Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học của lá loài cáp đồng văn (capparis dongvanensis)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN HẢI HOÀN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ LOÀI CÁP ĐỒNG VĂN (CAPPARIS DONGVANENSIS) Ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 8440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Văn Khang THÁI NGUYÊN - 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin được cam đoan đây là kết quả nghiên cứu khoa học của riêng tôi, các số liệu ,dữ liệu, kết quả trong luận văn là trung thực, chưa từng có ai công bố các kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn này trong bất kỳ báo cáo nghiên cứu khoa học nào khác. Học viên Trần Hải Hoàn i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo PGS. TS. Phạm Văn Khang - Người đã hướng dẫn tôi tận tình, cặn kẽ, bảo ban tôi trong quá trình học tập. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Chủ nhiệm khoa Hóa học, các thầy cô giáo trong khoa, đặc biệt các thầy cô giáo ở bộ môn Hóa học ứng dụng - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, bạn bè và các em sinh viên nghiên cứu khoa học đã hướng dẫn tôi tận tình từ những nguyên tắc, những kiến thức cơ bản nhất khi làm nghiên cứu. Các anh chị học viên, các em sinh viên đã luôn cổ vũ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình làm thí nghiệm. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2020 Học viên Trần Hải Hoàn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii MỤC LỤC............................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ................................ iv DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................... v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ ........................................................................ vi MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài........................................................................................... 1 Chương 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 2 1.1. Khái quát về loài Cáp đồng văn (Capparis dongvanensis) .......................... 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật học ............................................................................... 2 1.2. Tổng quan về chi Capparis .......................................................................... 4 1.3. Khái quát chung về họ Caparaceae (Màn Màn).[a] .................................. 13 1.4. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các loài họ Màn Màn .......... 14 1.5. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài họ Màn Màn ........... 17 1.6. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của các loài trong chi Capparis .................................................................................................. 21 1.6.1. Alkaloid ................................................................................................... 21 1.6.2. Flavonoid ................................................................................................. 26 1.6.3. Steroid ...................................................................................................... 28 1.6.4. Các hợp chất khác.................................................................................... 30 1.7. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các loài trong chi Capparis ................................................................................................................. 31 1.7.1. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư ở chi Capparis...................................... 31 1.7.2. Hoạt tính chống oxi hóa........................................................................... 33 1.7.3. Hoạt tính kháng viêm .............................................................................. 34 iii 1.7.4. Hoạt tính điều trị đái tháo đường............................................................. 35 Chương 2: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 36 2.1. Hóa chất và thiết bị ..................................................................................... 36 2.1.1. Hóa chất ................................................................................................... 36 2.1.2. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học.................................. 36 2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................... 36 2.2. Phương pháp sử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được ................................................................................... 37 2.2.1. Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật ................................................... 37 2.2.2. Chiết xuất ................................................................................................. 37 2.2.3. Phương pháp định tính các nhóm hợp chất. ............................................ 