Tài liệu Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên h5n1 phòng chống bệnh cúm gia cầm

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP --------------------------------- BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG BÈO TẤM MANG GEN KHÁNG NGUYÊN H5N1 PHÒNG CHỐNG BỆNH CÚM Ở GIA CẦM Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Di truyền Nông nghiệp Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Huy Hàm Thời gian thực hiện: 01/2007-06/2011 8908 Hà Nội, 2011 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực Nông nghiệp và PTNT đến 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm Chủ nhiệm đề tài/ dự án (ký tên) PGS. TS Lê Huy Hàm Cơ quan chủ trì đề tài/ dự án: (ký tên và đóng dấu) BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D AS BAP Bp CH CL CTTN DNA EDTA Et-Br Gus H Hb Hct Hpt H/2 LG LM MS MSC MCPA MCH MCHC MCV MPV NAA NOS OD PCR RBC RDW SP SDS TAE TE T- DNA TDZ Ti-Plasmid VIR WBC X-gluc 2,4 Dichlorophenoxyacetic acid Acetosyringone 6 – Benzylaminopurine base pair (cặp bazơ) Casein hydrolysate Chọn lọc Công thức thí nghiệm Deoxyribo Nucleic Acid Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Ethidium Bromide -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase) Hutner Hemoglobin (lượng hemoglobin có trong một thể tích máu) Hematocrit Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase Môi trường Hutner/2 Lemna gibba Lemna minor Murashige and Skoog Multi - Cloning Site 2-methyl – 4 cholorophenoxy acetic acid Mean corpuscular hemoglobin - giá trị hemoglobin trung bình Mean corpuscular hemoglobin concentration - nồng độ hemoglobin trung bình Mean corpuscular volume - thể tích hồng cầu trung bình Mean platelet volume - thể tích trung bình của tiểu cầu 2- naphthalen-1-yl acetic acid Nopalin Sythetase Optical Density (mật độ quang học) Polymerase Chain Reaction Red blood cell - số lượng hồng cầu (đơn vị 1012 tế bào/L) Red cell distribution width - độ phân bố về kích thước của hồng cầu Spirodela polyrrhiza Sodium Dodecyl Sulfate Tris-Acetate-EDTA Tris-EDTA Transfer DNA Thidiazuron Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u) White blood cell - số lượng bạch cầu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài MỤC LỤC Chương 1: MỞ ĐẦU...................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 1.3. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 2 1.4. Phạm vi nghiên cứu........................................................................................ 2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................3 2.1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................. 3 2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 .......................... 5 2.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới ............................................................................................................................. 5 2.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam ............................................................................................................................. 7 2.3. Gen Hemagglutinin........................................................................................ 8 2.4. Chuyển gen vào bèo tấm thực tại và triển vọng .............................................. 11 2.4.1. Bèo tấm và tiềm năng chuyển gen ............................................................... 11 2.4.2. Agrobacterium với quá trình chuyển gen vào thực vật ................................ 16 2.4.3. Nâng cao khả năng biểu hiện gen trong thực vật......................................... 19 Chương 3: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................................31 3.1. Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 31 3.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 32 3.2.1. Vật liệu thực vật .......................................................................................... 32 3.2.2. Vật liệu di truyền........................................................................................ 32 3.2.3. Các vật liệu khác......................................................................................... 32 3.2.4. Hóa chất ..................................................................................................... 32 3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 35 3.3.1. Phương pháp tạo dòng gen mã hóa kháng nguyên và tạo vi sinh vật biểu hiện gen H5N1 trên bề mặt............................................................................ 36 3.3.2. Phương pháp tạo bèo tấm mang gen protein vỏ virus H5N1....................... 40 3.3.3. Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen............................................................. 51 Chương 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.......................................................56 NỘI DUNG A: TẠO DÒNG MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN ............................ 