Tài liệu Nghiên cứu tạo giống gốc và thử nghiệm sản xuất vacxin vô hoạt phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn từ chủng virus phân lập tại việt nam (tt)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số : 9.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI, 2018 Công trình được hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: Phản biện 1: 1. PGS. TS. Nguyễn Bá Hiên 2. TS. Nguyễn Văn Cảm GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: GS.TS. Lê Thanh Hòa Viện Công nghệ sinh học Phản biện 3: PGS. TS. Phạm Công Hoạt Bộ Khoa học và Công nghệ Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi 08h0 ngày 28 tháng 12 năm 2018 Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) hay bệnh tai xanh được đặc trưng bởi những rối loạn sinh sản của lợn nái và những vấn đề về đường hô hấp ở lợn con và lợn trưởng thành (Meulenberg et al., 1993). Bệnh gây ra bởi virus PRRS, thuộc bộ Nidovirales, họ Arteriviridae, chi Arterivirus (Cavanagh, 1997). Virus PRRS được nhóm thành hai kiểu gen, châu Âu (type 1) và Bắc Mỹ (type 2), các dấu hiệu lâm sàng của nhiễm trùng đều giống nhau, nhưng các chủng phân lập lại khác nhau về độc lực ở động vật nhiễm bệnh (Halbur et al., 1995b) và khác nhau về đặc tính kháng nguyên, di truyền (Meng, 2000; Nelsen et al., 1999; Nelson et al., 1993). Dịch PRRS xuất hiện ở hầu hết các khu vực chăn nuôi lợn quy mô lớn trên khắp thế giới. Tổn thất hàng năm cho ngành chăn nuôi lợn ở Hoa Kỳ do PRRSV gây ra ước tính khoảng 664 triệu USD (Holtkamp et al., 2013). Đối với lợn nái, bệnh gây hậu quả nghiêm trọng như: lợn con sơ sinh yếu ớt, giảm số con sơ sinh sống sót/ổ, tình trạng bệnh âm ỉ, rối loạn sinh sản, động dục kéo dài, chậm động dục trở lại. Đối với đực giống, số lượng tinh dịch giảm, chất lượng tinh dịch kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con (Pejsak et al., 1997). Kháng thể kháng PRRSV lần đầu tiên được phát hiện ở Việt Nam năm 1997 trên một đàn lợn nhập từ Mỹ. Từ năm 2007 đến nay, PRRS liên tục xảy ra và bùng phát ở rộng khắp các tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi. Tình hình PRRS ngày càng phức tạp đòi hỏi sự chủ động trong phòng chống dịch, trong đó phương pháp phòng PRRS hiệu quả nhất là sử dụng vacxin. Tuy nhiên, sự đa dạng di truyền và thay đổi kháng nguyên của các chủng PRRSV là một trở ngại lớn trong việc phát triển một loại vacxin có hiệu quả để kiểm soát PRRS. Các vacxin sống đã được sử dụng phổ biến để kiểm soát PRRS vì chúng có khả năng bảo vệ tốt hơn so với vacxin đã vô hoạt hoặc các vacxin tái tổ hợp (Charerntantanakul, 2012; Hu and Zhang, 2014; Kim et al., 2011; Zuckermann et al., 2007). Nhưng ngày càng có nhiều quan ngại về sự an toàn của việc sử dụng vacxin sống vì sự hồi phục nhanh chóng độc lực của PRRSV trong quá trình sao chép ở lợn (Hu and Zhang, 2014; Mengeling et al., 2003; Pejsak et al., 1997). Hiện nay, trước tình hình nước ta đang phải tốn rất nhiều chi phí cho các loại vacxin ngoại nhập mà hiệu quả phòng bệnh chưa được như mong muốn. Nhằm chủ động trong nguồn cung cấp vacxin hiệu quả cao, an toàn và giảm chi phí nhập khẩu vacxin, thì việc sản xuất được vacxin vô hoạt từ chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam là việc làm cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. Để sản xuất được vacxin hiệu quả cần phải có chủng giống gốc đại diện cho các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam, do vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu này. Với mục tiêu lựa chọn được giống gốc, sản xuất được vacxin vô hoạt PRRS đạt tiêu chí an toàn, có hiệu lực cao để phòng bệnh cho lợn. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.2.1. Mục tiêu chung Sản xuất được vacxin vô hoạt PRRS có hiệu quả từ chủng virus phân lập tại Việt Nam. 1 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập từ lợn mắc PRRS ở Việt Nam, sử dụng làm giống gốc phục vụ sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS. Sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ giống gốc PRRS được tuyển chọn. Vacxin vô hoạt PRRS nghiên cứu sản xuất ra đạt các tiêu chí về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ lợn mắc PRRSở Việt Nam. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu Phạm vi về không gian nghiên cứu: Các chủng virus PRRS được phân lập từ lợn mắc PRRS thu thập tại các tỉnh: Hà Nội, Thái Bình, Nam Định, Hưng Yên, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, TP Hồ Chí Minh, Tiền Giang, Cần Thơ. Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y và phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện từ 2014-2017 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài lần đầu tiên tuyển chọn được chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam để làm giống gốc sử dụng cho sản xuất vacxin vô hoạt phòng PRRS cho lợn. Giống gốc PRRS được thẩm định tại cơ quan thú y có thẩm quyền và đạt các tiêu chí vô trùng, thuần khiết, có hiệu giá cao, có khả năng kích thích miễn dịch tốt, kháng thể do vacxin tạo ra có thể trung hòa được các chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam. Đề tài của luận án đã đưa ra được một quy trình phân lập, sàng lọc và tuyển chọn giống gốc. Trên cơ sở này, có thể áp dụng để tạo ra một chủng Master seed mới thay thế những chủng cũ không còn đáp ứng tính tương đồng kháng nguyên. Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm thành công vacxin vô hoạt PRRS từ chủng virus thực địa, đây là vacxin vô hoạt đầu tiên về PRRS của Việt Nam được nghiên cứu sản xuất. Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao để sản xuất vacxin phòng PRRS cho đàn lợn, giúp người chăn nuôi giảm thiệt hại kinh tế do PRRS gây ra. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài Những kỹ thuật, quy trình được áp dụng trong đề tài góp phần nâng cao năng lực nghiên cứu cho người làm trong lĩnh vực thú y. Các kết quả nghiên cứu phản ảnh đầy đủ về đặc điểm sinh học, sinh học phân tử, đặc tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch của các chủng virus PRRS đang lưu hành ở Việt Nam. Cung cấp các thông tin tham khảo, tham chiếu cho các nhà khoa học nghiên cứu về virus PRRS ở Việt Nam cũng như trên thế giới. 2 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Giống gốc được tuyển chọn là chủng virus PRRS đại diện cho các chủng virus đang lưu hành ở Việt Nam có thể sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng, đa dòng, phục vụ sản xuất kháng thể trị bệnh cũng như kháng thể trong chẩn đoán bệnh. Giống gốc có thể sử dụng để sản xuất kháng nguyên trong chế tạo Kít ELISA chẩn đoán bệnh, Kít phát hiện nhanh bệnh, góp phần vào công cuộc phòng và chống PRRS cho toàn ngành chăn nuôi. Đề tài đã nghiên cứu sản xuất thành công vacxin vô hoạt PRRS đạt các chỉ tiêu về vô trùng, thuần khiết, an toàn và hiệu lực, đây là cơ sở quan trọng để ứng dụng nghiên cứu sản xuất các loại vacxin virus khác giúp nâng cao năng lực sản xuất vacxin vật nuôi của ngành Thú y nước nhà, hạn chế nhập khẩu vacxin. Vacxin vô hoạt PRRS có thể chuyển giao sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo ra một vacxin có hiệu quả và rẻ so với các vacxin nhập ngoại trên thị trường, góp phần khống chế dịch bệnh, giảm thiệt hại cho ngành chăn nuôi. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. LỊCH SỬ VÀ TÌNH HÌNH DỊCH PRRS Ở LỢN 2.1.1. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1987 với tên là "bệnh bí hiểm" (Mystery swine disease) bởi tính tự nhiên khó hiểu của bệnh nguyên. Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota đã nhất trí dùng tên PRRS và đã được Tổ chức Thú y thế giới công nhận chính thức gọi là "Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên lợn" (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome-PRRS), căn nguyên bệnh được gọi là virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus PRRSV). 2.1.2. Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam Lần đầu tiên trong lịch sử vào năm 1997, kháng thể kháng PRRSV được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh miền Nam. Kết quả kiểm tra thấy, 10/51 lợn giống nhập khẩu có huyết thanh dương tính với PRRS. Toàn bộ số lợn này đã được xử lý vào thời gian đó. Tuy nhiên, trong những năm tiếp theo, các nghiên cứu về bệnh trên những trại lợn giống tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau từ 1,3% cho tới 68,29% (Cục Thú y, 2008). 2.2. CĂN BỆNH 2.2.1. Cấu trúc virus PRRS Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Hạt virus thường có hình oval với đường kính xấp xỉ 60nm và bề mặt có gai được cấu tạo từ phức hợp protein màng. Virus PRRS là virus sợi đơn dương với kích thước phân tử 15,1- 15,5 kb (Dokland, 2010). Genome của virus PRRS có kích thước khoảng 15kb, gồm ít nhất 10 khung đọc mở ORF (open reading frames): ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF5a, ORF6, ORF7 mã hóa cho các protein cấu trúc và phi cấu trúc. 3 2.2.2. Phân loại virus PRRS Hiện nay, PRRSV đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn gốc từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA). Việc so sánh chuỗi gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa 2 nhóm này. 2.2.3. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS Về mặt độc lực, người ta thấy PRRSV tồn tại dưới 2 dạng: ▪ Dạng cổ điển: có độc lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1% - 5% trong tổng đàn. ▪ Dạng biến thể độc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn. 2.3. TRUYỀN NHIỄM HỌC 2.3.1. Loài vật mắc bệnh Lợn ở mọi lứa tuổi, người và các động vật khác không mắc bệnh, tuy nhiên trong các loài thuỷ cầm chân màng, vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm với virus. 2.3.2. Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây Virus có trong dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu của lợn ốm, hoặc mang trùng và phát tán ra môi trường. Tinh dịch của lợn đực giống cũng được xác định là nguồn phát tán mầm bệnh. 2.3.3. Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch 2.3.3.1. Cơ chế sinh bệnh Virus có ái lực cao với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào phế nang. Vì vậy, virus nhân lên trong đại thực bào, sau đó giết chết đại thực bào. Có tới 40% đại thực bào bị phá hủy. PRRSV loại bỏ phần lớn cơ chế bảo vệ của cơ thể, cho phép vi khuẩn, virus khác tăng sinh và gây hại. 2.3.3.2. Phương thức truyền lây Bệnh có thể lây lan trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian bị nhiễm virus như: dụng cụ, thiết bị chăn nuôi; các phương tiện vận chuyển; các loài côn trùng; các loài có vú khác và gia cầm (Tô Long Thành, 2007). 2.3.3.3. Đáp ứng miễn dịch Về khả năng bảo hộ chéo của các type PRRSV vacxin với các type PRRSV khác cũng còn nhiều ý kiến chưa thống nhất. Kovacs and Schagemann (2003) báo cáo rằng vacxin sống Ingelvac- PRRS MLV (chủng Bắc Mỹ) có khả năng bảo hộ chéo khi công cường độc bằng virus PRRS chủng châu Âu. Tài liệu hướng dẫn sử dụng vacxin JXA1R (Ngô Thanh Long, 2011) cũng cho biết, vacxin này (chứa virus Bắc Mỹ biến đổi) có khả năng bảo hộ lợn phòng PRRS do chủng Bắc Mỹ cổ điển gây ra. 2.4. