Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học của cây hương nhu tía (Ocimum Sanctum L.)

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1. TS. Nguyễn Văn Tài 2. TS. Đỗ Quyên Nơi thực hiện : 1. Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu 2. Bộ môn Dược liệu - trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội và quá trình nghiên cứu của em tại Viện Dược liệu. Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô tại khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu và các thầy cô ở bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến Tiến sỹ Nguyễn Văn Tài và Tiến sỹ Đỗ Quyên, dù bận rất nhiều công việc nhưng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em trong quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh khóa luận. Mặc dù bản thân đã rất cố gắng trong lần đầu tiên nghiên cứu khoa học nhưng chắc chắn khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hiếu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................... 2 1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L............................................................................ 2 1.2. Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) ......................... 5 1.3 Tổng quan về acid ursolic ........................................................................................ 6 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu............................................................................................. 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 13 CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 15 3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học .................................. 15 3.2 Định tính acid ursolic trong cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng SKLM................................................................................................................... 22 3.3 Phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng sắc ký cột ....................................................................................................................... 23 3.4 Xây dựng quy trình chiết tách acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) .................................................................................................................... 29 BÀN LUẬN ................................................................................................................... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................................... 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 40 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTCT công thức cấu tạo DCM dichloromethan dd dung dịch EtOAc ethyl acetat EtOH ethanol IR Phổ hồng ngoại kl khối lượng MeOH methanol NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân MS Phổ khối Rf hệ số lưu SKLM sắc ký lớp mỏng tt thể tích TT thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic trong lá của các loài thuộc chi Ocimum L. ....... 6 Bảng 3.1 : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng phản ứng hóa học. ................................................... 21 Bảng 3.2 : Phổ 1H, 13C-NMR của D1 và acid ursolic. ............................................... 27 Bảng 3.3 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết bằng các dung môi khác nhau... 32 Bảng 3.4 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau. .......... 34 Bảng 3.5 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết với tỷ lệ dung môi/dược liệu khác nhau. .............................................................................................................. 34 Bảng 3.6 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) với số lần chiết khác nhau. ................. 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 : CTCT của acid ursolic. ................................................................................ 7 Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic. ............................................................................ 