BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÓA HỌC
________________
________________
TRƯƠNG THỊ THU HIỀN
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY DẤU DẦU LÁ NHẴN
(Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.)
Chuyên ngành : Hóa học hữu cơ
Mã số: 62.44.27.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI - 2014
Công trình được hoàn thành tại:
Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam.
Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam.
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Phan Văn Kiệm
2. GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến
Phản biện 1: GS.TSKH Trần Văn Sung
Phản biện 2: GS. TS. Đinh Thị Ngọ
Phản biện 3: PGS. TS. Lê Mai Hương
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại:
Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Vào hồi
giờ
ngày
tháng 8 năm 2014
Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt nam
Thư viện Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam
Thư viện Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
nam.
1
I.GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý
giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Nhiều hợp chất
thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng
với mục đích chữa bệnh.
Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa
nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Việc sử dụng nguồn tài
nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con người đã
có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan
trọng. Đến nay, đã có hàng trăm cây thuốc đã được chứng minh về giá
trị chữa bệnh của chúng.
Cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) là
một cây thuốc thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) thường được sử dụng trị
một số bệnh như: trị tổn thương do ngã, gãy xương, thấp khớp, viêm
thận, phù thũng, dùng ngoài chữa chấn thương, ngứa, eczema... Nhằm
mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của cây dấu dầu lá nhẵn, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp
theo để tạo ra các sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp phần
giải thích được tác dụng chữa bệnh của vị thuốc này, chúng tôi lựa chọn
đề tài: ‘‘Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây
dấu dầu lá nhẵn Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.”.
2. Đối tượng nghiên cứu của luận án
Đối tượng nghiên cứu của luận án gồm: mẫu lá và mẫu vỏ thân
của cây dấu dầu lá nhẵn (Tetradium glabrifolium (Benth.) Hartl.) thuộc
chi Tetradium, họ Cam quýt (Rutaceae).
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Lần đầu tiên nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh
học mẫu lá và vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn thuộc chi Tetradium mọc ở
2
Việt nam. Từ lá và vỏ thân cây dấu dầu lá nhẵn, bằng các phương pháp
sắc ký kết hợp đã phân lập được hai sáu hợp chất, trong đó có một hợp
chất mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên, là tetraglabrifolioside
và mười năm hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Tetradium
3.2. Đã đánh giá hoạt tính kháng lao của các hợp chất được phân lập từ
cây dấu dầu lá nhẵn. Kết quả cho thấy 3 amide là N-isobutyl-2E,4Etetradecadienamide (TG18), N-isobutyl-2E,4E-decadienamide(TG19),
N-isobutyl-2E,4E,8E-tetradecatrienamide (TG20) thể hiện hoạt tính
kháng lao, trong đó: hợp chất TG18 ức chế chủng lao thử nghiệm
M.bovis với giá trị MIC 22 µg/mL.
3.3. Lần đầu tiên phân lập được epimedoside C (TG12) với khối lượng
lớn từ lá cây dấu dầu lá nhẵn (21,54g) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào
đối với các dòng tế bào: ung thư đại tràng (SW480), ung thư phổi (LU-1),
ung thư tiền liệt tuyến (LNCaP) với giá trị IC50 lần lượt là: 10,47; 7,73;
6,69 µg/mL và thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt (58,74 mL) .
4. Bố cục của luận án
Luận án gồm: 155 trang với 37 bảng số liệu, 94 hình, 144 tài liệu
tham khảo và 17 phụ lục. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang);
Chương 1: Tổng quan tài liệu (27 trang); Chương 2: Đối tượng và
phương pháp nghiên cứu (9 trang); Chương 3: Thực nghiệm và kết quả
(11 trang); Chương 4: Kết quả và Thảo luận (87 trang); Kết luận (1
trang); Kiến nghị (1 trang); Các công trình đã công bố (1 trang); Tài liệu
tham khảo (16 trang); Phụ lục (52trang).
