Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na biển

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CÂY NA BIỂN (Annona glabra L.) Chuyên ngành: Hoá học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. Phan Văn Kiệm 2. TS. Hoàng Lê Tuấn Anh HÀ NỘI - 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Phan Văn Kiệm và TS. Hoàng Lê Tuấn Anh. Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Thu Hiền i LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới PGS. TS. Phan Văn Kiệm và TS. Hoàng Lê Tuấn Anh - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa Sinh biển đặc biệt là TS. Nguyễn Xuân Nhiệm, TS. Bùi Hữu Tài, TS. Phạm Hải Yến và ThS. Đan Thị Thúy Hằng về sự ủng hộ to lớn, những lời khuyên bổ ích và những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc đã giúp đỡ tôi trong việc thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và đồng nghiệp của tôi tại Bộ môn Hóa học - Khoa Đại học Đại cương, tới Phòng Tổ chức Cán bộ và Ban Giám hiệu Trường đại học Mỏ - Địa chất đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Nguyễn Thị Thu Hiền ii MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. viii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................x DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. xii DANH MỤC PHỤ LỤC ...........................................................................................xv MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI NA (ANNONA) ................................................................3 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Na (Annona) .....................................................3 1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Annona .............................3 1.1.2.1. Các hợp chất diterpenoid ent-kaurane ................................................4 1.1.2.2. Các hợp chất acetogenin .....................................................................7 1.1.2.3. Các hợp chất alkaloid ........................................................................19 1.1.2.4. Các hợp chất amide ...........................................................................23 1.1.2.5. Các hợp chất peptide vòng ................................................................24 1.1.2.6. Các hợp chất khác .............................................................................25 1.1.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Annona ..............................27 1.1.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào ...................................................................27 1.1.3.2. Hoạt tính kháng viêm ........................................................................30 1.1.3.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm...............................................30 1.1.3.4. Hoạt tính kháng virus và ký sinh trùng .............................................31 1.1.3.5. Hoạt tính chống oxy hóa ...................................................................32 1.1.3.6. Hoạt tính khác ...................................................................................32 1.2. GIỚI THIỆU VỀ LOÀI NA BIỂN ....................................................................34 1.2.1. Đặc điểm thực vật ......................................................................................34 iii 1.2.2. Công dụng..................................................................................................35 1.2.3. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) trên thế giới .................35 1.2.4. Tình hình nghiên cứu về loài na biển (A. glabra) ở Việt Nam .................36 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................38 2.1. MẪU THỰC VẬT .............................................................................................38 2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT .............................................39 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) .............................................................................39 2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế ..........................................................................39 2.2.3. Sắc ký cột (CC)..........................................................................................39 2.3. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC ...................................39 2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp) ...............................................................................39 2.3.2. Độ quay cực ([α]D) ....................................................................................40 2.3.3. Phổ khối lượng (MS) .................................................................................40 2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) ...............................................................40 2.3.5. Phổ lưỡng sắc tròn (CD) ............................................................................40 2.3.6. Phương pháp xác định đường ....................................................................40 2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC.................................41 2.4.1. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ........................................41 2.4.1.1. Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ..................................41 2.4.1.2. Phân tích hình thái của các tế bào chết theo chương trình sử dụng chất nhuộm Hoechst 33342 ............................................................................43 2.4.1.3. Western Blot .....................................................................................43 2.4.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm ............................................44 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .......................................................45 3.1. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI NA BIỂN ........................................45 3.2. HẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT .................48 iv 3.2.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới) ............48 3.2.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................48 3.2.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................49 3.2.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................49 3.2.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV ......................................................................49 3.2.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................50 3.2.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................50 3.2.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al..............................50 3.2.