9 Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic..................................... 9 Hình 1.4 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki). . 10 Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica) .. 11 Hình 3.1 : Sắc ký đồ của cắn MeOH toàn phần với acid ursolic đối chứng trên các hệ dung môi khai triển. ......................................................................................... 22 Hình 3.2 : Tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) .............................................................................................. 24 Hình 3.3 : Sắc ký đồ các cắn phân đoạn với acid ursolic đối chứng. ...................... 25 Hình 3.4 : Sắc ký đồ acid ursolic thô và sau khi kết tinh với chất đối chứng......... 31 Hình 3.5 : Sắc ký đồ acid ursolic thô của các mẻ chiết bằng các dung môi khác nhau ... 33 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hương nhu tía từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền làm thuốc điều trị cảm nắng, cảm hàn, sốt nóng sợ rét, nhức đầu, đau bụng ... Dược điển Việt Nam IV có chuyên luận về Hương nhu, xem hai loài Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L.) và Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được sử dụng như nhau trong điều trị. Thực tế, cây Hương nhu trắng là nguồn nguyên liệu chiết xuất tinh dầu Hương nhu và điều chế eugenol, còn cây Hương nhu tía chủ yếu dùng trong Y học cổ truyền. Trên thế giới, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được dùng như một nguồn nguyên liệu giàu acid ursolic, do có chứa hàm lượng acid ursolic cao [19, 22]. Acid ursolic là một saponin thuộc nhóm ursan đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như chống viêm, bảo vệ gan, hạ lipid máu, chống khối u [10, 15]. Đặc biệt acid ursolic còn là một chất trung gian quan trọng để bán tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như acid corosolic (một chất ức chế glycogen phosphorylase được nghiên cứu nhiều trong điều trị đái tháo đường) [20, 24]. Xuất phát từ thực tế cây Hương nhu tía ở Việt Nam chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần acid ursolic, chúng tôi đã thực hiện đề tài : "Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)" với các nội dung chính như sau : - Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.). - Chiết xuất, phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.). - Xây dựng quy trình chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.). - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng acid ursolic chiết từ dược liệu. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L. 1.1.1. Vị trí phân loại chi Ocimum L. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, chi Ocimum L. thuộc : • Giới thực vật (Plantae) • Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) • Lớp Ngọc lan (Magnoliidae) • Phân lớp Bạc hà (Lamidae) • Bộ Bạc hà (Lamiales) • Họ Bạc hà (Lamiaceae) • Chi Ocimum L. [4] 1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Ocimum L. Chi Ocimum L. thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae), tên gọi có thể bắt nguồn từ ozo, ozein nghĩa là toát mùi thơm, liên quan đến mùi thơm phảng phất của các cây thuộc chi này; hoặc do chữ okimon, okys nghĩa là nhanh, cấp tốc vì các cây này mọc rất nhanh. Tên khác của chi : Hương nhu, Húng, É. Cỏ hay cây bụi nhỏ, sống hằng năm hay sống nhiều năm. Thân thường vuông, nhẵn hay có lông. Lá mọc đối, mép nguyên hay xẻ răng cưa, có lông hay nhẵn, thường có các điểm tuyến tròn trên phiến. Cụm hoa dạng chùy hay hình tháp, gồm các xim bó tạo thành các vòng giả, mỗi vòng thường có 6 hoa. Lá bắc tồn tại hay sớm rụng. Đài hình chuông, thường có lông và điểm tuyến ở phía ngoài, 2 môi; môi trên có một thùy lớn ít nhiều men xuống ống; môi dưới 4 thùy, với 2 thùy bên nhọn ngắn, 2 thùy dưới nhọn, dài. Tràng có ống thò khỏi đài, nhẵn hay có lông, 2 môi : môi trên 4 thùy ngắn; môi dưới một thùy dài và lớn hơn môi trên, hơi cong và lõm hình thuyền. Nhị 4, hướng xuống môi dưới, chỉ nhị ít nhiều thò khỏi ống tràng, bao phấn hình trứng hay hình thận, 1 ô. Bầu nhẵn, vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh. Đĩa mật 3 có thùy trước lớn. Quả hình trứng hay gần hình cầu, nhẵn, nằm trong đài đồng trưởng. Có khoảng 150 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Phi và Nam Mỹ. Ở Việt Nam có 4 loài [5]. 