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN
MỞ ĐẦU
Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Phần tổng quan tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về
các vấn đề:
-
Đặc điểm thực vật, phân bố và ứng dụng của chi Tetradium;
-
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Tetradium;
-
Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ chi Tetradium;
-
Đặc điểm thực vật; phân bố; ứng dụng và các nghiên cứu về thành
phần hóa học; hoạt tính sinh học của cây dấu dầu lá nhẵn.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật
Mẫu vỏ thân và mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn được thu hái vào
tháng 6 năm 2011 tại Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Mẫu tiêu bản
được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển và Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp phân lập các chất
Các phương pháp và thiết bị nghiên cứu chủ yếu gồm: Sắc ký lớp
mỏng (TLC); Sắc ký lớp mỏng điều chế; Sắc ký cột (CC).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học
Phương pháp xác định cấu trúc hoá học được kết hợp giữa xác
định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại gồm: Điểm
nóng chảy (MP); Độ quay cực [α]D; Phổ khối lượng phun mù điện tử
(ESI-MS) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS); Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1DNMR): 1H-NMR, 13C-NMR và hai chiều (2D-NMR): HSQC, HMBC.
2.4. Phương pháp xác định hoạt tính sinh học
Hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên 6 dòng tế bào: SW480 (ung
thư tuyến đại tràng ở người), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư
tiền liệt tuyến), KB (ung thư tế bào biểu mô), F1 (ung thư màng tử cung)
và RD (ung thư màng tim).
4
Hoạt tính kháng lao: M. bovis và M. smegmatis.
Hoạt tính chống oxi hóa (theo phương pháp DPPH);
Hoạt tính hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: 3 chủng vi khuẩn
gram (+); 3 chủng gram (-); 2 chủng nấm mốc và 2 chủng nấm men.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn
Phần này trình bầy cụ thể quá trình phân lập các hợp chất từ mẫu
lá và mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn.
Lần lượt mẫu lá (3,5kg) và mẫu vỏ thân (2,4 kg ) đã được phơi
khô, nghiền bột và chiết bằng methanol sau đó chiết phân bố lần lượt
với n-hexane và ethylacetate. Các dịch chiết n-hexane, ethylacetate và
lớp nước được cất thu hồi dung môi và được phân lập trên cột chiết và
các hệ dung môi thích hợp thu được 11 hợp chất từ mẫu lá và 15 hợp
chất thu được từ mẫu vỏ. Các quy trình phân lập mẫu lá và mẫu vỏ thân
cây dấu dầu lá nhẵn được trình bầy trong hình 2 và hình 3 dưới đây.
3.2. Hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất phân lập
được từ cây dấu dầu lá nhẵn
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Chương này trình bày về cách xác định cấu trúc của các hợp chất
phân lập được và kết quả thử hoạt tính sinh học của các chất này.
4.1. Phân lập các hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn
4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất
Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu
trúc của 26 hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn, Trong số đó,
có một hợp chất mới lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên và 15 hợp
chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Tetradium,
5
Phân lập các hợp chất từ mẫu lá của cây dấu dầu lá nhẵn
Hình 2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu lá cây dấu dầu lá nhẵn.
6
Phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ thân của cây dấu dầu lá nhẵn
Hình 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ mẫu vỏ cây dấu dầu lá nhẵn.
7
Dưới đây trình bày phương pháp xác định cấu trúc của 3 hợp
chất điển hình
4.2.1. Hợp chất TG1 (chất mới): Tetraglabrifolioside
O
O
6''
OH
OH
O
O
6''
OH
COOH
COOH
O
3
1''
5''
O
'
O
OH
'
6'
5'
5''
6'
O
O
HO
HO
3''
1''
O
1
HO
HO
HO
HO
2
1'
O
5'
O
O
2'
OH
OH
1'
OH
4
TG1
HO
TG1a
Hình 1. Cấu trúc và các tương tác HMBC chính của hợp chất TG1
và cấu trúc của hợp chất tham khảo TG1a
Hợp chất TG1 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng.