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid .......................50 3.2.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E ..................................................................50 3.2.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B .................................................................51 3.2.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid .................................51 3.2.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-Dglucopyranoside (mới) .........................................................................................51 3.2.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside ...................................................................................................51 3.2.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I .........................................................52 3.2.16. Hợp chất 16: Blumenol A ........................................................................52 3.2.17. Hợp chất 17: Icariside B1 .........................................................................52 3.2.18. Hợp chất 18: Icariside D2 ........................................................................52 3.2.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside ...............................52 3.2.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl 1-O-β-D-glucopyranoside ..............53 3.2.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid................................................53 3.2.22. Hợp chất 22: Squamocin M .....................................................................53 v CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................54 4.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT .....................................................54 4.1.1. Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới) ............54 4.1.2. Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................60 4.1.3. Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................65 4.1.4. Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β-Dglucopyranoside ester (mới) ................................................................................70 4.1.5. Hợp chất 5: Paniculoside IV ......................................................................76 4.1.6. Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................78 4.1.7. Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane .............................................80 4.1.8. Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al.............................82 4.1.9. Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid .......................84 4.1.10. Hợp chất 10: Annoglabasin E ..................................................................85 4.1.11. Hợp chất 11: Annoglabasin B .................................................................87 4.1.12. Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid .................................89 4.1.13. Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-Dglucopyranoside (mới) .........................................................................................91 4.1.14. Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β-Dglucopyranoside ...................................................................................................97 4.1.15. Hợp chất 15: Cucumegastigmane I .........................................................99 4.1.16. Hợp chất 16: Blumenol A ......................................................................101 4.1.17. Hợp chất 17: Icariside B1 .......................................................................102 4.1.18. Hợp chất 18: Icariside D2 ......................................................................103 4.1.19. Hợp chất 19: Icariside D2 6′-O-β-D-xylopyranoside .............................105 4.1.20. Hợp chất 20: 3,4-Dimethoxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranoside............106 vi 4.1.21. Hợp chất 21: 3,4-Dihydroxybenzoic acid..............................................107 4.1.22. Hợp chất 22: Squamocin M ...................................................................108 4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC ....................................................112 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn ........................112 4.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất ...........................112 4.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất ................................115 KẾT LUẬN .............................................................................................................118 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................120 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................121 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................122 PHỤ LỤC .................................................................................................................... I vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu 13 C-NMR Tiếng Anh Cacbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy A Annona A-498 Human kidney carcinoma A-549 Human lung carcinoma CD Circular dichroism 1 COSY H-1H- Correlation Spectroscopy DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMSO Dimethylsulfoxide DNA Deoxyribo Nucleic Axit DPPH 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spectra FBS Fetal bovine serum Glc Glucose HEL-299 Homo Sapiens Lung Normal HeLa HeLa cell Hep G2 Hepatocellular carcinoma HL-60 Human promyelocytic leukemia HMBC Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity HPLC High Performance Liquid Chromatography HR-ESI-MS High Resolution Electronspray Ionization Mass Spectrum HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence HT-29 Human colon adenocarcinoma IC50 Inhibitory concentration at 50% IL iNOS Interleukin Inducible nitric oxide synthase KB LPO LPS LU-1 MCF-7 MKN-45 Human epidemoid carcinoma lipid peroxide Lipopolysaccharide Human lung carcinoma Human breast carcinoma Human Gastric Cancer Diễn giải Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Annona Ung thư biểu mô thận người Ung thư phổi người Phổ lưỡng sắc tròn Phổ COSY Phổ DEPT (CH3)2SO Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Huyết thanh bò Glucozơ Tế bào mô phổi thường Tế bào ung thư cổ tử cung Ung thư biểu mô gan Ung thư máu Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Sắc ký lỏng hiệu năng cao Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết Ung thư ruột kết người Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm Một enzyme tạo ra nitric oxide từ amino L-arginine acid Ung thư biểu mô người Ung thư phổi người Ung thư vú người Ung thư dạ dày viii MTT PACA-2 PC-3 RPMI 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy Human Pancreatic Carcinoma Human Prostate Adenocarcinoma Roswell Park Memorial Institute SK-MEL2 SMMC-7721 TLC TMS TNF-α VERO Melanoma Human Hepatocellular Carcinoma Thin layer chromatography Tetramethylsilane Tumor necrosis factor alpha Monkey epitheloid renal MTT NOESY ix Phổ NOESY Ung thư biểu mô tuyến tụy người Ung thư tuyến tiền liệt người Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI Ung tư da Ung thư biểu mô gan Sắc ký lớp mỏng (CH3)4Si Yếu tố hoại tử khối u Tế bào thường thận khỉ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các hợp chất ent-kaurane từ chi Annona ................................................................ 