Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây tốc thằng cáng (anodendron paniculatum (wall. ex roxb.) a.dc.)

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC …………***………… HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM (WALL. EX ROXB.) A.DC.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HUẾ, NĂM 2018 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC …………***………… HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM (WALL. EX ROXB.) A.DC.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài HUẾ, NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Hoàng Thị Như Hạnh LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện nhiệt tình và quý báu của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa học Đại học Huế, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học, Bộ môn Hóa hữu cơ và Ban Giám Hiệu Trường THPT Đặng Trần Côn đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Tôi cũng xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ phòng Dược liệu – Dược cổ truyền – Thực vật dược, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Huế, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Hoàng Thị Như Hạnh MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................... i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...........................................iii DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ............................................................................... x MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae) ..................................... 3 1.2. Giới thiệu về chi Anodendron ..................................................................... 3 Vị trí phân loại ..................................................................................... 3 Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................. 4 Các nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................... 6 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học ................................................ 18 1.3. Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng ................................................ 21 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24 Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất ................................... 24 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ................ 24 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ......................................... 26 Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................... 29 3.1. Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết ........................................................ 29 3.2. Quá trình phân lập các hợp chất ............................................................... 30 3.3. Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập ................. 33 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết.................... 36 Chương 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 38 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập ......................... 38 Hợp chất AP1: Cycloartenol.............................................................. 38 Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) .......................................... 40 Hợp chất AP3: (E)-Phytol ................................................................. 49 Hợp chất AP4: Desmosterol .............................................................. 50 Hợp chất AP5: Ursolic acid ............................................................... 52 Hợp chất AP6: Vanillin ..................................................................... 54 Hợp chất AP7: Esculentic acid .......................................................... 55 Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside ...................................... 57 Hợp chất AP9: Rutin ......................................................................... 60 Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) ........................................ 62 Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới) ........................................ 71 i Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) ........................................ 79 Hợp chất AP13: Sargentol ............................................................... 87 Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid .. 89 Hợp chất AP15: Inugalactolipid A .................................................. 90 Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A ............................................... 94 Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B ............................................... 97 Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C ............................................... 99 Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol ................................................. 101 Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6sulfoquinovopyranosyl)glycerol ................................................................ 102 4.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết .. 105 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 112 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.......................................... 