Công thức phân tử được xác định là C16H28O10. Dựa trên phổ khối lượng
phân giải cao HR ESI MS (Error! Reference source not found.) xuất
hiện pic ion giả phân tử tại m/z 379,1609 ([M–H]–) (tính toán lý thuyết
cho công C16H27O10: 379,1604).
Trên phổ 1H-NMR của TG1 xuất hiện tín hiệu của một proton
anome tại δH 4,34 (d, J = 8,0 Hz), một nhóm methyl bậc 3 tại δH 1,36
(s), một nhóm methyl bậc 2 tại δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) và một nhóm
methyl bậc một tại δH 0,96 (t, J = 7,5 Hz). Phổ 13C-NMR và DEPT của
TG1 cho thấy sự xuất hiện của hai nhóm cacbonyl tại δC 172,63 (C-1′′)
và 178,50 (C-5′′), một cacbon bậc bốn tại 70,88 (C-3′′), 6 nhóm
oxymethine tại δC 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′), 75,26 ′ (C-2), 77,92 (C-3′),
79,07 (C-2) và 103,93 (C-1′); bốn nhóm methylen tại δC 30,25 (C-3),
46,99 (C-2′′), 47,26 (C-4′′) và 64,73 (C-6′); ba nhóm methyl tại δC 9,98
(C-4), 21,48 (C-1) và 27,81 (C-6′′). Các tín hiệu cacbon tại δC 103,93
(C-1′), 75,26 (C-2′), 77,92 (C-3′), 71,74 (C-4′), 75,05 (C-5′) và 64,73
(C-6′) cùng với hằng số tương tác của proton JH-1′-H-2′ = 8,0 Hz lớn, gợi
ý sự có mặt của một đơn vị đường β-D-glucopyranoside. Thủy phân hợp
8
chất TG1 trong môi trường acid để thu phần đường; sau đó thực hiện
phản ứng với trimethylsilylimidazole. Cô quay sản phẩm phản ứng và
rồi chiết phân bố trong n-hexane và H2O thu được phân lớp n-hexane.
Lớp n-hexane này được phân tích trên máy GC với điều kiện: cột SPB-1
(0,25 mm × 30 m); detector FID, nhiệt độ cột 210 °C, nhiệt độ buồng
bơm 270 °C, nhiệt độ buồng bơm 300 °C, khí mang heli (tốc độ dòng 2
mL/phút) đã thu được một pic tín hiệu tại thời gian lưu 14,11 phút. Tiến
hành tương tự cho các mẫu chuẩn D-glucose và L-glucose thu được thời
gian lưu của persilylated D-glucose và L-glucose lần lượt là 14,11 và
14,26 phút. Bằng các so sánh thời gian lưu đã xác định được chính xác
phần đường trong hợp chất TG1 là D-glucose.
Bảng 8. Dữ kiện phổ NMR của TG1 và hợp chất tham khảo
TG1a
δC#
C
1
2
3
4
1′
2′
3′
4′
5′
103,0
75,9
78,6
72,4
75,9
6′
65,5
1′′
173,6
2′′
48,0
3′′
71,7
4′′
48,7
5′′
6′′
180,9
28,7
#
TG1
δC
DEPT
δH (J = Hz)
21,48 CH3
1,21 (d, 6,5)
79,07 CH
3,74 (m)
1,50 (m)
30,25 CH2
1,62 (m)
9,98 CH3
0,96 (t, 7,5)
103,93 CH
4,34 (d, 8,0)
75,26 CH
3,18 (t, 8,5)
77,92 CH
3,36*
71,74 CH
3,33*
75,05 CH
3,47 (m)
4,21 (dd, 6,0, 11,5)
64,73 CH2
4,45 (dd, 1,5, 11,5)
172,63 C
2,64 (d, 15,0)
46,99 CH2
2,68 (d, 15,0)
70,88 C
2,48 (d, 15,0)
47,26 CH2
2,59 (d, 15,0)
178,50 C
27,81 CH3
1,36 (s)
HMBC
2, 3
1′, 4, 3
1, 2, 4
2, 3
2′, 3′
1′, 3′, 4′
2′, 4′, 5′
2′, 3′, 5′, 6′
1′, 3′, 5′, 6′
1′′, 4′, 5′
1′′, 4′, 5′
1′′, 3′′, 4′′, 6′′
2′′, 3′′, 5′′, 6′′
2′′, 3′′, 5′′, 6′′
2′′, 3′′, 4′′
δC thu được từ hợp 1-[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β-D-
glucopyranosyl]-3-hydroxyl-3-methylglutaric acid [119], * tín hiệu chập
9
Hình 6. Phổ 1H-NMR của TG1.