56 Nội dung 1: Thu thập, đánh giá nguồn vật liệu ban đầu (vật liệu TV) cho các nghiên cứu biến nạp di truyền............................................................................ 56 Nội dung 2: Xác định trình tự gen quan tâm, so sánh với các trình tự gen đã công bố trước đó, xác định những thay đổi về mặt cấu trúc gen...................... 57 Nội dung 3: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên HA, NA của virus H5N1 trên cúm gia cầm tại Việt Nam ................................................................ 61 Nội dung 4: Tạo dòng các gen mã hóa kháng nguyên dạng đột biến mất đoạn hoặc gen dung hợp các đoạn peptid khác nhau hoặc các epitope khác nhau .................................................................................................................... 63 4.1. Tách dòng gen HA gắn enzyme giới hạn nhận biết ........................................ 63 4.2. Tách dòng gen HA1 gắn enzyme giới hạn nhận biết................................................. 64 4.3. Cải biến gen HA1 ......................................................................................... 65 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài 4.3.1. Cải biến vị trí MD2 trên đoạn gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer ... 65 4.3.2. Cải biến vị trí MD5, MD3 trên gen HA1 bằng phương pháp Quickchange.. 67 4.3.3. Cải biến vị trí MD4 trên gen HA1 bằng phương pháp Megaprimer............. 68 4.3.4. Cải biến vị trí M2 trên đoạn gen HA1 sử dụng phương pháp OE-PCR kéo dài các đoạn gối lên nhau ..................................................................................... 70 NỘI DUNG B. TẠO VI SINH VẬT BIỂU HIỆN GEN H5N1 TRÊN BỀ MẶT ............................................................................................................................. 73 Nội dung 5: Tạo dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp của virus H5N1 trong E.coli phục vụ mục đích phát triển kháng thể chuyên biệt với các kháng nguyên của H5N1. ............................................................................. 73 NỘI DUNG C. TẠO BÈO TẤM MANG GEN PROTEIN VỎ VIRUS H5N1 ............................................................................................................................. 77 Nội dung 6: Lựa chọn, sưu tập, định danh, đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của một số giống bèo tấm đáp ứng yêu cầu là cây chủ để sản xuất protein tái tổ hợp. ....................................................................................... 77 Nội dung 7: Nghiên cứu tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo callus và tái sinh cây bèo tấm (L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza) ...................... 84 Nội dung 8: Tách chiết phân lập các promotor đặc hiệu ở bèo tấm ................ 88 8.1. Tách dòng đoạn promoter từ loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 ......................... 88 8.2. Tách dòng đoạn promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 ..................................................................................................................... 92 M 8.3. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA1 đã cải biến - pPAM- HA1 .......... 95 8.4. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA, HA1 đã cải biến với promoter bèo tấm (pPAM-Sp-HA1) .......................................................................................... 97 Nội dung 9: Thiết kế vectơ tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng Agrobacterium và bằng súng bắn gen ............................................................... 101 9.1. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng súng bắn gen ............................................................................................................................. 101 9.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen HA cho chuyển gen bằng Agrobacterium ............................................................................................................................. 103 9.3 Chuyển vector tái tổ hợp chứa gen HA vào chủng A. tumefaciens. Kiểm tra chủng ............................................................................................................. 111 Nội dung 10: Thử nghiệm các chủng Agrobacterium để xác định được chủng thích hợp cho chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza. ............................................................................................................ 112 Nội dung 11: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza bằng súng bắn gen .................. 114 11.1. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ...................... 114 11.2. Ảnh hưởng khoảng cách bắn và áp lực khí He đến biểu hiện tạm thời của gen gus ........................................................................................................... 