37 2.2.4. Xác định cấu trúc các chất ....................................................................... 39 2.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư .................................... 40 2.3.1. Vật liệu và hóa chất ................................................................................. 40 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro ...................................................... 40 2.3.3. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) ........... 40 2.4. Phân lập, tinh chế các hợp chất .................................................................. 42 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 44 3.1. Kết quả định tính nhóm hợp chất ............................................................... 44 3.2. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất ...................................................... 46 3.2.1. Phân tích cấu trúc hợp chất 1................................................................... 46 3.2.2. Phân tích cấu trúc hợp chất 2................................................................... 52 3.2.3. Phân tích cấu trúc hợp chất 3................................................................... 56 3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HeLa (cổ tử cung) và A549 (tế bào ung thư gan) ............................................. 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 64 PHỤ LỤC ............................................................................................................... iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN 13 C-NMR : 13C-Nucler Magnetic Resonance : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C 1 H-NMR : 1H-Nucler Magnetic Resonance : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer : Phổ DEPT ESI-Ms : Electron Impact Mass Spectroscopy : Phổ khối lượng HMBC : Heternuclear multiple - Bond Corelation : Phổ tương quan HMBC HSQC : Heternuclear Spectroscopy- Quantum Coherence : Phổ tương quan trực tiếp C-H RP : Reversed - Phase Chromatography NP : Normal - Phase Chromatography SEM :Scanning Electro Microscope LC : Liquid chromatography : Sắc ký lỏng MS : Mass spectrometry : Phổ khối lượng iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Màn màn ở Việt Nam ....... 13 Bảng 1.2: Những hợp chất Alkaloid .............................................................. 22 Bảng 1.3: Những hợp chất flavonoid ............................................................. 26 Bảng 1.4: Những hợp chất steroid ................................................................. 28 Bảng 1.5: Những hợp chất khác .................................................................... 30 Bảng 1.6: Hoạt tính ức chế tế bào ung thư ở chi Capparis ........................... 32 Bảng 1.7: Hoạt tính chống oxi hóa ở chi Capparis ....................................... 33 Bảng 1.8: Hoạt tính sinh học kháng viêm ở chi Capparis ............................ 34 Bảng 1.9: Tác dụng điều trị đái tháo đường ở chi Capparis ......................... 35 Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết ethanol và cao chiết EA ................................................................. 44 Bảng 3.2: Giá trị độ chuyển dịch hóa học của 1 (δ ppm, J Hz)) ................... 48 Bảng 3.3: Giá trị độ chuyển dịch hóa học 1H NMR của chất 3 ..................... 57 Bảng 3.4: Tác động gây độc tế bào ung thư của 1 và 3 ................................. 62 v DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Hình vẽ mô tả loài Cáp đồng văn .................................................. 2 Hình 1.2: Hình ảnh loài Cáp đồng văn .......................................................... 3 Hình 1.3: Một bản vẽ hình thái của Capparis spinosa L .............................. 5 Hình 1.4: Hoa của Capparis aegyptia ........................................................... 5 Hình 1.5: Quả và quả đã được mở ra của Capparis sola ............................... 5 Hình 1.6: Hình thái các cơ quan khác nhau của Capparis ............................ 6 Hình 1.7: Quả của Capparis flexuosa cắt ngang, làm lộ cấu trúc bên trong của hạt .................................................................................. 7 Hình 1.8: Chú ý vị trí tương đối của thân cây và lá của Capparis spinosa ....................................................................................................... 7 Hình 1.9: Sự biến đổi khác nhau về hoa giữa các loài trong chi Capparis ....................................................................................................... 9 Hình 1.10: Capparis cartilaginea với những bông hoa ở độ tuổi khác nhau cho thấy màu sắc khác nhau nằm giữa màu trắng và đỏ ...... 9 Hình 1.11: Sự biến đổi về màu sắc và hình dạng quả giữa các loài trong chi Capparis ................................................................................ 11 Hình 1.12: Sự biến đổi về cách mọc giữa các loài trong chi Capparis......... 