1.1.3 Chi Ocimum L. ở Việt Nam Ở Việt Nam, chi Ocimum L. có 4 loài : • Ocimum americanum L. - É hoang, É châu Mỹ. Ở nước ta có gặp tại Hà Nội và vùng Cam Ranh tỉnh Khánh Hòa. • Ocimum basilicum L. - Húng quế, Húng giổi, Húng chó, É tía, É quế. Ở nước ta, có gặp từ Hà Giang, Hà Nội, Thừa Thiên Huế, Ninh Thuận, thành phố Hồ Chí Minh và Long An. Cũng được trồng ở nhiều nơi. Ocimum basilicum L. var. pilosum (Willd.) Benth. - Húng trắng, É trắng, Trà tiên. Ở nước ta, thứ này có gặp từ Hà Giang, Hòa Bình, Hà Nội vào Quảng Nam, Kon Tum, Đắc Lắc, Khánh Hòa, thành phố Hồ Chí Minh và Long An. Cũng được trồng ở nhiều nơi. • Ocimum gratissimum L. - Hương nhu trắng, É lá lớn. Ở nước ta, có gặp từ Hà Giang, Sơn La, Lạng Sơn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hà Nội vào tới thành phố Hồ Chí Minh. • Ocimum sanctum L. (tên khác O. tenuiflorum L.) - Hương nhu tía, É tía, É đỏ, É rừng. Ở nước ta, có gặp từ Hòa Bình, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình vào Khánh Hòa, Ninh Thuận, thành phố Hồ Chí Minh cho đến An Giang. Cũng được trồng ở nhiều nơi [5]. 1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 1.1.4.1 Tên gọi • Tên khoa học : Ocimum sanctum L. (tên khác : O. tenuiflorum) - họ Bạc hà (Lamiaceae). • Tên khác : É đỏ, é tía. 4 • Tên nước ngoài : Monk's basil, sacred basil, holy basil, rough basil, tulsi, mosquito plant of South Africa (Anh), basilic saint, basilic sacré (Pháp) [7]. 1.1.4.2 Đặc điểm thực vật Cây nhỏ, sống hằng năm hay sống dai, cao đến gần 1m. Thân, cành màu đỏ tía, có lông mịn. Lá mọc đối, có cuống dài, hình mác hoặc thuôn, dài 2 - 5 cm, rộng 1 - 3 cm, mép khía răng, hai mặt màu tím tía, có lông mềm. Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm xim phân nhánh; lá bắc nhỏ; hoa màu trắng hoặc tím tía, xếp thành từng vòng 5 - 6 cái trên cụm hoa; đài hoa dài 3 - 5 mm, thùy trên hình mắt chim, thùy dưới hình giùi dài hơn, những thùy bên rất ngắn; tràng hoa có cánh hơi lượn sóng ở mép; nhị 4, vượt ra ngoài tràng. Quả bế tư, gần hình cầu, hơi dẹt, màu nâu nhạt hoặc đỏ có đốm đen nhỏ, nằm trong đài tồn tại. Mùa hoa quả : tháng 5 - 7 [7]. 1.1.4.3 Phân bố, sinh thái Hương nhu tía vốn là cây cổ nhiệt đới châu Á, được trồng rải rác ở Trung Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm rau gia vị. Ở Việt Nam, Hương nhu tía mới được trồng hạn chế trong vườn các gia đình hoặc các cơ sở chữa bệnh theo y học cổ truyền. Cây ưa khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình năm khoảng 25 - 300C; lượng mưa 1800 - 2600 mm/năm. Ở các vùng núi cao có khí hậu cận nhiệt đới và hơi lạnh, không thấy trồng. Hương nhu tía mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, đến cuối mùa thu hay đầu mùa đông thì tàn lụi. Cây ra hoa quả nhiều. Quả chín tự mở, hạt rơi xuống đất và nảy mầm sau 5 - 6 tháng. Cây trồng dễ dàng bằng hạt [7]. 5 1.2. Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) Tinh dầu : đây là thành phần đáng chú ý và có giá trị cao trong cây Hương nhu tía, theo Dược điện Việt Nam IV, dược liệu phải chứa ít nhất 0,5% tinh dầu (tính theo dược liệu khô tuyệt đối) [3]. Về thành phần hóa học,tinh dầu hương nhu tía Việt Nam chứa các thành phần chính là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%) và β-caryophylen [7]. Thành phần hóa học khác trong cây : - Hương nhu tía chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như apigenin, luteolin, apigenin-7-glucuronid, luteolin-7-glucuronid, orientin và nhóm polyphenol như : acid galic, acid galic methylester, acid galic ethylester, acid protocatechic, acid rosmarinic. [7]. - Acid ursolic là một thành phần quan trọng và có hàm lượng cao trong Hương nhu tía. + Năm 2008, Silva MG