116 11.3. Ảnh hưởng của việc xử lý áp suất thẩm thấu đến hiệu quả chuyển gen tạm thời................................................................................................................................. 118 11.4. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ............ 120 11.5. Ảnh hưởng của kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus và khả năng tái sinh ............................................................................................. 121 Nội dung 12: Nghiên cứu tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào callus và nguyên cây ở L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza bằng A. tumefaciens ................. 122 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài 12.1. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens........................................................................ 122 12.2. Kết quả nghiên cứu lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens........................................................... 123 12.3. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus..................................................................................... 123 12.4. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus ................................................................. 124 12.5. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus ................................................................. 126 Nội dung 13. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm............................ 129 13.1. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm thông qua A. tumefaciens ............................................................................................................................. 129 13.2. Chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm bằng súng bắn gen ............... 130 Nội dung 14. Phân tích đánh giá cây chuyển gen bằng các phương pháp SHPT ............................................................................................................................. 131 14.1. Tách chiết và kiểm tra DNA tổng số của ba loài bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza ........................................................................................................ 131 14.2. Phân tích PCR sự có mặt của gen chuyển trong ba loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza chuyển gen ....................................................................... 131 14.3. Phân tích cây chuyển gen bằng phương pháp Southern blot ......................... 135 14.4. Phân tích Western blot ................................................................................. 137 14.4.1. Kết quả điện di protein tổng số.................................................................. 138 14.4.2. Kết quả kiểm tra phản ứng lai miễn dịch với kháng thể H5 bằng kỹ thuật Western blot.......................................................................................................... 138 Nội dung D. Khảo nghiệm sản phẩm chuyển gen.............................................. 140 Nội dung 15. Khảo sát khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình diện kháng nguyên trên gà ................................................................................... 140 15.1. Thu mẫu máu ............................................................................................... 140 15.2. Kết quả đáp ứng miễn dịch của các dòng tế bào trình diện kháng nguyên..... 142 Nội dung 16. Thử nghiệm đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch ở gà trong thực tế........................................................................................................................... 144 16.1. Kết quả phát hiện kháng thể kháng nguyên H5 bằng phản ứng HI................ 148 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................... 148 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 148 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 149 CHƯƠNG 6: TỔNG QUÁT HÓA VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC..........................................................................................................150 6.1. Kết quả về khoa học....................................................................................... 150 6.2. Kết quả đào tạo .............................................................................................. 152 6.3. Kết quả nổi bật .............................................................................................. 153 6.4. Trình độ công nghệ ........................................................................................ 154 6.5. Khả năng áp dụng .......................................................................................... 