4 Bảng 1.2. Các hợp chất acetogenin không chứa vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ......... 8 Bảng 1.3. Các hợp chất acetogenin chứa 1 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ................. 9 Bảng 1.4. Các hợp chất acetogenin chứa 2 vòng tetrahydrofuran từ chi Annona ............... 15 Bảng 1.5. Các hợp chất alkaloid từ chi Annona..................................................................... 19 Bảng 1.6. Các hợp chất amide từ chi Annona ........................................................................ 23 Bảng 1.7. Các hợp chất peptide vòng từ chi Annona ............................................................ 24 Bảng 1.8. Các hợp chất khác từ chi Annona .......................................................................... 26 Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo ................................... 55 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo ................................... 62 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất 3........................................................................... 66 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo ................................... 71 Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất 5 và hợp chất tham khảo ................................... 77 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất 6 và hợp chất tham khảo ................................... 79 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất 7 và hợp chất tham khảo ................................... 81 Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất 8 và hợp chất tham khảo ................................... 83 Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất 9 và hợp chất tham khảo ................................... 84 Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất 10 và hợp chất tham khảo ............................... 86 Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất 11 và hợp chất tham khảo ............................... 88 Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất 12 và hợp chất tham khảo ............................... 90 Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ............................... 92 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất 14 và hợp chất tham khảo ............................... 98 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất 15 và hợp chất tham khảo ............................. 100 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất 16 và hợp chất tham khảo ............................. 101 Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất 17 và hợp chất tham khảo ............................. 103 x Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất 18 và hợp chất tham khảo ............................. 104 Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất 19 và hợp chất tham khảo ............................. 105 Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo ............................. 106 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất 21 và hợp chất tham khảo ............................. 108 Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất 22 và hợp chất tham khảo ............................. 109 Bảng 4.23. Thống kê hợp chất phân lập được từ loài na biển............................................. 111 Bảng 4.24. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết và các phân đoạn từ lá và quả loài na biển (A. glabra) ................................................................................................... 112 Bảng 4.25. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất 1-22..................................................... 114 Bảng 4.26. Tác dụng ức chế NO trong đại thực bào ........................................................... 117 xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Annona ............................................................ 3 Hình 1.2. Loài na biển (Annona glabra Linn.) ...................................................................... 34 Hình 2.1. Mẫu thực vật và mẫu tiêu bản khô của loài na biển (A. glabra) .......................... 38 Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu na biển (A. glabra) ............................................. 47 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane.................................. 48 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước ..................................................... 48 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của 1 và hợp chất tham khảo ..................................................... 54 Hình 4.2. Các tương tác HMBC và COSY quan trọng của hợp chất 1 ............................... 56 Hình 4.3. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1 ............................................................................ 56 Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1.................................................................................. 57 Hình 4.5. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1................................................................................. 57 Hình 4.6. Phổ DEPT của hợp chất 1....................................................................................... 58 Hình 4.7. Phổ HSQC của hợp chất 1 ...................................................................................... 58 Hình 4.8. Phổ HMBC của hợp chất 1..................................................................................... 59 Hình 4.9. Phổ COSY của hợp chất 1 ...................................................................................... 59 Hình 4.10. Phổ NOESY của hợp chất 1 ................................................................................. 60 Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo ................................... 60 Hình 4.12. Các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 2............................................... 