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH 2.4.1. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PRRS rất thay đổi và phụ thuộc vào chủng virus, trạng thái miễn dịch của đàn, điều kiện quản lý chăm sóc. Thời gian nung bệnh từ 3-5 ngày. Các dấu hiệu đầu tiên là bỏ ăn, sốt, xanh da. Các triệu chứng tiếp theo tùy thuộc vào tuổi lợn và giai đoạn mang thai (Tô Long Thành, 2007). 4 2.4.2. Bệnh tích Bệnh tích biến đổi chủ yếu ở phổi. Thuỳ phổi bị bệnh màu đỏ xám, có mủ và đặc chắc (nhục hoá). Bề mặt cắt ngang của thuỳ phổi lồi ra, khô và xuất hiện những nốt loét trên các cơ quan nội tạng (Lê Văn Năm, 2007). 2.5. CHẨN ĐOÁN VÀ PHÒNG TRỊ BỆNH 2.5.1. Chẩn đoán 2.5.1.1. Chẩn đoán lâm sàng Chẩn đoán lâm sàng dựa vào hai nhóm triệu chứng: + Triệu chứng đường sinh sản: Trong giai đoạn đầu của ổ dịch có thể thấy hiện tượng sảy thai ở cuối thời kỳ mang thai, lợn nái đẻ non, thai yếu, thai chết lưu hoặc thai gỗ, lợn con đẻ ra yếu, lợn chết trước khi cai sữa. + Triệu chứng đường hô hấp: Lợn có triệu chứng viêm phổi và lây lan rất nhanh trong đàn. 2.5.1.2. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm + Phân lập virus trên một số tế bào: Tế bào phế nang của lợn, tế bào MA- 104, CL 2621, CRL-17171, MARC-145 ... + Phương pháp bệnh lý miễn dịch. + Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên. + Phương pháp nhân gen (PCR). + Phương pháp lai phân tử tại chỗ (institu hybridization). - Giải trình tự gen NSP2 và ORF5 của PRRSV. - Gây bệnh thực nghiệm: Sử dụng lợn con 21 ngày tuổi trong cùng một đàn; không mang PRRSV (PRRSV-Ag) và không có kháng thể PRRSV (PRRSV-Ab); tiêm cơ 0,5 ml/con; nhỏ mũi 1 ml/con. 2.5.2. Các biện pháp phòng trị bệnh 2.5.2.1. Điều trị PRRS Hiện nay chưa có thuốc đặc trị với PRRS, để làm giảm thiệt hại của bệnh, chủ yếu theo hướng nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi, chữa các triệu chứng lâm sàng, giảm nhẹ và tập trung vào điều trị các bệnh kế phát. 2.5.2.2. Một số chế phẩm vacxin PRRS được dùng để phòng bệnh hiện nay Hiện nay, tại Việt Nam có 8 loại vacxin PRRS đã và đang được phép lưu hành. 2.6. GIỐNG GỐC TRONG SẢN XUẤT VACXIN 2.6.1. Định nghĩa Giống gốc (Master seed - MS) là một lượng virrus cụ thể đủ lớn mà sự thuần khiết, an toàn và tính kháng nguyên của chính cũng như của các thế hệ sau đã được thử nghiệm, chứng minh và được dùng làm giống để chế tạo vacxin. 5 2.6.2. Cách chế tạo giống gốc Việc chế tạo giống gốc tùy thuộc vào từng loại virus, cách quản lý của mỗi quốc gia, phương pháp chế tạo vacxin và sự sáng tạo của các nhà khoa học. Về lý thuyết, bất kỳ virus nào cũng có thể dùng để chế tạo giống gốc. 2.6.3. Cách quản lý giống gốc Các nước phương Tây đi đầu trong việc đưa ra khái niệm giống gốc và quản lý giống gốc. Việc này bắt nguồn từ phương pháp quản lý trên căn bản của sở hữu tư nhân và kéo theo nó là việc đăng ký bản quyền. Nói cách khác, việc sản xuất vacxin là của các hãng tư nhân và chính họ đòi hỏi nhà nước sự bảo hộ bản quyền cho họ. 2.6.4. Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phòng thí nghiệm 2.6.4.1. Phương pháp cấy chuyển virus PRRS liên tục trên tế bào MARC-145 Virus PRRS rất thích hợp phát triển trên tế bào MARC-145, sau khi cấy chuyển có thể bảo quản ở nhiệt độ thích hợp. Phương pháp này chỉ được lặp lại trong thời hạn nhất định, thường được áp dụng trong các trường hợp dùng liên tục virus PRRS để nghiên cứu và làm thí nghiệm (thường chỉ cấy chuyển 4 đời sau đó sẽ chuyển thành giống sản xuất - working seed). 2.6.4.2. Phương pháp đông khô virus Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau trong đó có virus PRRS. 2.6.4.3. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng mẫu lớn. Thông thường theo phương pháp này, virus có thể được bảo quản từ 10-20 năm. 2.6.4.4. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì virus được bảo quản trong môi trường dịch thể ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80°C). 2.7. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VACXIN PHÒNG PRRS 2.7.1. Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus Vacxin vô hoạt thường được sử dụng nhằm phòng chống bệnh tai xanh ở các đàn lợn nái, hoặc ở các trại lợn chưa từng xuất hiện bệnh tai xanh. Việc sản xuất vacxin vô hoạt được thực hiện bằng cách phân lập và nuôi cấy các chủng PRRSV thực địa trong môi trường tế bào và tiến hành vô hoạt chúng bằng một số chất vô hoạt như BEI, formaline hoặc β propiolactone . 2.7.2. Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trường tế bào Về nguyên lý chung, để tạo được chủng virus PRRS nhược độc dùng làm vacxin, các chủng virus PRRS cường độc được cấy truyền nhiều đời trên môi trường tế bào. Cụ thể, để làm chủng virus PRRS cường độc thành chủng virus PRRS nhược độc, công ty Boehringer–Ingelheim Corp đã cấy truyền 37 đời, công ty Hippra Corp đã cấy truyền 20 đời. 6 2.7.3. Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới Vacxin DNA, sử dụng các khung đọc mở, từ ORF1 cho đến ORF7 để chế tạo vacxin. Vacxin dưới đơn vị (subunit): dùng protein của virus để chế vacxin, ví dụ như dùng GP5. Vacxin peptide tổng hợp: GP5.Vacxin vector: dùng nhiều loại virus, vi khuẩn làm vector tái tổ hợp. Tất cả các vacxin thử nghiệm này đều không cho kết quả vượt trội nào, đều chưa đạt được mục tiêu phòng bệnh của một vacxin. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm, Khu nuôi động vật thí nghiệm - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Thời gian nghiên cứu từ năm 2014 đến năm 2017. 3.2. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Đối tượng nghiên cứu Lợn nghi mắc PRRS, các chủng virus PRRS cường độc phân lập từ các lợn mắc PRRS ở Việt Nam. 3.2.2. Vật liệu nghiên cứu Máy móc, thiết bị được sử dụng trong đề tài : Box an toàn sinh học Cấp II (Esco), tủ ấm CO2 (Memmert), kính hiển vi soi ngược (Leica), máy PCR (Biorad), máy giải trình tự gen (Backman Counter), máy điện di, máy votex (IKa), máy ly tâm (eppendorf), tủ -80oC (Sanyo), máy đồng hóa tạo nhũ, hệ thống Bioreactor, máy lọc tiếp tuyến, máy đọc ELISA (Bioteck), kính hiển vi thường (Zeiss). Dụng cụ: Pipet (Eppendorf), đầu típ các loại (Corning), bình nuôi cấy tế bào T25, T75, T225 (Corning), màng lọc (corning), khay 96 (Corning), ống eppendorf, ống ly tâm 15ml, 50ml (corning), bơm tiêm, găng tay, khẩu trang. Hóa chất: môi trường nuôi cấy tế bào DMEM (Gibco), tế bào dòng MARC-145, kít tách chiết RNA, DNA (Qiagen), Kít PCR/RT-PCR (Invitrogen), kít Realtime - PCR (Invitrogen), kít giải trình tự gen (Backman Counter), Kít ELISA (Idexx), hóa chất cho nuôi cấy tế bào, hóa chất cho kỹ thuật IPMA, hóa chất vô hoạt virus (Merk), nhũ dầu (Seppic). 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu - Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV - Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phương pháp mổ khám Trong nghiên cứu này, quá trình mổ khám được thực hiện theo TCVN 8402:2010. 7 3.4.2. Phương pháp RT – PCR Quy trình tách chiết RNA của virus dùng KIT của hãng Qiagen. Sản phẩm của phản ứng RT - PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di. Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide hoặc SYBR green trong khoảng 5 đến 7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả. 3.4.3. Phương pháp làm tiêu bản vi thể Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể, lấy mẫu ngâm trong formol trung tính 10% để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) của Bộ môn Bệnh lý Thú y. 3.4.4. Phương pháp nuôi cấy tế bào Tế bào MARC-145 được nuôi cấy trong môi trường đầy đủ DMEM, 10% FBS. 3.4.5. Phương pháp nhân virus PRRS Tiến hành nhân virus trên tế bào MARC-145 khi tế bào được nuôi cấy trong bình nuôi T25 có độ che phủ đáy bình 60 - 70%. Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ và rửa tế bào 2 lần bằng PBS1X. Bổ sung 0,5ml virus gốc/T25. Ủ virus và tế bào trong 1h ở 370C. Sau khi ủ loại bỏ dịch ủ và bổ sung 5 ml môi trường duy trì DMEM 2% FBS. Nuôi virus trong tủ ấm 370C, 5% CO2, quan sát biến đổi bệnh tích tế bào MARC-145 dưới kính hiển vi soi ngược sau 24h, 48h, 60h, 72h. Thu virus khi bệnh tích tế bào đạt 80%. 3.4.6. Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID50 được xác định theo phương pháp của Spearman Kaber. Lg TCID50 = (Xo + d/2) - d × (∑ri/n) Trong đó: Xo là lg của bậc pha loãng virus cao nhất d: là lg của bậc pha loãng ri: là số giếng tế bào âm tính ở mỗi bậc pha loãng n: là số giếng tế bào được gây nhiễm ở mỗi bậc pha loãng. 3.4.7. Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus Tế bào MARC-145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5×104 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên. Virus PRRS được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0,01. Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0,5ml PBS. Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng. Virus được thu từ dịch nổi và phần tế bào ở các thời điểm 24, 48, 60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus. Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus. Đường biểu biễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus. 8 3.4.8. Phương pháp giải trình tự gen Sử dụng máy giải trình tự gen tự động Beckman Coulter CEQ 8000 (Mỹ) thí nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Nguyên tắc chung của máy giải trình tự gen tự động là dựa theo cơ sở của phương pháp Sanger. Khi sợi DNA được tổng hợp sẽ sử dụng các nucleotide có gắn thuốc nhuộm huỳnh quang, các nucleotide khác nhau tiếp nhận thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau khi đọc bằng tia laser cho hiển thị màu tương ứng, trong đó Adenin cho màu đỏ, Thymine cho màu xanh, Guanine cho màu xanh lá cây, Cytosine cho màu đen. 3.4.9. Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein Hỗn hợp dịch kháng nguyên thu được để trong khay đá vảy để đảm bảo chất lượng kháng nguyên, ly tâm ở tốc độ cao 35.000 vòng/4oC/2 giờ để thu cặn virus. Lấy cặn thu được hoà tan trong PBS 1X được hỗn dịch kháng nguyên. Hỗn dịch này sẽ được ly tâm tốc độ cao (35.000 vòng/4oC/2 giờ) qua gradient đường với các nồng độ khác nhau (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%). Thu vạch band xuất hiện sau khi ly tâm, đây chính là kháng nguyên virus. 3.4.10. Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột Hỗn hợp kháng nguyên/nhũ dầu với tỷ lệ 1/1,5. Kháng nguyên gốc được pha trong PBS 1x theo tỷ lệ tùy mẫu kháng nguyên. Nhũ dầu (Adjuvant) loại complete hoặc incomplete, loại complete dùng cho lần gây nhiễm virus đầu tiên với từng lô thí nghiệm, loại incomplete thì dùng cho những lần gây nhiễm tiếp theo (lần 2, lần 3). Tiêm dưới da vùng lưng, hông (đối với chuột lang) của từng chuột thí nghiệm, phân bố tiêm ở 2, 3 vị trí khác nhau với lượng kháng nguyên đã chuẩn bị. Sau khi tiêm thì tiến hành đánh dấu và ghi chép lại để theo dõi. Hai tuần sau, gây nhiễm lần 2 để tăng cường đáp ứng miễn dịch trên chuột, hai tuần tiếp theo gây nhiễm lần 3. Cuối cùng sau 2 tuần tiếp thì tiến hành gây mê, lấy máu, thu kháng thể và mổ khám chuột thí nghiệm. 