154 6.6. Tình hình sử dụng kinh phí ............................................................................ 154 6.7. Danh sách các công trình công bố .................................................................. 155 6.8. Hạn chế của đề tài ......................................................................................... 156 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................. 157 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài Tài liệu tiếng Việt...................................................................................... 157 Tài liệu tiếng Anh...................................................................................... 158 PHỤ LỤC 1 ......................................................................................................... 168 PHỤ LỤC 2 ......................................................................................................... 169 PHỤ LỤC 3 ......................................................................................................... 171 PHỤ LỤC 4 ....................................................................................................... 173 PHỤ LỤC 5 ...........................................................................................................179 PHỤ LỤC 6. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ...............................182 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm Bảng 2.2. Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo Bảng 2.3. Codon ưu tiên sử dụng trong bèo tấm, thực vật (một, hai lá mầm) và virus H5N1 (Dickey et al., 2007, Murray et al., 1989, Zhou et al., 2005) Bảng 3.1. Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào đầu gen HA, HA1 Bảng 3.2. Trình tự các primer tạo đột biến điểm trên gen HA Bảng 3.3. Trình tự các primer sử dụng nhân cấu trúc CAMV35Sprom-GUSNOSter Bảng 3.4. Trình tự các primer sử dụng để phân lập promoter bèo tấm Bảng 3.5. Trình tự các primer sử dụng để gắn các enzyme cắt đặc hiệu (RE) vào đầu promoter bèo tấm S. polyrhyza Bảng 3.6. Trình tự các primer sử dụng để kiểm tra trình tự các vị trí nối các enzyme Bảng 3.7. Trình tự cặp primer sử dụng để gắn gen HA vào vector biểu hiện Bảng 3.8. Các chủng A. tumefaciens và vector sử dụng cho nghiên cứu Bảng 3.9. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu Bảng 4.1. Số trình tự H5 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) Bảng 4.2. Số trình tự N1 hoàn chỉnh của gà và vịt Việt Nam (đến năm 2007) Bảng 4.3. Các vị trí đã được cải biến trên gen HA1 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của các loài bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza Bảng 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng và phát triển của bèo tấm L. minor, L. gibba, S. polyrrhiza Bảng 4.6. Ảnh hưởng của hàm lượng đường lên khả năng sinh trưởng của các loài bèo tấm Bảng 4.7. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với Sp-Ubi-pin 16 (Việt Nam) Bảng 4.8. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin với La-Ubi-10F Bảng 4.9. Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP Bảng 4.10. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện gen tạm thời của gen gus ở cánh bèo tấm chuyển gen Bảng 4.11. Ảnh hưởng của tuổi mẫu đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bèo tấm L. minor chuyển gen 14 15 26 33 33 34 34 35 35 35 41 46 56 57 73 80 82 84 93 97 116 119 120 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện gen gus tạm thời ở cánh bèo tấm chuyển gen Bảng 4.13. Ảnh hưởng của khoảng cách bắn và áp lực khí đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen Bảng 4.14. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở bèo nguyên cây chuyển gen Bảng 4.15. Ảnh hưởng của xử lý áp suất thẩm thấu đến biểu hiện gen gus tạm thời ở callus bèo S. polyrrhiza chuyển gen Bảng 4.16. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo nguyên cây Bảng 4.17. Ảnh hưởng hàm lượng hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus ở callus Bảng 4.18. Ảnh hưởng kích thước hạt vàng đến biểu hiện tạm thời của gen gus Bảng 4.19. Lựa chọn vector thích hợp cho chuyển gen vào bèo tấm SP thông qua vi khuẩn A. tumefaciens Bảng 4.20. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo SP Bảng 4.21. Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP Bảng 4.22. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo SP Bảng 4.23. Tổng hợp số thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên H5N1 vào bèo tấm chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Bảng 4.24. Tổng hợp các thí nghiệm chuyển gen kháng nguyên HA1 vào bèo tấm bằng súng bắn gen Bảng 4.25. Danh sách các mẫu máu gà thu được Bảng 4.26. Kết quả số lượng bạch cầu Bảng 4.27. Bảng kết quả tổng hợp một số chỉ tiêu của máu Bảng 4.28. Kết quả phản ứng HI 121 122 123 124 125 125 126 127 128 129 130 133 135 145 146 147 148 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc protein Hemagglutinin Hình 2.2. Hoa của loài bèo Lemna gibba Hình 2.3. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt, 1986 Hình 2.4. Bản đồ cấu trúc Ti-plasmid (Lê Thị Thu Hiền, 2003) Hình 2.5. Sơ đồ vector nhị thể (Lê Thị Thu Hiền, 2003) Hình 2.6. Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở ngô Hình 2.7. Sơ đồ minh họa phương pháp Megaprimer Hình 3.1. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế các vector mang gen HA để chuyển vào bèo tấm Hình 4.1. Các dòng tái tổ hợp pCR2.1 mang gen HA của virus cúm gà và vịt được cắt bằng enzyme EcoRV và HindIII. Hình 4.2. Các dòng chứa plasmid pCR2.1 mang gen Hình 4.3. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA trên gel agarose 0,8 %. Hình 4.4. Hình ảnh điện di kết quả tách dòng gen HA1 trên gel agarose 0,8%. Hình 4.5. Sơ đồ một số vị trí cải biến trên gen HA1 (987 bp) Hình 4.6. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD2 trên gel 0,8% agarose. Hình 4.7. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD5 trên gel agarosre 2% Hình 4.8. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD3 trên gel agarosre 2% Hình 4.9. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí MD4 trên gel 0,8% Hình 4.10. Hình ảnh điện di kết quả cải biến vị trí M2 trên gel agarose 0,8% Hình 4.11. So sánh trình tự nucleotide và amino acid giữa gen HA1 và HA1M tại vùng cải biến Hình 4.12. Sơ đồ gắn gen HA vào plasmid pET-22b(+) Hình 4.13. Kết quả kiểm tra vector pET22b(+) cắt bằng HindIII và NotI (giếng 1) và pCR2.1-H5 cắt bằng EcoRI (giếng 2). Hình 4.14. Minh hoạ thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) Hình 4.15. Nuôi gà thí nghiệm và gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1, và lấy máu kiểm tra tối miễn dịch. Hình 4.16. Lấy máu gà trước khi gây tối miễn dịch bằng vaccine H5N1 (trên trái), sau đó tiêm vaccine H5N1 dưới da cổ để gây tối miễn dịch cho gà (trên phải) và lấy máu gà 14 ngày tuổi trước khi tiêm vaccine Hình 4.17. Bèo Lemna gibba nuôi trong môi trường H/2+ 10 g/l sucrose, pH 7,0 Hình 4.18. Ảnh hưởng của đường sucrose (g/l) tới hệ số nhân cánh ở bèo S. 9 13 13 17 18 22 29 36 62 63 64 65 66 66 68 68 69 70 71 74 75 76 77 77 84 84 polyrrhiza Hình 4.19. Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin của loài bèo tấm S.polyrrhiza (Mỹ) và vị trí các mồi Hình 4.20. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% Hình 4.21. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme giới hạn Hình 4.22. Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi Hình 4.23. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% Hình 4.24. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme cắt hạn chế Hình 4.25. Hình ảnh điện di sản phẩm promoter SpUbiquitin trên gel agarose 0,8%. Hình 4.26. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-Sp-HA1 trên gel agarose 0,8%. Hình 4.27. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-Sp-HA1M trên gel agarose 0,8%. Hình 4.28. Sơ đồ vector pPAMSpHA1 Hình 4.29. Sơ đồ thiết kế vector pPAM mang gen HA1 Hình 4.30. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA1 trên gel agarose 0,8%. Hình 4.31. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pPAM-HA, pPAM- HA1M trên gel agarose 0,8% Hình 4.32. Sơ đồ thiết kế vector pCAMBI-HA1 và pCAMBIA-Sp-HA1 Hình 4.33. Sơ đồ cấu trúc SHA1N trong plasmid pJET-SHA1N Hình 4.34. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế và kiểm tra pJET-SHA1N, pJETSHA1MN trên gel agarose 0,8%. Hình 4.35. Hình ảnh điện di các sản phẩm trong quá trình thiết kế và kiểm tra Hình 4.36. Hình ảnh điện di kết quả thiết kế pCAMBIA-Sp-HA1, pCAMBIASp-HA1M trên gel agarose 0,8%. Hình 4.37. Sơ đồ vector pCAMBIA-Sp-HA1 Hình 4.38. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên SP nguyên cây sau khi lây nhiễm với các chủng A. tumefaciens Hình 4.39. Biểu hiện tạm thời của gen gus trên callus SP sau khi lây nhiễm các chủng vi khuẩn khác nhau Hình 4.40. Mô đích sử dụng cho bắn gen Hình 4.41. Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo SP chuyển gen 89 89 91 92 93 94 96 98 98 99 101 103 103 104 106 107 108 110 110 113 114 116 127 Hình 4.42. Chọn lọc các dòng bèo chuyển gen Hình 4.43. Kết quả điện di kiểm tra mẫu DNA tổng số tách từ bèo tấm S. 130 132 polyrrhiza chuyển gen trên gel agarose 0,8 %. Hình 4.44. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm Lemna gibba chuyển gen 132 Hình 4.45. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm LM chuyển gen 133 Hình 4.46. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo tấm LM chuyển gen 133 Hình 4.47. Kết quả phân tích PCR gen hpt các dòng bèo tấm SP chuyển gen 134 Hình 4.48. Kết quả phân tích PCR gen HA1các dòng bèo S. polyrrhiza 135 chuyển gen 136 Hình 4.49. DNA tổng số được cắt bằng BamHI Hình 4.50. Kết quả lai DNA của các dòng bèo tấm chuyển gen 137 Hình 4.51. Kết quả điện di protein tổng số các dòng bèo chuyển gen 138 Hình 4.52. Kết quả phân tích Western blot các dòng bèo chuyển gen 139 Hình 4.53. A. Gà nuôi trong chuồng; B. Cho gà ăn bèo chuyển gen Hình 4.54. Lấy máu gà 140 Hình 4.55. (A) Tế bào hồng cầu và bạch cầu Eosinophil; (B) Tế bào hồng cầu và bạch cầu neutrophil; (C) Tế bào hồng cầu và bạch cầu lympho 141 144 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 thế giới chứng kiến những thành tựu vượt bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Một trong những thành tựu đó là tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính khác biệt như chống chịu sâu, bệnh, kháng thuốc diệt cỏ... Đến năm 2010 diện tích cây chuyển gen toàn cầu đạt 148 triệu ha. Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn mới như: chịu hạn, mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăng cường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến, tăng cường hoạt chất sinh học... đã được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vào ứng dụng trong sản xuất (www.isaaa.org). Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine... (Mason et al, 1998). Có nhiều hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men... Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein từ tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế hơn trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Vaccine do thực vật sản xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dich toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003). Ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất loại vaccine này (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Cúm gà (avian influenza-AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của các loại gia cầm, thủy cầm, các loại chim bị gây ra bởi virus cúm týp A, một trong 4 nhóm virus thuộc họ Orthomyxoviridae. Trong họ này có 4 nhóm: virus cúm týp A (influenza A virus); 1 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài virus cúm týp B (influenza B virus); virus cúm týp C (influenza C virus) và nhóm Thogotovirus. Chỉ có virus cúm A và B là gây dịch cúm nguy hiểm, còn virus cúm C chỉ gây cảm cúm thông thường. Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao và gây bệnh trên người trong những năm 1996-2008. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Sau đó, cúm A/H5N1 đã tái xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gây chết người bệnh. Có thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A hiện đại mới xuất hiện. Virus H5N1 gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia của nhiều châu lục trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Cơ bản về cấu trúc virus cúm vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực,loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những biến chủng H5N1 trước đây. Các chủng virus cúm A/H5N1 thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập vào các nước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, đặc biệt Ai Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất (Hulse-Pot et al., 2005, Subbarao, Luke, 2007, Zhao et al., 2008). Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, tái phát vào năm 2004, 2005. Mặc dù đã áp dụng nhiều biện pháp phòng chống, cho đến nay vẫn còn những ổ dịch nhỏ (www.cucthuy.gov.vn). Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, Viện Di truyền Nông nghiệp đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm” thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Tạo giống bèo tấm mang gen biến nạp HA và NA có khả năng gây miễn dịch bệnh cúm gia cầm thông qua đường tiêu hoá. 1.3. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu trong đề tài này là ba loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza; gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1. 1.4. Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu tái sinh, tạo callus và chuyển gen kháng nguyên HA1 của virus H5N1ở các loài bèo tấm L. gibba, L. minor, S. polyrrhiza trong điều kiện phòng thí nghiệm 2 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay số lượng các tác nhân gây bệnh cho người và gia súc gia cầm ngày càng tăng, hiện tượng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con người phải ưu tiên quan tâm trước hết đến các phương pháp phòng bệnh so với việc chữa bệnh. Vì vậy việc phòng bệnh bằng vaccine đã trở thành hoạt động quan trọng và là mục tiêu hàng đầu của ngành bảo vệ sức khoẻ và thú y của các nước (Walmsley & Arntzen, 2000). Tuy vậy, nhiều nước trong số các nước đang phát triển không có đủ điều kiện để cung cấp đầy đủ vaccine để phòng ngừa các loại bệnh nguy hiểm nhất, phổ thông nhất cho dân mình. Chỉ nhờ vào sự giúp đỡ của chương trình y tế thế giới, người dân các nước đang phát triển mới có thể tham gia chương trình tiêm chủng mở rộng gồm 6 loại vaccine. Trong khi đó tại các nước phát triển, trẻ em được tiêm chủng phòng 10 loại bệnh nguy hiểm đã từ nhiều thập kỷ nay. Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến hiện tượng trên là do giá thành vaccine sản xuất ra rất cao, không phù hợp với khả năng thanh toán của các nước đang phát triển (Walmsley & Arntzen, 2000). Tương tự như vậy đối với lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầm, do giá thành vaccine cao, ngành chăn nuôi tại các nước đang phát triển gặp nhiều rủi ro hơn nhiều so với các nước phát triển. Vì vậy việc tìm ra phương pháp sản xuất vaccine mới, với giá thành hạ là một trong những tìm kiếm sôi động trên thế giới những năm gần đây. Một trong những hướng nghiên cứu để giảm giá thành vaccine là sử dụng vaccine dùng qua đường miệng thay thế cho vaccine tiêm (gọi tắt là vaccine uống). Vaccine uống có nhiều lợi thế hơn so với vaccine tiêm, như không phải sử dụng nước cất, kim tiêm, không cần cán bộ y tế có trình độ, không có nguy cơ lây nhiễm các bệnh qua đường máu... Điều đó làm vaccine uống hấp dẫn hơn nhiều ở các nước nghèo, đặc biệt ở các vùng sâu, vùng xa. Mặt khác, vaccine uống có một số ưu điểm so với vaccine tiêm có liên quan đến hệ miễn dịch màng nhầy. Hệ màng nhầy (bao phủ các đường tiêu hoá, đường hô hấp, đường bài tiết...) trong cơ thể người và động vật chiếm một diện tích rất lớn (ở người lớn diện tích hệ màng nhầy lên đến trên 400 m2). Người ta đã nhận thấy rằng trong một số trường hợp sử dụng vaccine tiêm, kháng thể tạo thành trong máu nhưng lại không tìm thấy ở hệ màng nhầy. Trong khi đó màng nhầy lại là cửa ngõ xâm nhập vào cơ thể của nhiều tác nhân gây bệnh. Nếu gây miễn dịch hệ thống màng nhầy, tác nhân gây bệnh sẽ bị chặn ngay lại khi xâm nhập vào cơ thể (Mestecky & et al, 2005). Hướng tiếp theo có tiềm năng giảm giá thành vaccine là sử dụng thực vật 3 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài chuyển gen để sản xuất vaccine. Có nhiều hệ thống sản xuất các protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đích khác nhau của con người. Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn, nấm men... Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào động vật bậc cao, vi khuẩn và nấm men. Ví dụ, hệ thống sản xuất vaccine sử dụng vi khuẩn có khả năng cho lượng protein cao nhưng vi khuẩn không có khả năng biến tính protein tạo thành bằng các phản ứng glycosit hoá, do đó hoạt tính của protein tạo thành bị hạn chế (Knusadi et al, 1997). Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhà khoa học là tìm kiếm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Trước hết phải kể đến khả năng glycosit hoá protein, đó là một yếu tố rất quan trọng bởi vì các protein có khả năng gây miễn dịch đối với virus, vi khuẩn thường là glycoprotein, nhóm glycosyl thường là yếu tố không thể thiếu được cho phản ứng tạo miễn dịch (Alkhatib et al, 1984). Lợi thế thứ hai là protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein tạo thành từ tế bào động vật bậc cao bởi thực vật thường không là vật chủ của các nguồn gây bệnh cho người và động vật (Ganz et al, 1996; Cramer et al, 1999). Cuối cùng là lợi thế về giá thành: Thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc… So với việc nuôi cấy tế bào, chí phí đó hầu như không đáng kể. Vaccine do thực vật sản xuất ra thông qua kỹ thuật di truyền được gọi là "Vaccine sản xuất bằng thực vật" (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dưới dạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật. Vaccine tái tổ hợp có thể được đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năng đưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy và miễn dich toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003). ý tưởng sử dụng thực vật làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đã lôi cuốn các nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừa qua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003). Một trong những phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamine, các hợp chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế, như kháng nguyên, kháng thể, interferon, vaccine... (Mason etal, 1998) Người ta đã tạo ra giống "lúa vàng" để sử dụng như nguồn bổ sung vitamine A cho cơ thể. Một loạt các protein gây miễn dịch của virus, vi khuẩn và một loạt các loài thực vật đã được nghiên cứu. Kết quả thử nghiệm đã chứng minh vaccine tái tổ 4 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài hợp chống viêm gan B sản xuất bằng thực vật đã gây miễn dịch hệ thống màng nhầy trên động vật (Mason et al, 1992) gây miễn dịch ở người tình nguyện (Tacket et al, 1998). Nhiều loại vaccine thú y cũng được quan tâm nghiên cứu. Hiện nay người ta đã thành công trong việc chuyển gen tổng hợp các vaccine ở các thực vật sau: Glycoprotein B (cytomegalovirus người) ở lúa, thuốc lá (Tackabery et al, 1999; Sardana et al, 2003); NVCP (virus Norwalk) ở khoai tây (Marson et al, 1996); Hemagglutinin (virus sởi) ở cà rốt (Bouche et al, 2003); HbsAg (viêm gan B) ở khoai tây, rau diếp, chuối (Kapusta et al, 1999; Kong et al, 2001); độc tố gây bệnh tả B (bệnh tả) ở cà chua (Jani