62 Hình 4.13. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 2 .......................................................................... 63 Hình 4.14. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2................................................................................ 63 Hình 4.15. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 .............................................................................. 64 Hình 4.16. Phổ HSQC của hợp chất 2.................................................................................... 64 Hình 4.17. Phổ HMBC của hợp chất 2................................................................................... 65 Hình 4.18. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 3 ............. 65 xii Hình 4.19. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 3 .......................................................................... 67 Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3................................................................................ 68 Hình 4.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 .............................................................................. 68 Hình 4.22. Phổ HSQC của hợp chất 3.................................................................................... 69 Hình 4.23. Phổ HMBC của hợp chất 3................................................................................... 69 Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo ................................... 70 Hình 4.25. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY quan trọng của hợp chất 4 ............. 72 Hình 4.26. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 4 .......................................................................... 72 Hình 4.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất 4................................................................................ 73 Hình 4.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất 4 .............................................................................. 73 Hình 4.29. Phổ DEPT của hợp chất 4..................................................................................... 74 Hình 4.30. Phổ HSQC của hợp chất 4.................................................................................... 74 Hình 4.31. Phổ HMBC của hợp chất 4................................................................................... 75 Hình 4.32. Phổ COSY của hợp chất 4.................................................................................... 75 Hình 4.33. Phổ NOESY của hợp chất 4 ................................................................................. 76 Hình 4.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 5 ...................... 76 Hình 4.35. Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 .......................................................................... 78 Hình 4.36. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 7 ...................... 80 Hình 4.37. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 8 ...................... 82 Hình 4.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất 9 .......................................................................... 84 Hình 4.39. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 10 .................... 85 Hình 4.40. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 11 .................... 87 Hình 4.41. Cấu trúc hóa học của 12 và hợp chất tham khảo................................................. 89 Hình 4.42. Các tương tác HMBC chính của hợp chất 12 ..................................................... 90 Hình 4.43. Cấu trúc hóa học của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ................................. 91 Hình 4.43. Các tương tác HMBC và NOESY chính của hợp chất 13 ................................. 93 xiii Hình 4.44. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 13........................................................................ 94 Hình 4.45. Phổ 1H-NMR của hợp chất 13 ............................................................................. 94 Hình 4.46. Phổ 13C-NMR của hợp chất 13 ............................................................................ 95 Hình 4.47. Phổ DEPT của hợp chất 13 .................................................................................. 95 Hình 4.48. Phổ HSQC của hợp chất 13.................................................................................. 96 Hình 4.49. Phổ HMBC của hợp chất 13 ................................................................................ 96 Hình 4.50. Phổ NOESY của hợp chất 13 ............................................................................... 97 Hình 4.51. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 14 .................... 97 Hình 4.52. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 15 .................... 99 Hình 4.53. Cấu trúc hóa học chất 16..................................................................................... 101 Hình 4.54. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất 17 .................. 102 Hình 4.55. Cấu trúc hóa học và các tương tác chính của hợp chất 18................................ 103 Hình 4.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất 19 ...................................................................... 105 Hình 4.57. Cấu trúc hóa học của hợp chất 20 và hợp chất tham khảo ............................... 106 Hình 4.58. Cấu trúc hóa học của hợp chất 21 ...................................................................... 107 Hình 4.59. Cấu trúc hóa học của hợp chất 22 ...................................................................... 108 Hình 4.60. Các hợp chất phân lập được từ loài na biển....................................................... 110 Hình 4.61. Mức độ chết theo cơ chế apoptosis của tế bào HL-60 dưới sự tác động của hợp chất 18 và 22 tại thời điểm 24 h và 48 h ở nồng độ IC50 ..................................................... 115 Hình 4.62. Ảnh hưởng của hợp chất 18 và 22 đến các biểu hiện ở cấp độ protein trên dòng tế bào HL-60 ở nồng độ IC50 tại 24 h và 48 h ...................................................................... 