12 Hình 1.13: Các bộ phận của cây được sử dụng trong y, dược học và đời sống thường ngày ........................................................................ 13 Hình 2.1: Sơ đồ phân lập chất 1-3 ............................................................... 43 Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của chất 1 .............................................................. 46 Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất 1 ............................................................ 49 Hình 3.3. Phổ HSQC của chất 1 .................................................................. 50 Hình 3.4. Sự tương quan giữa HC của chất 1 (HMBC) .......................... 50 Hình 3.5. Phổ NOESY của chất 1 ............................................................... 51 Hình 3.6. Phổ MS của chất 1 ....................................................................... 51 vi Hình 3.7. Công thức cấu tạo của chất 1 ...................................................... 52 Hình 3.8. Phổ 1H-NMR của chất 2 .............................................................. 52 Hình 3.9. Phổ 13C-NMR của chất 2............................................................. 54 Hình 3.10. Phổ DEPT - 135 của chất 2 ......................................................... 54 Hình 3.11. Phổ HSQC của chất 2 .................................................................. 55 Hình 3.12. Phổ HMBC của chất 2................................................................. 55 Hình 3.13: Phổ NOESY của chất 2 ............................................................... 55 Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của chất 2 ........................................................ 56 Hình 3.15. Phổ 1H-NMR của chất 3 ............................................................. 56 Hình 3.16. Phổ 13C-NMR của chất 3 ........................................................... 58 Hình 3.17. Phổ DEPT - 135 của chất 3 ......................................................... 59 Hình 3.18. Phổ HSQC của chất 3 .................................................................. 59 Hình 3.19. Phổ HMBC của chất 3................................................................. 60 Hình 3.20: Phổ NOESY của chất 3 ............................................................... 60 Hình 3.21: Phổ khối lượng của 3.................................................................. 61 Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của chất 3 ........................................................ 61 vii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, các hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học có trong động thực vật là một trong những lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Từ xưa con người đã biết sử dụng nhiều loại thực vật để chữa bệnh. Do vậy, việc nghiên cứu, khai thác các chất có hoạt tính sinh học có trong có trong tự nhiên là vấn đề quan tâm chung của xã hội. Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên các loài thực vật rất đa dạng, vì thế tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học và giúp ngành y học cổ truyền phát triển. Các loài thuộc chi Cáp (họ Màn màn - Capparaceae) đã được dùng từ lâu để chữa một số bênh như: viêm nhiễm, đau lưng. Gần đây, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng dịch chiết cao tổng số và hợp chất hóa học được phân lập từ loài thực vật này có kháng viêm, ức chế nhiều dòng tế bào ung thư và bảo vệ tế bào. Ở Việt Nam, loài Cáp đồng văn là loài thực vật được nhóm nghiên cứu của PGS. TS. Sỹ Danh Thường phát hiện, định danh và công bố tên khoa học năm 2017. Hiện nay, loài thực vật này được phát hiện tại Hà Giang. Đến nay chưa có công bố nào về thành phần hóa học của loài thực vật này. Dó đó chúng tôi đề xuất đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học của lá loài Cáp đồng văn (Capparis dongvanensis). Khi đề tài này hoàn thành sẽ cung cấp cơ sở khoa học để sử dụng loài Cáp đồng văn này làm thuốc chữa bệnh, đồng thời đào tạo nhân lực trong cả nước. 2. Mục tiêu của đề tài 1. Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học nhóm hợp chất bằng phản ứng định tính. 2. Phân lập, xác định cấu trúc hóa học của ít nhất 2 hợp chất từ lá loài Cáp đồng văn 3. Đánh giá hoạt tính sinh học của hợp chất thu được. 1 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về loài Cáp đồng văn (Capparis dongvanensis) 1.1.1. Đặc điểm thực vật học 1.1.1.1. Tên khoa học - Tên khoa học: Capparis dongvanensis. - Họ: Capparaceae (Màn Màn hay Màng Màng). 