Hình 9. Phổ 13C-NMR của TG1.
Trên phổ HMBC thấy có tương tác giữa δH 1,36 (s) với C-3′′ (δC
70,88)/C-2′′ (δC 46,99)/C-4′′ (47,26); proton của nhóm methylen tại δH
2,64 (d, J = 15,0 Hz)/2,68 (d, J = 15,0 Hz) với C-3′′ (δC 70,88)/C-1′′ (δC
172,63); proton của nhóm methylen tại δH 2,48 (d, J = 15,0 Hz)/2,59 (d,
J = 15,0 Hz) với C-3′′ (δC 70,88)/C-4′′ (δC 178,50) khẳng định sự tồn tại
10
của một nhánh 3-hydroxy-3-methylglutaric acid [118]. Các tín hiệu còn
lại trên phổ đặc trưng cho nhóm 2-butyl với các tín hiệu của hai nhóm
methyl tại C-1 (δC 21,48)/δH 1,21 (d, J = 6,5 Hz) và C-4 (δC 9,98)/δH
0,96 (t, J = 7,5Hz); một nhóm methylen tại δC 30,25 (C-3)/δH 1,50 (m)
và 1,62 (m) và một nhóm oxymethine tại C-2 (δC 79,07)/δH 3,74 (m) và
được khẳng định thêm bằng các tương tác trên phổ HMBC. Tương tác
HMBC giữa proton anome H-1′ (δH 4,34) và C-2 (δC 79,07); giữa H-2
(δH 3,74) và C-1′ (δC 103,93) cho phép khẳng định nhóm 2-butyl liên kết
với C-1 của đường qua cầu oxy. Vị trí este hóa của nhánh glutaric acid
tại C-6′ được khẳng định bởi tương tác giữa các proton H-6′ (δH 4,21 và
4,45) và cacbonyl C-1′′ (δC 172,63). Từ các bằng chứng phổ nêu trên,
hợp chất TG1 được xác định là 2-butyl-O-β-D-glucopyranosyl(1→6)-3hydroxyl-3-methylglutaric acid. Cấu hình tương đối của TG1, được xác
định trên cơ sở sự phù hợp về giá trị độ dịch chuyển hóa học 1H- và 13CNMR cũng như giá trị hằng số tương tác của các proton của TG1 với
các số liệu tại các vị trí tương đồng đã được công bố của hợp chất 1[(2R)-4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanol-2-O-β-D-glucopyranosyl]-3hydroxyl-3-methyl-glutaric acid (TG1a) [119] là hợp chất có cấu trúc
tương tự TG1 chỉ khác ở chỗ thay gốc 2-butanol bằng gốc (2R)-4-(4hydroxyphenyl)-2-butanol. Như vậy, TG1 được xác định là (2R*,3S*)2-butyl-O-β-D-glucopyranosyl
(1→6)-3-hydroxyl-3-methylglutaric
acid, một hợp chất mới lần đầu phân lập từ thiên nhiên và được đặt tên
là tetraglabrifolioside.
4.2.7. Hợp chất TG7: 12α-Hydroxyevodol
Hợp chất TG7 thu được dưới dạng bột vô định hình, màu vàng.
Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu proton của 4 nhóm oxymethine tại δH
3,83 (br s), 4,06 (s), 4,08 (br s) và 5,46 (s); 2 nhóm oxymethylen tại δH
4,58 (d, J = 12,5 Hz) và 4,68 (d, J = 12,5 Hz); 4 nhóm methyl bậc ba tại
δH 0,86 (s), 0,91 (s), 1,35 (s) và 1,47 (s); và 3 proton olefin tại δH 7,47
(s), 7,61 (s) và 6,49 (s) gợi ý sự có mặt của vòng furan thế β.
11
O
O
21
22
20
OH
OH
O
18
O
O
17
O
3
O
13
11
O
26
19
24
9
1
15
10
O
O
5
O
O
O
O
7
4
O
O
25
24
OH
OH
Hình 32. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG7.
Phổ
13
C-NMR và phổ DEPT của TG7 xuất hiện tín hiệu của 26
nguyên tử cacbon trong đó có 11 cacbon bậc bốn, 8 cacbon methine, 3
cacbon methylen và 4 cacbon methyl. Những tín hiệu trên phổ NMR của
TG7 gợi ý đây là một hợp chất có khung dạng limonoid. Vị trí của
proton liên kết trực tiếp với cacbon tương ứng được xác định bằng phổ
HSQC. Cấu trúc của TG7 được khẳng định dựa trên kết quả phân tích
phổ HMBC. Các tương tác HMBC giữa H-1 (δH 4,08) với C-3 (δC
169,83)/C-19 (69,31); tương tác giữa proton Ha-2 (δH 2,92)/ Hb-2 (δH
2,78) với C-1 (δC 79,00)/ C-3 (δC 169,83)/C-10 (δC 46,87) cho phép dự
đoán trong TG7 có vòng ester nội phân tử tại C-3/C-19.
Các nguyên tử cacbon của vòng epoxy-lacton cũng được xác định
thông qua tương tác HMBC giữa H-15 (δH 4,06) với C-14 (δC 64,90)/ C16 (δC 166,59) và giữa H-17 (δH 5,46) với C-13 (δC 42,14)/ C-14 (δC
64,90)/ C-18 (δC 12,91). Tương tác giữa proton methyl H-18 (δH 0,86)
với C-12 (δC 65,95)/ C-13 (δC 42,14)/C-14 (δC 64,90)/C-17 (δC 76,63)
cho thấy có nhóm hydroxy tại vị trí C-12. Tương tác HMBC giữa H-21
(δH 7,74) với C-20 (δC 119,74)/C-22 (δC 110,45)/ C-23 (δC 142,93);
tương tác giữa H-22 (δH 6,50) với C-20 (δC 119,74)/ C-21 (δC 141,71)/
C-23 (δC 142,93); tương tác giữa proton H-23 (δH 7,62) với C-20 (δC
119,74)/C-21 (δC 141,71)/ C-22 (δC 110,45) khẳng định sự có mặt của
một vòng furan. Vòng furan này được xác định liên kết với vòng epoxy-
12
lacton tại vị trí C-17 thông qua các tương tác HMBC giữa H-17 (δH
5,46) với C-20 (δC 119,74)/ C-21 (δC 141,71)/ C-22 (δC 110,45).