3.4.11. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng) Tiến hành pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 và sử dụng virus trung hòa ở nồng độ 100TCID50/mL. Huyết thanh đã pha loãng trộn với virus và giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, mỗi độ pha loãng gây nhiễm cho 5 giếng tế bào MARC-145. Đọc kết quả: hiện tượng trung hòa được xác định theo bệnh tích trên tế bào một lớp cảm thụ. Virus được trung hòa khi không có bệnh tích tế bào trên tế bào cảm thụ MARC-145. Virus không được trung hòa khi xuất hiện bệnh tích tế bào trên giếng tế bào MARC-145. 3.4.12. Phương pháp IPMA Phát hiện kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh bằng phản ứng kháng nguyên kháng thể trên môi trường tế bào MARC-145. 9 3.4.13. Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (Master seed và Working seed) Phương pháp kiểm tra Mỗi mẫu giống gốc hoặc virus được cấy vào các loại môi trường thạch thường, nước thịt, thạch máu, nước thịt gan yếm khí và thạch nấm. Mỗi loại môi trường cấy 4 ống/mẫu. Đến cuối quá trình theo dõi mà tất cả các ống thử đều trong suốt, mầu sắc môi trường không đổi, kết quả là âm tính. 3.4.14. Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (Master seed và Workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện các loại virus Lở mồm long móng, PCV2, dịch tả lợn, PED, TGE. 3.4.15. Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor Virus PRRS được nhân sinh khối lớn trên hệ thống túi nuôi có điều chỉnh nhiệt độ và tốc độ lắc. 3.4.16. Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng máy lọc tiếp tuyến Virus sau khi được nhân lên với số lượng lớn được cô đặc bằng máy lọc tiếp tuyến. Sau cô đặc tiến hành xác định lại hiệu giá virus. Mỗi một lần cô đặc có thể lọc tiếp tuyến tối đa một lít virus, sau khi lọc thu được 500µl virus đã cô đặc và hiệu giá virus thường tăng 101 so với trước lọc. 3.4.17. Phương pháp vô hoạt virus Virus vacxin PRRS thu hoạch từ môi trường tế bào Marc 145 được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng formalin ở nồng độ thích hợp nhất. Dung dịch virus sau khi vô hoạt được đánh giá kết quả vô hoạt theo quy trình kiểm tra sau vô hoạt nêu dưới đây. 3.4.18. Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt Sau khi trung hoà lấy 0,1 ml dung dịch virus đã vô hoạt cấy vào môi trường tế bào MARC-145, để ở 370C và theo dõi bệnh tích tế bào trong 12h, 24h, 36h, 48h, 60h, 72h. Nếu mẫu dung dịch virus nào có gây bệnh tích tế bào thí có nghĩa là virus chưa được vô hoạt hoàn toàn cần tiến hành vô hoạt lại. Mẫu nào không gây bệnh tích tế bào có nghĩa là virus đã được vô hoạt cần lặp lại thí nghiệm lần 2 để có kết luận chính thức. 3.4.19. Phương pháp nhũ hóa vacxin Sau khi vô hoạt thành công tiến hành phối trộn hỗn dịch virus đã vô hoạt với chất bổ trợ. Hỗn dịch virus vacxin được phối trộn với chất bổ trợ theo tỉ lệ 1:1. Đồng hóa hỗn hợp này trong máy trộn tá dược (máy đồng hóa T18D của hãng IKA) ở 40C trong thời gian tối thiểu 30 phút. Kiểm tra hỗn hợp vacxin vô hoạt bằng cách để ở 20C -80C qua đêm. Hỗn hợp đồng nhất, không phân lớp, không lắng cặn không tách nước là đạt yêu cầu. Nếu hỗn hợp vẫn tách nước và phân lớp thì tiếp tục chạy máy đồng hóa cho đến khi đạt. 3.4.20. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin Theo TCVN8684:2011 3.4.21. Kiểm tra chỉ tiêu an toàn Theo TCVN8684:2011 10 3.4.22. Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin Theo TCVN8684:2011 3.4.23. Phương pháp Realtime RT-PCR Thực hiện phản ứng Realtime RT-PCR theo TCVN 8400-21:2014. 3.4.24. Phương pháp ELISA - Các bước tiến hành theo hướng dẫn của bộ Kit Đọc kết quả: Kết quả: SP ≥ 0,4: Dương tính SP < 0,4: Âm tính 3.4.25. Xử lý số liệu Phân tích xác nhận chuỗi gen thu được thông qua chương trình Blast trên Ngân hàng gen (GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Xác định sự tương đồng về nucleotide của phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu bằng phần mềm Bioedit Version 7.2.5. Xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của chủng virus thu nhận được bằng phần mềm MEGA Version 6.0. Các số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2010. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỂU HIỆN BỆNH LÝ CỦA LỢN MẮC PRRS 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh phẩm Để phục vụ việc tuyển chọn virus PRRS làm giống sản xuất vacxin, chúng tôi tiến hành thu thập mẫu lợn nghi mắc PRRS từ thực địa. Kết quả thu được 57 lợn nghi mắc PRRS. Kết quả cho thấy các nhóm lợn được nghiên cứu đều biểu hiện các triệu chứng như sốt cao, bỏ ăn, thân ửng đỏ, tiêu chảy, tai thâm tím, chảy nước mũi. 4.1.2. Kết quả chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR Từ 57 lợn được thu thập, để khẳng định chính xác lợn mắc PRRS chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT- PCR. Kết quả chẩn đoán PRRS bằng kỹ thuật RT - PCR được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS TT 1 2 3 4 5 Nhóm lợn Lợn con theo mẹ Lợn sau cai sữa Lợn choai Nái mang thai Nái nuôi con Tổng số Số lượng (con) Dương tính (con) Tỉ lệ dương tính (%) 13 10 11 8 15 57 07 06 06 05 09 33 53,8 60,0 54,5 62,5 60,0 57,9 11 Kết quả bảng 4.1 cho thấy, có 33 mẫu lợn thu thập tại địa phương dương tính với virus PRRS, chiếm tỷ lệ 57,9 %; các mẫu dương tính phân bố ở cả 5 đối tượng lợn. 4.1.3. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể Bằng phương pháp mổ khám toàn diện đối với các mẫu lợn thu thập, mô tả và ghi chép chi tiết từng trường hợp, so sánh với kết quả chẩn đoán RT-PCR, tất cả các trường hợp dương tính với PRRS đều có các dấu hiệu bệnh tích điển hình giống nhau ở các khí quan. Kết quả trình bày tại bảng 4.2. Bảng 4.2. Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS Số con Số con có Tỉ lệ theo dõi biểu hiện (%) 1 Viêm màng phổi 33 18 54,5 2 Phổi xuất huyết 33 33 100,0 3 Viêm phổi hóa mủ 33 16 48,5 4 Phổi hoại tử 33 2 6,1 5 Phổi nhục hóa 33 2 6,1 6 Mặt cắt phổi nhớt 33 26 78,8 7 Phổi tụ máu 33 21 63,6 8 Phù phổi 33 5 15,2 9 Phổi có các hạt khác thường 33 0 39,4 10 Hạch phổi có bệnh tích 33 33 0,0 Phổi xuất huyết tạo ra các đám, các mảng loang lổ, hình dạng phổi bẹp áp sát vào khung sườn, rìa phổi có dịch nhầy đặc giống như đờm, mặt cắt phổi có mủ, nhiều lợn bệnh có bệnh tích viêm phổi dính sườn. STT Bệnh tích 4.1.4. Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể Nghiên cứu các biến đổi vi thể, nhuộm và đọc tiêu bản trên kính hiển vi, thu được kết quả trình bày trên bảng 4.3. Bảng 4.3. Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi và hạch amidan của lợn mắc PRRS Phổi Hạch phổi Hạch amidan Số Số Số Số Số Số mẫu mẫu mẫu Bệnh tích mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ có có có nghiên (%) nghiên (%) nghiên (%) biểu biểu biểu cứu cứu cứu hiện hiện hiện Sung huyết 33 33 100,0 33 33 100,0 33 15 45,5 Xuất huyết 33 33 100,0 33 33 100,0 33 13 39,4 Thâm nhiễm tế bào viêm 33 32 97,0 33 12 36,4 33 2 6,1 Thoái hóa tế bào 33 13 39,4 33 10 30,3 33 15 45,5 Huyết khối trong lòng mạch 33 30 90,9 33 3 9,1 33 0 0,0 Qua bảng 4.3 cho thấy bệnh lý vi thể ở phổi, hạch phổi rất rõ ràng. 100% các tiêu bản đọc thấy sung huyết và xuất huyết. Các phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm. Sự thâm nhiễm tế bào viêm ở phổi có tỷ lệ rất cao. 12 4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG GIỐNG GỐC PRRS 4.2.1. Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 4.2.1.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được Sử dụng dòng tế bào MARC-145 và môi trường nuôi cấy DMEM cho phân lập virus PRRS, chúng tôi tiến hành phân lập toàn bộ mẫu phổi và hạch phổi của các mẫu dương tính với virus PRRS được xác định bằng phương pháp RT-PCR. Kết quả phân lập virus PRRS được trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 Địa phương phân lập Số lượng chủng virus phân lập được Hà Nội 6 Hưng Yên 4 Thái Bình 2 Nam Định 4 Ninh Bình 2 Thanh Hoá 6 Nghệ An 3 TP Hồ Chí Minh 2 Tiền Giang 1 Cần Thơ 3 Tổng 33 Như vậy, từ các ca bệnh dương tính với PRRS, chúng tôi đã phân lập được các virus PRRS gây bệnh tương ứng. Cùng với việc phân lập virus PRRS, chúng tôi cũng theo dõi và ghi chép thời điểm xuất hiện bệnh tích tế bào và thời điểm tế bào bị virus phá hủy hoàn toàn. Kết quả về khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được trình bày ở bảng 4.5. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Bảng 4.5. Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được TT Thời gian Xuất hiện Tế bào bị bệnh tích phá hủy tế bào hoàn toàn Kí hiệu chủng virus phân lập 008HN, 012HY, 049HY 122NĐ, 010TB, 012NA, 052TH, 042TP, 072TG, 082CT 011HN, 032TB, 113HY 046NB, 42TH, 048CT, 2 48h 96h 092CT 3 48h 108h 023NĐ, 135TP 016HN, 041HN, 063HN, 092NĐ, 063NB, 031TH, 4 60h 96h 061TH, 101TH, 115HY 5 60h 108h 022HN, 055NĐ, 083TH162NA, 102NA Qua bảng kết quả bảng 4.5 thấy rằng, virus gây bệnh tích tế bào sớm nhất ở 48h sau gây nhiễm và bệnh tích tế bào có thể xuất hiện muộn hơn là 60h sau khi gây 1 48h 84h 13 nhiễm virus. Tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 84h đến 108h sau gây nhiễm tùy thuộc vào từng chủng virus. 4.2.1.2. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng virus PRRS phân lập được Sau quá trình phân lập virus ban đầu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hồ sơ thu mẫu (theo các vùng địa lý khác nhau và các thời điểm thu mẫu khác nhau), triệu chứng ca bệnh, các biến đổi đại thể, biến đổi vi thể điển hình, khả năng nhân lên trên môi trường tế bào, đã sơ bộ lựa chọn được 20 chủng virus PRRS phân lập đại diện khác nhau để tiến hành xác định hiệu giá virus. Tiến hành xác định hiệu giá virus (TCID50) của các chủng PRRS phân lập được theo phương pháp đã trình bày ở phần II. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.6. Bảng 4.6. Kết quả xác định hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được TT Chủng virus Hiệu giá virus TCID50/ml 1 041HN 6,67 ×103 2 011HN 1,44 ×104 3 008HN 3,16 × 105 4 022HN 6,67 ×102 5 049HY 1,26 × 106 6 012HY 6,67 × 105 7 010TB 3,16 × 106 8 032TB 3,16 ×104 9 092NĐ 3,16 ×104 10 122NĐ 1,44 × 105 11 052TH 6,67 × 105 12 031TH 6,67 ×104 13 061TH 3,16 ×103 14 042TH 1,44 ×102 15 012NA 1,96 × 106 16 162NA 6,67×104 17 102NA 1,44 ×102 18 042TP 1,44 × 105 19 072TG 6,67 × 105 20 082CT 3,16 × 104 Kết quả xác định hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu cho thấy, các chủng virus PRRS phân lập có hiệu giá TCID50 giao động từ 102 đến 106. Trong đó, hiệu giá thấp nhất là chủng virus 102NA TCID50 đạt 1,44 × 102 và cao nhất là chủng virus 010TB TCID50 đạt 3,16 × 106. 4.2.1.