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 115 ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry TLC Thin Layer Chromatography Các phương pháp phổ H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 13 C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy COSY Correlation Spectroscopy 1 DEPT EIMS ESIMS HMBC HRESIMS HSQC HMQC IR J (Hz) NOESY ROESY UV δ (ppm) s d t singlet doublet triplet Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Electron Impact Mass Spectrometry Electrospray Ionization Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation High Resolution - Electrospray Ionization - Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Infrared Spectroscopy J coupling constant Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Rotating frame nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Ultraviolet Spectroscopy δ (ppm = part per million) q quint dd quartet quintet double doublet iii Sắc ký cột Sắc ký khí ghép khối phổ Sắc ký bản mỏng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ tương tác hai chiều 1 H-1H Phổ DEPT Phổ khối va đập điện tử Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết Phổ hồng ngoại Hằng số tương tác tính bằng Hz Phổ NOESY Phổ ROESY Phổ tử ngoại Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu dt double triplet br broad m multiplet Các dòng tế bào A549 H522 LU-1 H460 Bcap-37 MCF-7 BGC MCG MKN-7 Bel-7402 Hep-G2 DU145 LNCaP PC-3 HeLa ME-180 HL-60 P-388 HT-29 SW-480 K562 KB M-14 NBT-T2 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi Human breast adenocarcinoma Ung thư vú Human gastrocarcinoma Ung thư dạ dày Human hepatoma Ung thư gan Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt Human cervical adenocarcinoma Ung thư cổ tử cung Human promyelocytic leukemia Lymphocytic leukemia Ung thư máu cấp tính Ung thư máu lympho Human colon carcinoma Ung thư ruột kết Chronic myelogenous leukemic Human epidermoid carcinoma Melanoma Rat bladder epithelial Ung thư bạch cầu tủy Ung thư biểu mô Khối u ác tính Ung thư bàng quang chuột Các ký hiệu viết tắt khác CTPT DBE Double Bond Equivalent ED50 Effective Dose 50% FAME Fatty Acid Methyl Ester FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power IC50 MBC Inhibitory Concentration 50% Minimum Bactericidal Concentration iv Công thức phân tử Số tương đương nối đôi Liều có tác dụng đối với 50% cá thể Dẫn xuất methyl ester của acid béo Lực chống oxy hóa được đo bằng khả năng khử ion sắt (III) Nồng độ ức chế 50% Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MFC Minimum Fungicidal Concentration MIC mp OD Minimum Inhibitory Concentration Melting point Optical Density CHCl3 DMSO EtOAc MeOH Chloroform Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Methanol Nồng độ diệt nấm tối thiểu Nồng độ ức chế tối thiểu Điểm chảy Mật độ quang SRB Ac Me TMS Sulforhodamine B Acetyl Methyl Tetramethylsilane Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác. v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận ....................... 4 Bảng 1.2. Sự phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam ....................... 5 Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ A. formicinum . 19 Bảng 1.4. Hoạt tính ức chế sự phát triển của ấu trùng Bombyx mori của cardenolide từ A. affine ........................................................................................ 20 Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc của các hợp chất đã phân lập trên các dòng tế bào ung thư.................................................................................................................... 1 Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP1 và hợp chất tham khảo .............. 39 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR hợp phần triterpenoid của hợp chất AP2 ................ 41 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR hợp phần acid béo của hợp chất AP2 ..................... 42 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP3 và hợp chất tham khảo .............. 49 Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP4 và hợp chất tham khảo .............. 51 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP5 và hợp chất tham khảo .............. 53 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP6 và hợp chất tham khảo .............. 55 Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP7 và hợp chất tham khảo .............. 56 Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP8 và hợp chất tham khảo .............. 58 Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP9 và hợp chất tham khảo ............ 61 Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP10........................ 70 Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP10 và chất tham khảo .............................................................................................................................. 71 Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP11........................ 77 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP11 ............................ 78 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP12........................ 84 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP12 ............................ 85 Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP13 và hợp chất tham khảo .......... 88 Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP14 và hợp chất tham khảo .......... 90 Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP15 ................................................ 92 Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP16 và hợp chất tham khảo .......... 95 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP17 và hợp chất tham khảo .......... 97 Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP18 và hợp chất tham khảo ........ 100 Bảng 4.