm mềm (Brucea mollis) trị sốt rét, đau bụng, u nhọt... Hai loài trên thường gặp ở vùng Lào Cai, Kom Tum, Lâm Đồng [1]. Ở Trung Quốc, hai loài Brucea mollis và Brucea javanica cũng được sử dụng như là thuốc thảo dược truyền thống bởi vì hoạt tính chống ung thư và chống sốt rét của chúng [6]. Gần đây, các cây thuộc chi Brucea đã thu hút nhiều sự quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học, bởi vì phổ hoạt tính sinh học đa dạng của chúng. Các nghiên cứu hóa học về chi Brucea đã phát hiện ra nhiều hợp chất thuộc các lớp chất chính là quassinoit, ancaloit, tritecpenoit và flavonoit. 1.1.2. Thành phần hóa học của chi Brucea 1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở trong nước, cho đến nay chỉ có ba công bố các nghiên cứu về hai loài trong chi Brucea là B. javanica và B. sumatrana. Năm 1979, tác giả Ngô Văn Thu nghiên cứu về hoạt tính chống sốt rét của các dịch chiết từ cây B. sumatrana [7]. Năm 1995, GS. Trần Văn Sung và cộng sự đã phân lập được một glycoside mới từ lá cây B. javanica [8]. Gần đây, 2009, GS. Douglas Kinghorn, Đại học Ohio, Mỹ, đã phân lập được năm tritecpenoit, hai quassinoit và một flavonolignan từ lá cây B. javanica thu hái tại Việt Nam và đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của chúng [9]. 1.1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 4 Cho đến nay, đã có năm loài trong sáu loài chính của chi Brucea được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới gồm: B. javanica, B. mollis var. tonkinensis, B. sumatrana, B. antidysenterica và B. amarissima. Kể từ năm 1900, đã có hơn 100 hợp chất hóa học được tách ra từ chi Brucea, bao gồm các lớp chất: quassinoit, ancaloit, tritecpenoit, flavonoit và các axít béo [674]. Trong đó thì lớp chất quassinoit là lớp chất chính, chiếm hơn 50% các hợp chất được tách ra từ chi này. Cấu trúc các hợp chất được chỉ ra ở phần sau; tên của hợp chất và nguồn gốc cây tương ứng được liệt kê ở Bảng 1.1 (trang 9). 1.1.2.2.1. Lớp chất quassinoit Các quassinoit là lớp chất chính của chi Brucea và chỉ được phát hiện ở các loài thuộc họ Simaroubaceae. Cho đến nay, có khoảng 75 quassinoit (1-75), được phân lập từ chi Brucea [10-45] và tập trung nhiều nhất ở loài B. javanica. Các quassinoit chủ yếu được tách từ quả và hạt của cây, một số quassinoit có hoạt tính sinh học lý thú. Từ loài B. javanica phân lập được các quassinoit: bruceantinol A 12, bruceene 16, bruceine H-J (24-26), bruceoside A-G (27-33), dehydrobruceine A 37 và B 38, javanicolide A-D (41-44), javanicoside A-H (45-52), yadanzigan 57, yadanziolide B 58, C 59, và S 60, và yadanzioside A-O (61-75). Trong số chúng thì các hợp chất yadanzigan 57 và yadanzioside B 62, C 63, E 65, I 69 và K 71, cũng được phát hiện ở loài B. amarissima, và hợp chất yadanzioside M 73 cũng được tìm thấy ở loài B. antidysenterica. Các quassinoit bruceine A-G (17-23) và javanicoside I-L (53-56) được phân lập từ loài B. amarissima. Trong số chúng thì các hợp chất bruceine A-G (17-23) cũng được tìm thấy ở loài B. javanica. Đặc biêt hợp chất brusatol 34 chỉ được phát hiện ở hai loài là B. sumatrana và B. javanica. Một số quassinoit khung C-20 như: bruceantarin 9, bruceantin 10, bruceantinol 11, bruceantinoside A 13 và B 14 được tách từ loài B. javanica. Các quassinoit còn lại được phân lập từ loài B. antidysenterica 1.1.2.2.2. Lớp chất ancaloit Cho đến nay có 25 ancaloit (76-100) được phân lập từ chi Brucea [6], [46-53],