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật [13] A: Cành chứa hoa. B: Thân có gai. C: Phần đỉnh của lá. D: Gốc lá. E: Các lá đài. F: Cặp cánh hoa thấp hơn. G: Cặp cánh hoa trên. H: Noãn. I: Cành quả. J: Nhánh với quả. Hình 1.1. Hình vẽ mô tả loài Cáp đồng văn - Capparis dongvanensis (Capparaceae) được coi như là một loài mới và được tìm thấy từ tỉnh Hà Giang của Việt Nam. Nó có hình thái tương tự như Capparis lanceolaris và Capparis fengii, nhưng khác về số lượng hoa trên cuống, chiều dài cột sống và cuống lá, đỉnh của lá, loại hình phiến, màu cánh hoa, hình 2 bầu dục không có mỏ, hình dạng quả và số hạt trên mỗi quả. Các đặc điểm hình thái chẩn đoán cùng với hình ảnh SEM của hạt phấn và hạt của Capparis dongvanensis và các loài đồng minh được mô tả ở hình 1.2. Hình 1.2: Hình ảnh loài Cáp đồng văn - Chú thích hình 1.2: A: Ảnh tổng quan của loài Cáp đồng văn. I: Cặp cánh hoa trên. B: Cành chứa hoa. J: Nhị hoa C: Cành chứa quả K: Nhụy hoa và noãn. D: Thân cây trưởng thành. L: Mặt cắt ngang của lá. E: Thân có gai. M: Hình ảnh SEM của hạt phấn hoa. F: Nụ N: Hình ảnh SEM của bề mặt phấn hoa. G: Các lá đài (mặt sau). O: Hình ảnh SEM của hạt giống. H: Căp cánh hoa thấp hơn. P: Hình ảnh SEM của bề mặt vỏ hạt. 3 1.1.1.3. Phân bố - Cây mới được tìm kiếm và phát hiện ở Cao nguyên đá Đồng Văn - Hà Giang do PGS.TS. Sỹ Danh Thường và các cộng sự. Bài báo khoa học - quốc tế về cây được công bố vào 3/10/2017. 1.2. Tổng quan về chi Capparis - Tên khoa học: Capparis. - Tên tiếng việt: Bạch hoa, Cáp. - Capparis là một chi lớn bao gồm từ 250 đến 400 loài, chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của cả Thế giới cũ và Thế giới mới, nhưng một số cũng thuộc vùng ôn đới ở Địa Trung Hải và các nước Tây Nam Á. Nó thuộc họ Capparaceae, một họ gồm 45 chi và 675 loài ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của cả hai bán cầu, chủ yếu ở vùng khô cằn. - Chi Capparis có thể được mô tả như sau: (Hình 1.3 - Hình 1.8)  Cây thân gỗ hoặc cây bụi, thường có lá màu xanh, có thể là dây leo hoặc đôi khi trườn dưới mặt đất, thân cây có gai ngắn hoặc không có gai.  Cành non có hoặc không có lông. Lông mọc lưa thưa hoặc theo vùng.  Lá mọc xen kẽ, đơn giản, toàn bộ cây hoặc dưới gốc, thường có nhiều lông. Với các cành có nhiều gai đôi khi gần như không có lá.  Hoa lưỡng tính, mọc đơn, có hình dây dù, nách hoặc phần cuối của lá hiếm khi ở trên. Các bẹ lá thường mọc nhiều hơn nhưng quấn nhau sớm.  Các đài hoa gỡ ra hoặc chụm lại tại đáy, mở bằng mảnh vỏ hoặc lợp. Các đài hoa mọc sau thường rộng hơn và lõm hơn các đài khác.  Các cánh hoa thường thuôn và khá mỏng, chủ yếu là đầu nhỏ ở phía cuống lá, thường có nhiều lông sau khi nở hoa. Hai cánh hoa sau kết hợp lại với nhau, tạo thành một khối nhô ra ở khoang mật.  Nhị hoa rất nhiều, tỏa ra vượt quá các cánh hoa, rất nhẵn, lồng vào đế hoa là phần cuối của cuống nhụy. 4 Hình 1.3: Một bản vẽ hình Hình 1.4: Hoa của Capparis aegyptia thái của Capparis spinosa L Hình 1.5: Quả và quả đã được mở ra của Capparis sola  Cuống nhụy nói chung thường dài bằng nhị hoa. Khi tạo quả nó thường phát triển dày hơn.  Bầu nhụy nhẵn, hình trụ hoặc hình elip, thường có 1 đến 2 noãn, ít khi có nhiều noãn. 5  Đầu nhụy có cuống hoặc hầu như không cuống.  Quả hình cầu, hình quả trứng hoặc hình thon dài, thường có màng cứng, mịn. Ở ngoài có rãnh và thường có màu sắc khác nhau khi chín hoặc bị khô. Quả không vỡ hoặc vỡ chậm sẽ để lại lớp màng ở giữa trung tâm (Hình 1.5).  Trong 1 quả thì có nhiều hạt. Hạt hình đa giác có nhiều cạnh, dính chặt vào phần thịt của quả. Nhị hoa Mầm cây cuộn xoắn Quả Mặt cắt quả Mặt cắt ngang của hoa Hạt nguyên vẹn và hạt được cắt theo chiều dọc Hoa được cắt theo chiều dọc Hình 1.6: Hình thái các cơ quan khác nhau của Capparis 6 Hình 1.7: Quả của Capparis Hình 1.8: Chú ý vị trí tương đối của flexuosa cắt ngang, làm lộ cấu thân cây và lá của Capparis spinosa trúc bên trong của hạt - Tuy nhiên trong thực tế, chi lớn này cho thấy nhiều sự thay đổi được biểu hiện ra bên ngoài của các loài khác nhau (Hình 1.9 - Hình 1.12). Trên thực tế, cả chi Capparis cho thấy khả năng thích nghi tuyệt vời với môi trường tự nhiên khác nhau, kể cả nơi khô cằn nhất và đó cũng là một ví dụ cho sức sống tuyệt vời đối với một loài thực vật đầy hấp dẫn và lôi cuốn này.  Sự biến đổi của hoa trong chi Capparis: Capparis spinosa L. Capparis sepiaria L. 7 Capparis flexuosa L. Capparis decidua. Capparis sola. Capparis cartilaginea. Capparis micracantha. Capparis moonii. 8 Hình 1.9: Sự biến đổi khác nhau về hoa giữa các loài trong chi Capparis - Sự thay đổi đáng kể cũng có thể tồn tại giữa những bông hoa của cùng một loại cây: Hình 1.10: Capparis cartilaginea với những bông hoa ở độ tuổi khác nhau cho thấy màu sắc khác nhau nằm giữa màu trắng và đỏ - Sự biến đổi về quả trong chi Capparis (màu sắc và hình dạng quả): 9 Capparis cartilaginea: quả chín màu đỏ Capparis spinosa: quả chưa chín màu xanh Capparis decidua: Quả đang chín Capparis odoratissima Jacq.: Quả chín màu đỏ màu đỏ - được cắt dọc 10 Capparis tomentosa Lam: Quả chưa Capparis erythrocarpos: Quả chín màu chín màu xanh đỏ tươi Hình 1.11: Sự biến đổi về màu sắc và hình dạng quả giữa các loài trong chi Capparis - Sự khác nhau giữa cách mọc, phát triển của các loài khác nhau trong chi Capparis: Capparis spinosa: Mọc trên tường Capparis decidua của một ngôi nhà 11