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP19 và hợp chất tham khảo ........ 102 Bảng 4.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP20 và hợp chất tham khảo ........ 104 Bảng 4.25. Thống kê các hợp chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng ................. 105 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc chung (a) và vị trí dễ bị oxy hóa (b) của cardenolide........... 15 Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp của cardenolide .......................................... 15 Hình 1.3. Hệ thống vòng ngưng tụ kiểu cis-trans-cis của cardenolide aglycone 16 Hình 1.4. Phần đường của các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae......................................................................................................... 17 Hình 2.1. Loài Tốc thằng cáng: a. Phần trên mặt đất, b. Lá và quả, c. Đại bổ đôi, d. Hạt mang chùm lông ........................................................................................ 23 Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng ...................................................................................................................... 29 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform của cây Tốc thằng cáng ...................................................................................................................... 31 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước của cây Tốc thằng cáng 32 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 .................................................... 38 Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 .................................................... 43 Hình 4.3. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP2 .......................... 44 Hình 4.4. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP2 ........................................ 44 Hình 4.5. Phổ HRESIMS của hợp chất AP2 ........................................................ 44 Hình 4.6. Phổ UV của hợp chất AP2 ................................................................... 45 Hình 4.7. Phổ IR của hợp chất AP2 ..................................................................... 45 Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2........................................................... 46 Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP2 ......................................................... 46 Hình 4.10. Phổ HMQC của hợp chất AP2 ........................................................... 47 Hình 4.11. Phổ HMBC của hợp chất AP2 ........................................................... 47 Hình 4.12. Phổ COSY của hợp chất AP2 ............................................................. 48 Hình 4.13. Phổ NOESY của hợp chất AP2 .......................................................... 48 Hình 4.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP3 .................................................. 50 Hình 4.15. Tương tác HMBC chính của hợp chất AP3 ....................................... 50 Hình 4.16. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP4 ............................................................................................................... 52 Hình 4.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP5 .................................................. 54 Hình 4.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP6 .................................................. 54 Hình 4.19. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP7 ............................................................................................................... 57 Hình 4.20. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP7 ...................................... 57 vii Hình 4.21. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP8 ............................................................................................................... 59 Hình 4.22. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP9 ............................................................................................................... 60 Hình 4.23. Phổ HRESIMS của hợp chất AP10 .................................................... 63 Hình 4.24. Phổ IR của hợp chất AP10 ................................................................. 63 Hình 4.25. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP10....................................................... 64 Hình 4.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP10 ..................................................... 64 Hình 4.27. Phổ DEPT của hợp chất AP10........................................................... 65 Hình 4.28. Phổ HMQC của hợp chất AP10 ......................................................... 65 Hình 4.29. Phổ HMBC của hợp chất AP10 ......................................................... 66 Hình 4.30. Phổ COSY của hợp chất AP10 ........................................................... 66 Hình 4.31. Phổ ROESY của hợp chất AP10......................................................... 67 Hình 4.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP10 ................................................ 68 Hình 4.33. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP10 ...................... 68 Hình 4.34. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP10..................................... 69 Hình 4.35. Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất alditol hexaacetate của hợp chất AP10 ..................................................................................................................... 