và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm lượng acid ursolic trong lá của 8 loài thuộc chi Ocimum L., đó là : O. americanum, O. basilicum, O. basilicum var purpurascens, O. basilicum var. minimum, O. gratissimum, O. micranthum, O. selloi và O. tenuiflorum bằng phương pháp phân tích HPLC. Nghiên cứu đã chỉ ra Ocimum tenuiflorum là loài có hàm lượng acid ursolic trong lá cao nhất (lên đến 2,02%) trong các loài thuộc chi Ocimum L. Kết quả của nghiên cứu được trình bày ở bảng 1.1 [19]. + Năm 2013, Mangesh D và cộng sự đã khảo sát các yếu tố trong quá trình chiết xuất acid ursolic từ lá Ocimum sanctum L. bằng sóng siêu âm. Nghiên cứu đã xác định điều kiện chiết xuất tối ưu trên một mẻ 2 g dược liệu là sử dụng dung môi MeOH, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 1/30, nhiệt độ 45 0C, tần số sóng siêu âm 25 kHz và trong thời gian 12 phút, lượng acid ursolic được chiết ra ở điều kiện này là 1,647% (sử dụng phương pháp định lượng HPLC) [22]. 6 Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic trong lá của các loài thuộc chi Ocimum L. STT Loài Hàm lượng (%) 1 Ocimum americanum 1,03 2 Ocimum basilicum 0,29 3 Ocimum basilicum var. purpurascens 0,38 4 Ocimum basilicum var. minimum 0,27 5 Ocimum gratissimum 1,04 6 Ocimum micranthum 1,05 7 Ocimum selloi 0,45 8 Ocimum tenuiflorum 2,02 1.3 Tổng quan về acid ursolic 1.3.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa của acid ursolic Công thức phân tử : C30H48O3. Khối lượng phân tử : 456,7 (g/mol). Công thức cấu tạo (hình 1.1) Tên khoa học : 3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid. Hình dạng tinh thể : Kết tinh dạng tinh thể lăng trụ to từ cồn tuyệt đối, dạng kim từ cồn loãng. Nhiệt độ nóng chảy : 2840C. Độ tan : 1/88 (MeOH, kl/tt), 1/178 (EtOH, kl/tt), 1/35 (EtOH sôi, kl/tt), 1/140 (ether, kl/tt), 1/388 (chloroform, kl/tt), 1/1675 (CS2, kl/tt), tương đối tan trong aceton. Tan trong acid acetic băng nóng và dung dịch 2% NaOH trong EtOH. Không tan trong ether dầu hỏa. Độ tan trong nước : 1,02.10-4 mg/L ở 250C (dự đoán) [26]. 7 Hình 1.1 : CTCT của acid ursolic. 1.3.2 Tác dụng dược lý của acid ursolic 1.3.2.1 Tác dụng chống viêm Acid ursolic từ Pyrola rotundifolia có tác dụng chống viêm trong thử nghiệm gây phù chân bằng carageenan trên chuột [14]. Trong dịch chiết của Rosmarinus officinalis, acid ursolic là một trong các thành phần ngăn ngừa phù tai chuột trong thử nghiệm gây phù tai chuột bằng 12-otetradecanoylphorbol-13-acetat [11, 12]. Acid ursolic phân lập từ Plantago major thể hiện tác dụng chống viêm trong thử nghiệm in vitro sinh tổng hợp prostaglandin (có sự xúc tác của COX-2). Acid ursolic thể hiện tác dụng chống viêm đáng kể trên COX-2 với tỷ lệ chọn lọc COX2/COX-1 là 0,6 [13]. Trong thử nghiệm in vivo, tác dụng chống viêm của acid ursolic lớn hơn acid oleanolic và indomethacin, cụ thể là giá trị ID50 của acid ursolic, acid oleanolic và indomethacin lần lượt là 0,14/0,36/0,26 μmol/cm2, điều này cho thấy acid ursolic có tác dụng chống viêm mạnh hơn gần 2 lần so với indomethacin và gần 3 lần so với acid oleanolic [8]. 1.3.2.2 Tác dụng bảo vệ gan Acid ursolic có tác dụng bảo vệ gan trong các tổn thương gan do hóa chất, cũng như bệnh xơ hóa gan cấp tính, xơ gan, acid ursolic được sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với các tác nhân bảo vệ gan khác. Tác dụng bảo vệ gan của acid ursolic có thể do tác dụng chống oxy hóa và chống viêm của nó mang lại. Một trong những cơ 8 chế bảo vệ gan của acid ursolic là làm tăng lượng metallothionein - một protein giàu cystein có chức năng giống glutathion trong việc bảo vệ gan khỏi các độc tố, loại bỏ các kim loại nặng. Tuy nhiên đó không phải là cơ chế bảo vệ gan duy nhất của acid ursolic [16]. Bên cạnh tác dụng bảo vệ gan trong các thử nghiệm gây tổn thương gan bởi CCl4 hoặc D-galactosamin, acid ursolic còn có tác dụng ngăn ngừa tắc nghẽn đường mật trong thử nghiệm gây tắc nghẽn đường mật bởi acetaminophen [18]. 