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Bảng 14. Dữ kiện phổ NMR của TG7 và hợp chất tham khảo
DEPT
HMBC
δH (J = Hz)
*δC
δC
79,0
79,00 CH
4,08 (br s)
3, 9, 19
35,0
34,95 CH2 2,92 (dd, 2,0, 17,0)
1, 3, 10
2,78 (dd, 2,0, 17,0)
169,7 169,83 C
81,1
81,12 C
140,3 140,30 C
141,9 141,93 C
195,3 195,32 C
47,3
47,29 C
42,8
42,88 CH
2,79 (d, 12,0)
1, 7, 8, 10,
11, 12, 19, 26
46,9
46,87 C
31,9
31,82 CH2 1,90 (ddd, 4,5, 12,0, 14,0) 8, 9, 12, 13
1,59 (d, 14,0)
65,9
65,95 CH
3,83 (br s)
42,2
42,14 C
64,4
64,90 C
50,6
50,63 CH
4,06 (s)
14, 16
166,5 166,59 C
76,6
76,63 CH
5,46 (s)
12, 13, 14,
18, 20, 21, 22
12,9
12,91 CH3 0,86 (s)
12, 13, 14, 17
69,3
69,31 CH2 4,68 (d, 12,5)
1, 3, 9, 10
4,58 (d, 12,5)
119,7 119,74 C
141,6 141,71 CH
7,74 (s)
20, 22, 23
110,4 110,45 CH
6,50 (s)
20, 21, 23
142,9 142,93 CH
7,62 (s)
20, 21, 22
25,5
25,54 CH3 1,47 (s)
4, 5, 25
25,0
25,03 CH3 1,35 (s)
4, 5, 24
17,5
17,05 CH3 0,91 (s)
7, 8, 9, 14
Giá trị #δC của 12- hydroxyevodol đo trong DMSO [3].
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ 1H- và
C-NMR của TG7 với
13
hợp chất 12α-hydroxyevodol trong tài liệu tham khảo [3] cho thấy có sự
13
phù hợp tại tất cả các vị trí tương ứng. Đặc biệt, cấu hình lập thể của H12 được xác định là β thông qua việc so sánh độ chuyển dịch cacbon và
hằng số tương tác J với hợp chất 12α-hydroxyevodol. Từ các phân tích
trên, hợp chất TG7 được xác định là 12α-hydroxyevodol, một hợp chất
đã được phân lập từ loài Tetradium rutacarpum thuộc chi Tetradium.
Hình 34. Phổ 1H-NMR giãn của TG7.
Hình 35. Phổ 13C-NMR của TG7.
14
4.2.12. Hợp chất TG12: Epimedoside C
4"'
5''
3''
OH
OH
HO
1"'
6"
4'
O
HOHO
O
1"
3"
7
OH
O
1'
O
HO
HO
2
9
HO
O
O
OH
3
10
5
4
OH
O
OH
OH
OH
O
Hình 60. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của TG12.
Hợp chất TG12 thu được ở dạng tinh thể hình kim, mầu vàng.
Phổ 1H-NMR (Phụ lục 5) của TG12 thấy có xuất hiện tín hiệu của hai
cặp proton vòng thơm thế para tại δH 6,94 (d, J = 9,0 Hz) và 8,05 (d, J =
9,0 Hz) và một proton thơm tại δH 6,59 (s) cho phép dự đoán đây là một
hợp chất dạng flavone. Đồng thời, trên phổ còn quan sát thấy tín hiệu
của một proton anome tại δH 4,99 (d, J = 7,5 Hz) đặc trưng cho sự có
mặt của một phần đường glycoside và sự xuất hiện tín hiệu của một
proton olefin tại δH 5,21 (t, J = 7,0 Hz), hai nhóm methyl bậc ba tại δH
1,62 (s) và 1,76 (s) cho phép dự đoán sự có mặt của một đơn vị isopren.
Trên phổ
13
C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử
cacbon, trong đó có 11 nguyên tử cacbon bậc 4, 11 nhóm methine, 2
nhóm methylene và 2 nhóm methyl. Trong đó tín hiệu đặc trưng cho
phân tử đường glucose với tín hiệu cacbon oximethine anome tại δc
100,50 và 2 tín hiệu đặc trưng cho một vòng thơm thế 1,4 tại δc 129,55
và 115,49. Sự xuất hiện của tín hiệu cacbon methine tại δc 97,43 và tín
hiệu cacbon bậc 4 tại δc 135,77 cho phép khẳng định sự xuất hiện của 1
nhóm thế tại vị trí C-8 và sự có mặt của nhóm thế hydroxy tại vị trí C-3.