115 xiv DANH MỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC HỢP CHẤT 1 (AGQ30) .......................................................................... II PHỤ LỤC HỢP CHẤT 2 (AGQ32) .................................................................... XXII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 3 (AGQ31) ................................................................XXXVI PHỤ LỤC HỢP CHẤT 4 (AGQ29) .......................................................................... L PHỤ LỤC HỢP CHẤT 5 (AGQ26) ..................................................................LXXII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 6 (AGQ6) ............................................................... LXXVIII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 7 (AGQ2) ................................................................. LXXXII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 8 (AGQ8) ............................................................... LXXXIX PHỤ LỤC HỢP CHẤT 9 (AGQ11) ................................................................... XCVI PHỤ LỤC HỢP CHẤT 10 (AGQ7) .........................................................................CI PHỤ LỤC HỢP CHẤT 11 (AGQ4) ................................................................... CVIII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 12 (AGQ9) .................................................................... CXV PHỤ LỤC HỢP CHẤT 13 (AGQ19) ................................................................. CXXI PHỤ LỤC HỢP CHẤT 14 (AG3) ...................................................................... CXLI PHỤ LỤC HỢP CHẤT 15 (AG1) .................................................................. CXLVII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 16 (AG15) .................................................................... CLIII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 17 (AG2) ..................................................................... CLVII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 18 (AGQ20) ...............................................................CLXIII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 19 (AGQ18) .............................................................. CLXIX PHỤ LỤC HỢP CHẤT 20 (AGQ25) ............................................................CLXXIII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 21 (AGQ17) .......................................................... CLXXVII PHỤ LỤC HỢP CHẤT 22 (AGQ1) ............................................................. CLXXXI PHỤ LỤC 23: Sắc ký đồ của các dẫn xuất TMS của D-glucose, L-glucose và các hợp chất ........................................................................................................ CLXXXV PHỤ LỤC 24: Phổ CD của hợp chất 13 và hợp chất tham khảo ................. CLXXXV PHỤ LỤC 25: Phiếu giám định tên khoa học cho mẫu nghiên cứu ...........CLXXXVI xv MỞ ĐẦU Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Không chỉ các nước phương đông mà các nước phương tây cũng tiêu thụ một lượng rất lớn dược liệu. Theo thống kê, ở các nước có nền công nghiệp phát triển, một phần tư số thuốc kê trong các đơn đều có chứa hoạt chất có nguồn gốc từ thảo mộc. Nhiều hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học tốt đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh. Xu hướng đi sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp. Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng và phong phú. Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 loài thực vật bậc cao trong đó có khoảng hơn 4.000 loài được sử dụng làm thuốc. Việc sử dụng nguồn tài nguyên đó để phòng, chữa bệnh và nâng cao sức khoẻ cho con người đã có một quá trình lịch sử hàng nghìn năm và ngày càng trở nên quan trọng. Ngoài sự đa dạng về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều loại bệnh khác nhau. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc quý giá. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Cây na biển (Annona glabra) là loại cây ăn quả và thường được dùng trồng để chắn sóng ở các vùng ngập mặn. Cây thường được dùng để trị tiêu chảy, kiết lỵ và làm thuốc sát trùng. Vỏ cây giã ra cũng có công dụng tương tự. Dịch lá cây dùng để trừ chấy. Hạt nghiền nát có tính làm săn da, sát trùng. Thịt quả lại có vị ngọt mát, giải nhiệt. Các nghiên cứu về thành phần hóa học đã công bố trên thế giới cho thấy loài này chứa nhiều lớp chất quý có cấu trúc độc đáo, đặc biệt là lớp chất diterpenoid ent-kaurane và acetogenin. Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học 1 cho thấy một số hợp chất đã được phân lập từ loài này thể hiện hoạt tính sinh học rất đáng quan tâm như: hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng viêm, giảm đau.... Tuy nhiên, hiện có ít công trình khoa học trong nước công bố cả về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây thuốc quý này. Nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây na biển (Annona glabra L), chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Na biển (Annona glabra L.)" Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành phần hoá học chủ yếu của loài na biển (A. glabra). Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được để tìm kiếm một số chất có hoạt tính , làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm sóc sức khỏe cộng đồng và góp phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của vị thuốc này. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ quả loài na biển (A. glabra) bằng các phương pháp sắc ký; 2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý và hóa học; 3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được; 4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHI NA (ANNONA) 1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Na (Annona) Annona là một chi lớn trong họ Na (Annonaceae), gồm các cây bụi, cây gỗ nhỏ hay lớn, sống hàng năm hay lâu năm. Lá cây dai như da, đôi khi có lông, hoa có 3 đài, xếp van, cuống thường ngắn, hoa lưỡng tính, ở ngoài nách lá đối diện với lá hoặc trên cành già với một hoa hoặc một cụm có ít hoa. Hoa có 6 cánh, nhị nhiều, noãn nhiều, lúc đầu rời nhau, khi thành quả thì dính nhau tạo thành một khối nạc. Bề mặt quả bao phủ bởi các núm, chỗ phình ra có gai hoặc trơn, nhiều hạt. Hạt đen hoặc nâu, vỏ hạt nhẵn bóng [7]. Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân chi Annona có khoảng 125 loài tìm thấy ở Trung và Nam Mỹ, châu Phi, châu Á và châu Úc [1]. Ở Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu đầy đủ về chi Annona. Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân thống kê và mô tả có 4 loài thuộc chi Annona ở Việt Nam đó là: A.muricata, A. squamosa, A. reticulata, và A. glabra, trong đó 3 loài chỉ gặp ở dạng cây trồng [1]. Bốn loài này cũng được mô tả và có thể sử dụng làm thuốc ở nước ta [4, 47]. Annona muricata L. Annona squamosa L. Annona reticulata L. Annona glabra L. Hình 1.1. Hình ảnh của một số loài thuộc chi Annona 1.1.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Annona Theo thống kê, trong số 125 loài thuộc chi Annona có khoảng 21 loài đã được nghiên cứu về thành phần hóa học, bao gồm: A. atemoya, A. bullata, A. cherimolia, A. cornifolia, A. coriacea, A. crassiflora, A. densicoma, A. foetida, A. 3