1.3.2.3 Tác dụng chống khối u Acid ursolic từ Eriobotrya japonica thể hiện tác dụng ức chế sự đột biến trong thử nghiệm sử dụng aflatoxin B1 trên Salmonella typhimurium [25]. Acid ursolic tách từ Rosmarinus officinalis có hiệu quả trong ức chế sự hình thành liên kết cộng hóa trị của B[a]P với DNA của da và ức chế sự hình thành khối u do B[a]P và 7,12-dimethyl-benz[a]anthracene [12]. 1.3.2.4 Tác dụng hạ lipid máu Acid ursolic giúp ngăn ngừa xơ vữa động mạch, giảm cholesterol máu (44%) và mức β-lipoprotein (50%) ở thỏ và chuột [21]. Acid ursolic ức chế hoạt động của enzym FAS (fatty acid synthase) với IC50 = 6,0 μg/mL. Tác dụng ức chế là do sự đối kháng của acid ursolic với acetyl-CoA và malonyl-CoA, nhưng không đối kháng với NaDPH [17]. 1.3.3 Acid ursolic là nguyên liệu ban đầu để bán tổng hợp một số hợp chất có tác dụng sinh học quan trọng Từ acid ursolic có thể bán tổng hợp nên các hợp chất có tiềm năng ức chế enzym glycogen phosphorylase để điều trị đái tháo đường type 2 [23], đặc biệt là acid corosolic (chỉ khác acid ursolic là có thêm 1 nhóm OH ở vị trí số 2-alpha). 9 Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic. X.Wen et al (2007) đã tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic theo sơ đồ [24] Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic. 1.3.4 Một số phương pháp phân lập acid ursolic 1.3.4.1 Phân lập acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki L.f.) Nguyễn Thị Ngọc Lan (2012) đã chiết tách acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki L.f.) làm chất đối chiếu phục vụ Công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm tra chất lượng dược liệu. Từ 2 kg dược liệu, tác giả đã chiết tách được 125 mg acid ursolic. Phương pháp chiết tách được trình bày ở hình 1.4 [6]. 10 Lá Hồng (2kg) MeOH (7L x 3 lần) Dịch chiết MeOH - MeOH Cao MeOH (170g) + 1,5L nước Dịch nước + DCM (2L x 3 lần) Dịch chiết nước Cắn DCM (80g) SK cột pha đảo MeOH-H2O 20/1, 10/1 Phân đoạn I-II 1/1 5/1 Phân đoạn III 8,5g Phân đoạn IV SK cột pha đảo MeOH-H2O 9/1 Phân đoạn III-1 1/1 5/1 Phân đoạn III-2 Phân đoạn III-3 SK cột pha đảo MeOH-H2O (4:1) Acid ursolic (125 mg) Hình 1.4 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki). 11 1.3.4.2 Phân lập acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica) Rosa T.S. Frighetto (2007) đã chiết tách và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica) bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC - high speed counter-current chromatography) [9]. Vỏ táo + n-hexan loại bỏ nhớt Vỏ táo đã loại bỏ nhớt + EtOH 96% trong 15h Cất thu hồi dung môi Cắn EtOH toàn phần Sắc ký cột silicagel pha thuận Rửa giải bằng CHCl3 Gom các phân đoạn có acid ursolic Tinh chế bằng phương pháp HSCCC Acid ursolic Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica). 12 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất Nguyên liệu : cành, lá Hương nhu tía được thu hái tại huyện Ba Vì, Hà Nội. Mẫu tươi được giám định tên khoa học ở bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội với mã số tiêu bản là HNIP/18039/13, tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản cây thuốc (HNIP) - trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1). Hóa chất : Dung môi dùng trong chiết xuất là dung môi công nghiệp đã cất lại. Các hóa chất, dung môi dùng cho kết tinh, tinh chế là dung môi tinh khiết của Trung Quốc. Acid ursolic đối chứng được cung cấp bởi Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu, được sử dụng làm chất đối chứng cho các thí nghiệm sau này. 2.1.2 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu - Các dụng cụ cần thiết trong quá trình thực nghiệm như bình nón, cốc có mỏ, ống nghiệm, pipet, ... - Thu hồi dung môi bằng máy cất quay Rotavapor R-200 của hãng BUCHI - Viện Dược liệu. - Xác định độ ẩm trên máy PRECISA HA60 - Viện Dược liệu. - Cân phân tích PRECISA - Viện Dược liệu. - Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn pha thuận - Viện Dược liệu. - Phổ hồng ngoại đo trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410 NICOLET Viện Hóa học. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C đo trên máy BRUKER AVANCE AM500 FTNMR - Viện Hóa học.