Vị trí liên kết của phân tử đường và nhánh isoprenyl được khẳng
định lại dựa trên kết quả phân tích phổ 2 chiều HSQC và HMBC. Trên
phổ HMBC, thấy xuất hiện tương tác giữa 2 tín hiệu proton methilen tại
δH 3,43/3,64 (H-1′′′) với C-7 (δc 160,07)/ C-8 (δc 108,08)/ C-9 (δc
152,70) cho phép khẳng định nhánh isoprenyl liên kết với C-8.
15
Bảng 19. Dữ kiện phổ NMR của TG12 và hợp chất tham khảo
C
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1′
2′,6′
3′,5′
4′
1′′
2′′
3′′
4′′
5′′
6′′
δC
147,4
135,8
176,3
158,6
97,4
160,0
108,0
152,7
104,4
121,85
129,55
115,49
159,35
100,50
73,4
76,6
69,70
77,2
60,7
δC
147,50
135,77
176,37
158,55
97,43
160,07
108,08
152,70
104,46
121,85
129,55
115,49
159,35
100,50
73,39
76,64
69,70
77,18
60,69
1′′′
21,40
21,44
2′′′
3′′′
4′′′
5′′′
122,4
131,0
25,5
18,0
122,42
131,06
25,45
17,88
*
DEPT
δH (J = Hz)
C
C
C
C
CH 6,59 (s)
C
C
C
C
C
CH 8,05 (d, 9,0)
CH 6,94 (d, 9,0)
C
CH 4,99 (d,7,5)
CH 3,32 (m)
CH 3,31 (m)
CH 3,17 (m)
CH 3,42 (m)
CH2 3,46 (m)
3,71 (dd, 5,5, 11,5)
CH2 3,43*
3,64 (dd, 7,0, 14,5)
CH 5,21 (t, 7,0)
C
CH3 1,62 (s)
CH3 1,76 (s)
HMBC
7, 8, 10
2, 4′
1′, 4′, 3’, 5’
7
7, 8, 9, 2′′′,
3′′′
1′′′, 4′′′, 5′′′
2′′′, 3′′′, 5′′′
2′′′, 3′′′, 4′′′
Giá trị #δC của epimedoside C [127], *: tín hiệu bị trùng lấp.
Dựa vào tương tác giữa tín hiệu proton anome của đường tại δH,4,99
với C-7 (δc 160,07); tín hiệu proton singlet 6,59 với C-5 (δc 158,88)/ C-7
(δc 160,07) /C-8 (δc 108,08)/C-10 (δc 104,46) cho phép khẳng định vị trí
liên kết của phân tử đường với C-7. Số liệu phổ NMR của TG12 giống
với số liệu phổ TG11 ngoại trừ sự xuất hiện một liên kết đôi tại C-2/C3. Từ các số liệu phổ, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo được công
bố của hợp chất epimedoside C [127] thấy hoàn toàn phù hợp. Từ đó,
cho phép khẳng định hợp chất TG12 chính là epimedoside C.
16
Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của TG12.
Phụ lục 5. Phổ 13C-NMR của TG12.
Kết luận:
Đã phân lập được 26 hợp chất từ cây dấu dầu lá nhẵn, trong số đó
có 1t hợp chất mới lần đầu tiên phân lập được từ tự nhiên và 15 hợp chất
lần đầu tiên phân lập được từ chi Tetradium. Cấu trúc hóa học và tên gọi
được trình bày trong bảng 34 và hình 93 dưới đây.