69 Hình 4.36. Phổ HRESIMS của hợp chất AP11 .................................................... 72 Hình 4.37. Phổ IR của hợp chất AP11 ................................................................. 72 Hình 4.38. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11....................................................... 73 Hình 4.39. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP11 ..................................................... 73 Hình 4.40. Phổ DEPT của hợp chất AP11........................................................... 74 Hình 4.41. Phổ HMQC của hợp chất AP11 ......................................................... 74 Hình 4.42. Phổ HMBC của hợp chất AP11 ......................................................... 75 Hình 4.43. Phổ COSY của hợp chất AP11 ........................................................... 75 Hình 4.44. Phổ ROESY của hợp chất AP11......................................................... 76 Hình 4.45. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP11 ................................................ 76 Hình 4.46. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP11 ...................... 78 Hình 4.47. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP11..................................... 79 Hình 4.48. Phổ HRESIMS của hợp chất AP12 .................................................... 80 Hình 4.49. Phổ IR của hợp chất AP12 ................................................................. 80 Hình 4.50. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP12....................................................... 81 Hình 4.51. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP12 ..................................................... 81 viii Hình 4.52. Phổ DEPT của hợp chất AP12........................................................... 82 Hình 4.53. Phổ HMQC của hợp chất AP12 ......................................................... 82 Hình 4.54. Phổ HMBC của hợp chất AP12 ......................................................... 83 Hình 4.55. Phổ COSY của hợp chất AP12 ........................................................... 83 Hình 4.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP12 ................................................ 85 Hình 4.57. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP12 ...................... 86 Hình 4.58. Phổ ROESY của hợp chất AP12......................................................... 86 Hình 4.59. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP12..................................... 86 Hình 4.60. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY (b) chính của hợp chất AP13 ............................................................................................................. 88 Hình 4.61. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP14 ............................................................................................................. 89 Hình 4.62. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP15 ................................................ 93 Hình 4.63. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP15 ...................... 93 Hình 4.64. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP16 ................................................ 96 Hình 4.65. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP16 .............. 96 Hình 4.66. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP17 ................................................ 98 Hình 4.67. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP17 .............. 99 Hình 4.68. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP18 .............................................. 100 Hình 4.69. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP19 .............................................. 101 Hình 4.70. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP20 .............................................. 103 Hình 4.71. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP20 .................... 103 ix DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phổ của hợp chất AP1 ............................................................... PL1 Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất AP2 ............................................................... PL3 Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất AP3 ............................................................... PL6 Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất AP4 ............................................................... PL9 Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất AP5 ............................................................. PL13 Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất AP6 ............................................................. PL17 Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất AP7 ............................................................. PL20 Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất AP8 ............................................................. PL24 Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất AP9 ............................................................. PL29 Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất AP10 ......................................................... PL34 Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất AP11 ......................................................... PL37 Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất AP12 ......................................................... PL39 Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất AP13 ......................................................... PL41 Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất AP14 ......................................................... PL46 Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất AP15 ......................................................... PL50 Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất AP16 ......................................................... PL56 Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất AP17 ......................................................... PL58 Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất AP18 ......................................................... PL60 Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất AP19 ......................................................... PL62 Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất AP20 ......................................................... PL64 Phụ lục 21. Biên bản giám định tên khoa học của cây Tốc thằng cáng .......... PL69 Phụ lục 22. Biên bản thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng .......................................................................................... PL70 x MỞ ĐẦU Sự gia tăng nhanh chóng của nhiều căn bệnh nguy hiểm có khả năng lan rộng như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, dịch Ebola, chứng đầu nhỏ do virus Zika… đang là một cuộc khủng hoảng thực sự cho sức khỏe cộng đồng và là thách thức không nhỏ cho hệ thống y tế trên toàn thế giới. Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc mới, các phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể. Một xu hướng quan trọng trong quá trình này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên bởi chúng thường phù hợp với cơ thể sống, ít độc, thân thiện với môi trường, đa dạng về cấu trúc, có thể sử dụng trực tiếp để làm thuốc, hoặc làm các mô hình để nghiên cứu tổng hợp thuốc mới. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho thấy thực vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển thuốc. Có thể kể một vài ví dụ điển hình như taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia); vinblastine, vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus); camptothecin từ cây Hỉ thụ (Camptotheca acuminata); podophyllotoxin từ cây Khoai ma Mỹ (Podophyllum peltatum)… Trong quá trình sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị mà chúng tôi đã khảo sát, 10 cây thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống ung thư đã được đưa vào sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Trong đó, cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum Roxb. A.DC. – Apocynaceae) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tốt trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 thấp, đặc biệt là trên các dòng tế bào LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan) và MKN-7 (ung thư dạ dày) [4]. Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài này. Việc sử dụng cây Tốc thằng cáng để chữa các bệnh liên quan đến khối u chủ yếu dựa vào tri thức bản địa của đồng bào Pako, Vân Kiều. Điều này cho thấy loài cây này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. 1 Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall. ex Roxb.) A.DC.)” Mục tiêu của luận án: 1. Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chính của loài Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC. 2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài này Nội dung nghiên cứu của luận án: 1. Chiết tách, phân lập, tinh chế các hợp chất từ loài Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập 3. Thử hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các hợp chất đã phân lập. 2 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae) Họ Trúc đào (Apocynaceae) là họ lớn, được chia thành 5 phân họ (Plumerioideae, Apocynoideae, Periplocoideae, Secamonoideae và Asclepiadoideae) với gần 200 chi, hơn 2000 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới [2], [8]. Họ Trúc đào gồm các đại diện là thân cỏ hoặc thân gỗ to hay nhỏ, phần lớn là dây leo hay bụi đứng. Cây có nhựa mủ trắng, thường độc. Lá đơn, nguyên, mọc đối, đôi khi mọc cách hoặc mọc vòng, không có lá kèm. Hoa đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hoặc hình xim, ở nách lá hay ở ngọn. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, đài 5 thường hợp. Tràng hình ống thường có phần phụ ở trong ống tràng, giống như lông hay vảy hoặc tạo thành tràng phụ. Tiền khai hoa vặn [2]. Bộ nhị gồm 5 nhị đính trên ống tràng. Chung đới có thể kéo dài thành mũi nhọn, đôi khi có mang lông dài hoặc úp lên mặt trên của đầu nhụy. Chỉ nhị rời hoặc dính liền thành một ống bao quanh bầu. Bao phấn thường chụm vào nhau tạo như một cái mái che trên đầu nhụy và có thể đính vào đầu nhụy (phân họ Echitoideae) hoặc đính vào 5 mặt của đầu nhụy 5 góc. Phía ngoài bộ nhị có thể mang những phụ bộ, tạo thành một tràng phụ thứ nhì do nhị sinh ra. Hạt phấn rời hay dính thành tứ tử hoặc phấn khối [2]. Bộ nhụy gồm 2 lá noãn (ít khi 3-5), tự do ở phần đầu, dính nhau ở phần vòi, một vòi duy nhất. Đầu nhụy hình trụ ngắn hoặc hình mâm 5 góc. Mỗi lá noãn có nhiều noãn tạo thành bầu 2 ô, đính noãn trung trụ hay bầu 1 ô, đính noãn bên. Đáy bầu thường có đĩa mật. Quả đại, quả nang, đôi khi gặp quả mọng. Hạt có cánh hay có chùm lông và nội nhũ. Các cây trong họ Trúc đào thường có ống nhựa mủ thật, libe quanh tủy. Trong thân có hai vòng libe. Mạch thủng lỗ đơn, một số có mạch thang ngắn. Ở Việt Nam, họ Apocynaceae có khoảng 100 chi với khoảng 280 loài [2], [8]. 