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng virus PRRS phân lập được Chúng tôi đã chọn ra được 10 chủng virus PRRS có hiệu giá tương đối cao, có khả năng phát triển và nhân lên tốt trên môi trường tế bào MARC-145 để tiếp tục nghiên 14 cứu quy luật nhân lên. Kết quả các chủng virus PRRS được lựa chọn và nghiên cứu quy luật phát triển, nhân lên được trình bày ở bảng 4.7. Nghiên cứu quy luật nhân lên của 10 chủng virus PRRS thấy rằng, sự nhân lên của virus trong môi trường nuôi cấy là một quá trình liên tục. Trong đó có thời điểm virus có hàm lượng thấp, có thời điểm virus đạt hàm lượng cao. Có thể chia quy luật nhân lên của virus PRRS trong môi trường nuôi cấy thành 2 pha phát triển. Pha một, virus bắt đầu xâm nhập và nhân lên trong tế bào cảm thụ và gây bệnh tích tế bào cho đến khi tế bào bị phá hủy 80%, lúc này hiệu giá virus đạt cao nhất (đỉnh sinh trưởng của virus), pha này thường bắt đầu từ 24h sau gây nhiễm và kéo dài đến 60h hoặc 72h sau gây nhiễm. Pha hai, virus đã phá hủy gần như 100% tế bào cảm thụ và giải phóng ra môi trường, lúc này hiệu giá virus bắt đầu giảm, pha này thường bắt đầu từ 84h đến 96h sau gây nhiễm. Cụ thể 10 chủng virus nghiên cứu đều đạt hiệu giá cao nhất ở 72h sau gây nhiễm, sau đó giảm dần. Bảng 4.7. Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên TT Chủng virus Hiệu giá virus TCID50/ml 1 008HN 3,16 × 105 2 049HY 1,26 × 106 3 012HY 6,67 × 105 4 010TB 3,16 × 106 5 122NĐ 1,44 × 105 6 052TH 6,67 × 105 7 012NA 1,96 × 106 8 042TP 1,44 × 105 9 072TG 6,67 × 105 10 082CT 3,16 × 105 4.2.2. Kết quả nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam 4.2.2.1. Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển Từ lô virus gốc (P0 - Pasage 0), chúng tôi cấy chuyển qua 5 đời liên tiếp trên tế bào MARC-145. So sánh khả năng nhân lên của đời P0 và P5 cho thấy, quá trình xâm nhập, nhân lên và hủy hoại tế bào cảm thụ của các chủng virus PRRS nghiên cứu là tương đối giống nhau và đồng đều. Virus bắt đầu hủy hoại tế bào ở thời điểm 48 giờ sau khi gây nhiễm và đạt mức độ phá hủy cao ở 72 giờ sau gây nhiễm, sau 84 giờ gây nhiễm thì tế bào cảm thụ bị phá hủy hoàn toàn. Tỉ lệ tế bào bị phá hủy tại các thời điểm 48h, 72h và 84h của 10 chủng virus nghiên cứu khác nhau không đáng kể (chệnh lệch 5%). 4.2.2.2. Kết quả xác định hiệu giá virus của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển Các chủng virus PRRS lựa chọn nghiên cứu được tiến hành xác định hiệu giá qua 5 đời cấy chuyển. Kết quả xác định hiệu giá virus được trình bày ở bảng 4.8. 15 Qua bảng kết quả thấy rằng hiệu giá của các chủng virus nghiên cứu khá cao đạt từ 1,26 × 105TCID 50/ml đến 7,12 × 106TCID 50/ml và tương đối ổn định ở các đời cấy chuyển. Cụ thể, hiệu giá cao nhất là chủng virus 010TB đạt 3,16 × 106 TCID 50/ml, hiệu giá thấp nhất là chủng 112NĐ đạt 1,44 × 105 TCID 50/ml. Các chủng virus nghiên cứu có hiệu giá virus không thay đổi nhiều (không giảm Lg) qua đời cấy chuyển P1 và P5, đây là đặc tính rất quan trọng của một giống gốc để có thể đảm bảo trong quá trình nhân giống sản xuất, hàm lượng virus vẫn được giữ nguyên qua các lô giống khác nhau. Trong 10 chủng virus nghiên cứu, chủng virus 010TB, 012NA, 049HY có hiệu giá lần lượt là 3,16 × 106; 1,96 × 106; 2,26 × 106 TCID 50/ml, đây là 3 chủng virus có hiệu giá cao nhất so với các chủng còn lại và có tiềm năng làm giống gốc cho sản xuất vacxin. Bảng 4.8. Hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu qua 5 đời cấy chuyển Hiệu giá (TCID50/ml) P0 P1 P2 P3 P4 P5 5 5 5 5 5 052TH 6,67 × 10 7,11 × 10 5,40 × 10 6,67 × 10 1,26 × 10 6,67 × 105 010TB 3,16 × 106 5,03 × 106 3,33 × 106 3,03× 106 4,0 × 106 7,12 × 106 082CT 3,16 × 105 3,03 × 105 3,33 × 105 2,25 × 105 3,16 × 105 3,16 × 105 012NA 1,96 × 106 1,26 × 106 2,25 × 106 3,16 × 106 3,33 × 106 3,03 × 106 049HY 1,26 × 106 3,16 × 106 1,26 × 106 3,0 × 106 3,33× 106 3,16 × 106 012HY 6,67 × 105 7,11 × 105 5,40 × 105 9,60 × 105 5,40 × 105 6,67 × 105 008HN 3,16 × 105 3,03 × 105 2,25 × 105 5,40 × 105 3,03× 105 6,67 × 105 122NĐ 1,44 × 105 1,26 × 105 3,03 × 105 2,25 × 105 5,40 × 105 1,44 × 105 072TG 6,67 × 105 5,40 × 105 7,11 × 105 9,60 × 105 6,67 × 105 3,16 × 105 042TP 1,44 × 105 2,25 × 105 1,36 × 105 1,26 × 105 3,03 × 105 3,16 × 105 4.2.2.3. Kết quả xác định quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam qua các đời cấy chuyển Virus Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu về đặc tính sinh học qua các đời cấy chuyển của 10 chủng virus được tuyển chọn, kết quả đồ thị sinh trưởng của 5 chủng virus 052TH, 010TB, 012NA, 049HY, 008HN đại diện và kết quả xác định hiệu giá virus qua các đời cấy chuyển, chúng tôi đã lựa chọn được 3 chủng virus đại diện nhất để tiếp tục nghiên cứu sự ổn định tính di truyền và tính đại diện di truyền cho các chủng virus PRRS cường độc phân lập tại Việt Nam. Đồng thời, chúng tôi cũng gửi thẩm định chủng giống 3 chủng virus này tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y TW. Kết quả lựa chọn các chủng virus nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử được trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9. Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử Kí hiệu chủng virus phân lập 010 TB 012NA 049HY Kí hiệu chủng virus đăng kí KTY-PRRS-01 KTY-PRRS-02 KTY-PRRS-03 Khả năng nhân lên trên môi trường tế bào Tốt, ổn định Tốt, ổn định Tốt, ổn định 16 Hiệu giá virus (TCID50/ml) 3,16 × 106 1,96 × 106 1,26 × 106 4.2.3. Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS 4.2.3.1. Kết quả giải trình tự gen ORF5 và so sánh trình tự nucleotide, axit amin của các chủng virus PRRS nghiên cứu Sau khi phân tích, chúng tôi thu được toàn bộ trình tự nucleotide của các đoạn cần nghiên cứu, đoạn ORF5 có độ dài 603bp, đoạn ORF7 có độ dài 372bp. So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của các chủng nghiên cứu và so sánh với các chủng virus PRRS tham chiếu trên ngân hàng gen thấy rằng, ba chủng virus có mức độ tương đồng về nucleotide gen ORF5 từ 98,1% đến 99,0%. So sánh với một số chủng virus PRRS của Trung Quốc được công bố trên ngân hàng gen từ năm 2006 đến 2015 cho thấy tương đồng nucleotide đạt 97,8% đến 99,5%. Kết quả so sánh thành phần axit amin của gen ORF5 giữa các chủng virus nghiên cứu (bảng 4.18) cho thấy tương đồng về axit amin của 3 chủng virus nghiên cứu đạt từ 96,4% đến 97,5%. Trong đó KTY-PRRS-02 và KTY-PRRS-03 tương đồng với nhau cao nhất 97,5% điều này cũng phù hợp với tương đồng về nucleotide gen ORF5 của 2 chủng này. Hai chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-03 tương đồng thấp nhất với nhau đạt 96,4%. So sánh thành phần axit amin gen ORF5 của các chủng nghiên cứu với một số chủng virus PRRS của Việt Nam được công bố trên ngân hàng gen từ năm 2007 đến 2015 thấy rằng tương đồng axit amin đạt được từ 94,2% đến 98,4%. So sánh với một số chủng virus PRRS của Trung Quốc được công bố trên ngân hàng gen từ năm 2006 đến 2015 thấy rằng tương đồng axit amin đạt từ 95,8% đến 99,5%. 4.2.3.2. Kết quả giải trình tự gen ORF7 và so sánh trình tự nucleotide, axit amin của các chủng virus PRRS nghiên cứu Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen ORF7 giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu thấy tỉ lệ tương đồng dao động từ 99,1% đến 99,6%. Trong đó KTY-PRRS02 và KTY-PRRS-03 là tương đồng cao nhất (99,6%) và thấp nhất là KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02, KTY-PRRS-03 (99,1%). So sánh với các chủng tham chiếu của Việt Nam trên ngân hàng gen thế giới chúng tôi thấy rằng mức độ tương đồng về nucleotide của gen ORF7 đạt 98,9% đến 99,7%. So sánh với các chủng tham chiếu của Trung Quốc trên ngân hàng gen thế giới chúng tôi thấy rằng mức độ tương đồng về nucleotide của gen ORF7 đạt 98,7% đến 100%. Kết quả so sánh sự tương đồng axit amin cho thấy không có sự sai khác về thành phần axit amin của đoạn gen ORF7 của cả 3 chủng virus nghiên cứu, như vậy tương đồng axit amin của gen ORF7 của 3 chủng virus nghiên cứu đạt 100%. So sánh sự tương đồng axit amin của gen ORF7 với một số chủng tham chiếu của Việt Nam và Trung Quốc trên ngân hàng gen cũng không thấy sự sai khác về thành phần axit amin của đoạn gen này. 4.2.3.3. Kết quả dựng cây phát sinh loài của các chủng virus PRRS nghiên cứu Dựa trên trình tự gen ORF5 và ORF7, cây phát sinh loài tương ứng đã được xây dựng một cách độc lập. Tất cả các chủng virus PRRS nghiên cứu được đặt phân tích trong cùng một sơ đồ phả hệ (cây phân nhánh) với các chủng virus khác trên thế giới 17 để thấy được mối quan hệ di truyền giữa các chủng với nhau. Kết quả dựng cây phát sinh loài được thể hiện ở hình 4.1 và 4.3. 93 45 JQ860367/Vietnam/2009/DN42 JQ860362/Vietnam/2008/DN444 KF735060 HPPRRS (Thailand 2010) 49 JQ860387/Vietnam/2012/DT7 10 KTY-PRRS-01 42 39 70 KF698647/Lao/2011/NA/LAO/L142 FJ895329/China/2009/SX2009 HQ832108/China/2008/AHXD 57 KM244763/Vietnam/2013/MN1 60 57 KC263035/China/2011/HD-11 FJ394029/Vietnam/2007/07QN 21 51 EF635006 HUN4 (China 2007) EU864233/China/2006/TP EF112445 JXA1 (China 2006) 53 20 KP998478/China/2015/FJZH KTY-PRRS-03 54 42 0 KT208323/China/2015/2015-GDHY KF699846/Vietnam/2013/HUA/HP1 40 KT208348/China/2014/gdsg-2014-gp5 75 JX144912/China/2012/YC1201 90 47 71 JQ955657/China/2013/GX1001 AB856283/Vietnam/2011/HUA-Viet.labPRRS1 97 86 LC105643/Vietnam/2015/BN10 62 HM214915/China/2010/GX09-32 KTY-PRRS-02 JQ860379/Vietnam/2010/HCM.CC3 DQ176019 MN184A (USA 2006) U66394 PRRS (USA 1997) 43 PRRSV ATCC VR-2332 (U87392 NA) 81 AF159149 MLV RespPRRS/Repro (USA 2000) 98 PRRSV BCL-PS 100 (GU187014 Singapore) 84 AF066183 Ingelvac PRRS MLV (USA 2005) 7 DQ345725 VP-046 (Spain 2009) M96262 Lelystad virus (Netherlands 1991) 100 (Ghi chú: chủng virus nghiên cứu, chủng virus vacxin Trung Quốc, châu Âu) chủng Bắc Mỹ, Chủng Hình 4.1. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF5 54 57 KTY-PRRS-01 KP771770.China.2015 KM695199.Vietnam.2015 81 JQ663568.China.2012 42 57 KF735060.Thailand.2015 LC192549.Vietnam.2016 38 KTY-PRRS-02 KM659203.JXA1 58 70 KX815433.China.2017 45 GQ475526.China.2013 12 16 KU842720.Vietnam.2014 67 JN626287.China.2016 KTY-PRRS-03 DQ176021.VR2332 M96262.Lelystad (Ghi chú: chủng virus nghiên cứu, chủng virus vacxin Trung Quốc, chủng Bắc Mỹ, châu Âu) Chủng Hình 4.2. Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF7 Cây phát sinh loài hình 4.1 cho thấy, 3 chủng virus PRRS nghiên cứu nằm ở 2 nhóm phát sinh lớn khác nhau, trong đó KTY-PRRS-02 làm thành một nhóm và 2 chủng còn lại KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-03 làm thành một nhóm. Đồng thời chủng độc lực cao Trung Quốc (JXA1) nằm cùng nhóm với chủng KTY-PRRS-01 và KTYPRRS-03. Các chủng virus nghiên cứu thuộc một nhánh của chủng Bắc Mỹ (VR-2332), không có chủng virus nghiên cứu nào nằm cùng nhánh phát sinh với chủng Châu Âu (Lelystad). Cây phát sinh loài hình 4.2 cho thấy các chủng virus nghiên cứu thuộc một nhánh phát sinh của chủng Bắc Mỹ (VR-2332) và cùng nhánh phát sinh với các chủng độc lực cao của Trung Quốc. Như vậy, qua việc so sánh mức độ tương đồng về nucleotide và axit amin giữa các chủng virus PRRS phân lập, dựng cây phát sinh loài phản ánh mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu ta thấy các 18