17
O
OH
O
O
O
O H3CO
COOH
O
O
HO
HO
O
N
RO
OH
HO
N
N
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
HO
OH
OH
TG6
TG5
O
O
O
HO
TG4
OH
O
O
O
TG9
TG8
TG7
OH
OH
HO
HO
O
HO
HO
O
O
O
HO
HO
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
TG10
O
N
OCH3
R
TG2: H
TG3: CH
O 3
TG1
N
H
N
O
OCH3
O
OH
O
TG11
R1
O
OH
OH
TG12
OH
HO
HO
O
O
OR2
OH
TG17
O
O
TG18
R1
R2
H
Glc
H Glc-6''-Rha
H
Gla
H
OH
TG13:
TG14:
TG15:
TG16:
H
N
HO
HO
HO
H3CO
O
TG21
H
N
OH
R
OCH3
OH
O
TG19
R
O
H
N
TG22
OH
OCH3
TG20
O
OCH3
HO
HOHO
O
O
O
OH
TG23
O
OH
HOHO
TG24
H
HO
HO
HO
O
O
OH
TG25
TG26
hợp chất được phân lập từ cây dấu dầu lá nhẵn.
Bảng 34. Thống kê các hợp chất
phân lập được từ các bộ phận cây dấu dầu lá nhẵn
KH
TG1
TG2
TG3
Hợp chất
Lớp chất
Tetraglabrifolioside
6-Acetonyl-Nmethyldihydrodecarine
6-Acetonyl
glycosid ester
alkaloid
Lá
Vỏ
Khối
Lượng
(mg)
10
11
alkaloid
VT
9
Dạng
mẫu
Hình 93. Các
Tính
mới
M
*
18
TG4
TG5
TG6
TG7
TG8
TG9
TG10
TG11
TG12
TG13
TG14
TG15
TG16
TG17
TG18
TG19
TG20
TG21
TG22
TG23
TG24
TG25
TG26
dihydrochelerythrine
Decarine
Iwamide
Rutaecarpine
12α-Hydroxyevodol
Rutaevine
Lupeol
Friedelan-3-one
Phellamurin
Epimedoside C
Astragalin
Nicotiflorin
Trifolin
Quercetin
α-Tocopherol
N-Isobutyl-2E,4Etetradecadienamide
N-isobutyl-2E,4Edecadienamide
N-Isobutyl-2E,4E,8Etetradecatrienamide
Syringin
Saikolignannisode A
Picraquassioside D
Stigmatsterol
Daucosterol
5-Hydroxymethyl
furfural
alkaloid
alkaloid
alkaloid
tritrerpenoid
tritrerpenoid
tritrerpenoid
tritrerpenoid
flavonoid
flavonoid
flavonoid
flavonoid
flavonoid
flavonoid
DX methyl
của phenol
amide
VT
VT
VT
VT
L
VT
VT
L
L
L
L
L
L
VT
8
25
11
7
10
9
13
8
21540
30
20
10
10
10
VT
11
*
amide
VT
13
*
amide
VT
10
*
benzenoid
benzenoid
benzenoid
sterol
sterol
fufural
L
L
L
VT
VT
L
21
7
20
8
10
7
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
(Mới): Hợp chất mới lần đầu phân lập từ tự nhiên, * lần đầu phân lập từ chi Tetradium; L: mẫu lá, VT:
mẫu vỏ thân.
4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học
4.3.1. Kết quả kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào in vitro
Trong nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập từ cây
dấu dấu lá nhẵn được tiến hành xác định trên sáu dòng tế bào ung thư: SW480 (ung thư tuyến
đại tràng ở người), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến), KB (ung thư
tế bào biểu mô), F1 (ung thư màng tử cung) và RD (ung thư màng tim). Kết quả được trình
bày trong bảng 35.
Bảng 35. Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào in vitro
IC50 (µg/mL)
Hợp chất
SW480 LU-1 LNCaP
KB
F1
RD
> 50 34,57
> 50
> 50
> 50
> 50
TG1
> 50
> 50
> 50
3,55
4,42
4,54
TG2
> 50
> 50
> 50
25,70
27,16
26,23
TG3
> 50
> 50
> 50
49,80
49,92
34,66
TG5
> 50
> 50
> 50
> 50
> 50
> 50
TG10
21,94
8,85
12,49
> 50
> 50
> 50
TG11
10,47
7,73
6,69
> 50
> 50
> 50
TG12
- Xem thêm -
.PDF 
25 
177 
59 