1.2. Giới thiệu về chi Anodendron Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [116], chi Anodendron A.DC. có vị trí phân loại như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc lan 3 (Magnoliopsida), phân lớp Hoa môi (Lamiidae), bộ Long đởm (Gentianales), họ Trúc đào (Apocynaceae), chi Anodendron. Dự án “The plant list” khởi động từ năm 2010 đã thống kê được 38 tên loài thuộc chi Anodendron thu thập từ nhiều cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, trong đó chỉ có 17 tên loài được chấp nhận (Bảng 1.1) [52]. Bảng 1.1. Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Tên khoa học Anodendron affine (Hook. &Arn.) Druce Anodendron axillare Merr. Anodendron benthamianum Hemsl. Anodendron borneense (King & Gamble) Mabb. Anodendron candolleanum Wight Anodendron coriaceum (Blume) Miq. Anodendron gracile (King & Gamble) Mabb. Anodendron howii Tsiang Anodendron nervosum Kerr Anodendron oblongifolium Hemsl. Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC. Anodendron pauciflorum Hook.f. Anodendron punctatum Tsiang Anodendron seramense Mabb. Anodendron tubulosum (Ridl. ex Burkill&M.R.Hend.) Mabb. Anodendron whitmorei Mabb. Anodendron wrayi King & Gamble Đặc điểm thực vật và phân bố Các loài trong chi Anodendron chủ yếu ở dạng dây leo gỗ. Lá mọc đối, nách lá có nhiều tuyến nâu. Cụm hoa ở đầu cành, kiểu xim kép, ít khi ở nách kiểu xim nhiều ngả, 5 lá đài bé và hẹp, gốc đài có nhiều tuyến mọc cách với lá đài, rất ít khi không có tuyến (các loài ở Việt Nam đều có tuyến). Ống tràng dạng ống ngắn. Họng tràng không có vảy và tràng phụ. Cánh tràng thường dạng lưỡi dài hơn rộng, phủ nhau phải, dài hơn ống tràng, đối xứng hai bên, không có phần phụ và không gặp trong nụ. Nhị đính nửa ống tràng phía dưới hoặc ở đáy. Chỉ nhị rất ngắn. Bao 4 phấn hình mũi tên, lưng nhẵn, triển hình vòng nguyên hoặc xẻ thùy nông, nhẵn. Bầu trên gồm 2 lá noãn rời, đỉnh bầu nhẵn. Noãn nhiều. Vòi nhụy ngắn. Đầu nhụy hình nón dài. Quả gồm 2 đại rời nhau, phình to ở gốc, đầu nhọn, mỗi đại không có cuống riêng, vỏ quả nhẵn. Giá noãn hóa gỗ. Hạt nhiều dạng thuôn, đầu thu hẹp thành mỏ dài mang chùm lông, vỏ hạt nhẵn, chùm lông tồn tại, khó rụng [3], [8], [79]. Theo Phạm Hoàng Hộ [3], chi Anodendron ở Việt Nam gồm 3 loài:  A. affine (Hook. & Arn.) Druce.  A. paniculatum (Roxb.) A.DC.  A. nervosum Kerr Năm 2004, Phan Kế Lộc và cộng sự bổ sung loài A. howii Tsiang vào hệ thực vật Việt Nam [7]. Các loài thuộc chi Anodendron phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á: Ấn Độ, Mianma, Nam Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin, Việt Nam [3], [8], [79]. Ở Việt Nam, chi này phân bố rải rác khắp cả nước. Dưới đây là bảng phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam [8]. Bảng 1.2. Sự phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam STT Loài Tên Việt Nam 1 A. paniculatum Tốc thẳng, Tốc thằng cáng, Ngà voi, Dây duy tù, Đay nhui 2 A. affine Ngà voi, Dây duy 3 A. howii 4 A. nervosum Phân bố Quảng Trị, Thừa thiên Huế (Phú Lộc, Bạch Mã), Đắc Lắc, Khánh Hòa (Nha Trang), Đồng Nai (Biên Hòa), Bến Tre, Kiên Giang (Phú Quốc) Hà Giang (Yên Minh), Bắc Giang, Hòa Bình (Lạc Thủy), Hải Dương (Chí Linh), Hà Nam (Ninh Thái), Ninh Bình (Cúc Phương) Ngà voi sang, Dây Hà Tây (Ba Vì) duy sang Ngà voi thái, Dây Đồng Nai (Biên Hòa) duy thái 5 Các nghiên cứu về thành phần hóa học Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Anodendron ở trong nước còn khá hạn chế. Trong khi đó, nghiên cứu về hóa thực vật của chi này trên thế giới đã được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1969 bởi Sasaki và Hirata [103]. Tính đến nay, chỉ có 3 loài của chi này là A. affine, A. paniculatum và A. formicinum được nghiên cứu về thành phần hóa học với khoảng 88 hợp chất được phân lập. 1.2.3.1. Thành phần hóa học loài A. affine Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Anodendron chủ yếu tập trung vào loài này và được thực hiện bởi các nhà hóa học Nhật Bản trong giai đoạn 1969-1994. Tính đến nay, hơn 70 hợp chất đã được phân lập từ loài này trong đó chủ yếu là các cardenolide glycoside. Năm 1969, Sasaki và Hirata đã phân lập được 2 alkaloid mới khung pyrrolizidine, anodendrine (1), alloanodendrine (2), cùng với một amine bậc bốn, choline (3). Cả hai hợp chất mới (1–2) đều tồn tại ở dạng muối amoni bậc bốn [103]. Cấu trúc hóa học của chúng được thiết lập thông qua các chuyển hóa hóa học. Hydro hóa anodendrine (1), xúc tác Pd thu được (+)-laburninic acid trong khi đó tiến hành tương tự với alloanodendrine (2) lại dẫn đến sản phẩm (+)isoretronecanolic acid (đồng phân C-1 epimer của (+)-laburninic acid). Các cấu trúc này cũng được củng cố thông qua tổng hợp toàn phần [104]. Năm 1971, Shima và cộng sự đã phân lập 2 flavonoid là kaempferol (4), astragalin (5) từ lá [108], [111] và một glycoside của syringic acid là glucosyringic acid (6) từ thân cây A. affine. Hợp chất 6 cũng được tổng hợp từ syringic acid và acetobromo-D-glucose nhằm chứng minh cấu trúc [109]. Nhóm này tiếp tục phân lập β-sitosterol (7), daucosterol (8), sucrose (9), dambonitol (10) và một cardenolide mới chưa xác định được cấu trúc từ thân cây. Ngoài ra, các tác giả cũng thu được ursolic acid (11) từ hoa của loài này [107], [111]. Tiếp đó, một benzopyran mới là 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-carboxylic (12) (hay còn được gọi là anofinic acid) được xác định thông qua các dữ kiện phổ và tổng hợp hóa học [110]. Hợp chất này sau đó được tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như nấm Lactarius deliciosus 6