et al, 2002); Protein F (virus hợp bào hô hấp) ở cà chua (Sandhu et al, 2000); LT-B (E. coli) ở khoai tây, ngô (Haq et al, 1995; Chikwamba et al, 2002); Protein S (virus đường ruột) ở thuốc lá (Tuboly et al, 2000); Protein L1 (papilloma virus người) ở khoai tây (Warzecha et al, 2003); kháng nguyên chống bệnh than ở thuốc lá (Aziz et al, 2002); Protein vỏ hantavirus ở khoai tây (Kehm et al, 2001) và Epitope VP1 (bệnh lở mồm long móng) ở khoai tây (Carrillo et al, 2001). Hiện nay, các nghiên cứu trên thế giới trong thập niên vừa qua đã cho thấy tiềm năng ứng dụng của vaccine uống sản xuất thông qua hệ thống thực vật chuyển gen là rất lớn, nó không những sẽ góp phần giảm rất đáng kể giá thành vaccine mà còn mở ra những triển vọng mới trong việc ứng dụng CNSH thực vật cho mọi mặt của đời sống. 2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 2.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 trên thế giới Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch (Subbarao, Luke, 2007). Đối với dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vaccine không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người. Nhiều công trình nghiên cứu về gen H5N1 và phát triển công nghệ cũng như vaccine gây miễn dịch cho gia cầm được xúc tiến mạnh mẽ. Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vaccine, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Có nhiều loại kháng thể, nhưng trước hết chỉ kháng thể kháng HA (H5) có vai trò tiên quyết quan trọng trong quá trình trung hòa virus phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới (Capua & Alexander, 2008, Subbarao & Luke, 2007). Virus cúm H5N1 rất độc có thể giết chết ngay phôi gà (nguyên liệu dùng trong sản xuất vaccine) từ khi mới cấy virus vào phôi. Vì vậy loại bỏ vùng gây độc là tiêu chí bắt buộc khi sản xuất vaccine. 5 2007 – 2010  Báo cáo Tổng kết đề tài Vaccine truyền thống: bao gồm vaccine vô hoạt đồng chủng và dị chủng. Vaccine vô hoạt đồng chủng (homologus vaccine), đó là các loại vaccine được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa (Swayne, Suarez, 2000). Vaccine vô hoạt dị chủng (heterologus vaccine) là vaccine sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng.  Vaccine thế hệ mới hay vaccine công nghệ gen: là loại vaccine được sản xuất dựa trên kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm: + Vaccine tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp mang gen H5 và N1 phòng chống virus týp H5N1 và H7N1 (Quiao et al., 2006). Ví dụ, Hãng Merial của Pháp sản xuất vaccine TrovacAIV-H5 lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ierland/83 (H5N2), sử dụng được cho gia cầm lúc 1 ngày tuổi. + Vaccine dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vaccine (Peyre et al., 2009).  Vaccine nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng “độc” đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen (Liu et al., 2003, Tian et al., 2005). Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1PR8/CDC-rg (CDC).  Vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine): Do hiện tượng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn và sự gia tăng các vi sinh vật mới, ngoài vaccine tiêm chủng ra, từ năm 1990, đã xuất hiện một thuật ngữ mới vaccine đường miệng (oral vaccine) để chỉ loại vaccine không cần giữ lạnh, trong đó vaccine ăn được ở thực vật (plant edible vaccine) cũng thuộc nhóm này. Đây là lĩnh vực nghiên cứu mới trong công nghệ sinh học bao gồm cả lĩnh vực nghiên cứu sản xuất vaccine và nghiên cứu cây trồng chuyển gen (Lal et al., 2007). Vaccine ăn được ở thực vật là vaccine tiểu phần protein được sản xuất dựa trên hệ thống thực vật để thu được protein làm kháng nguyên mong muốn. Chúng tác động vào dịch thể, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào (Lê Trần Bình & Cao Huyền Trang, 2005). Vaccine này bền vững trong dịch tiêu hóa, đi qua đường tiêu hóa mà không bị phân hủy. Sản xuất vaccine ăn được có thể thực hiện theo quy trình sau đây: 6 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài - Lựa chọn gen cần được biểu hiện và đưa vào vector thích hợp; - Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen; - Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau; - Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật; - Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật; - Sử dụng vaccine đã được thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi hoặc dưới dạng thức ăn đã chế biến. Các thành tựu về công nghệ chuyển gen ở thực vật trong hướng nghiên cứu vaccine đường miệng: nghiên cứu vaccine virus viêm gan B biểu hiện trong chuối (Kumar et al., 2005), rau diếp (Marcondes & Hansen, 2008), vaccine chống bệnh đường ruột (Carol et al., 2007), vaccine chống bệnh SARS-CoA ở nhiều loài thực vật (Li et al, 2006), vaccine từ gạo chống bệnh dị ứng phấn hoa (Takagi et al., 2005). Tuy nhiên, nghiên cứu về sử dụng H5N1 làm vaccine ăn được còn rất hạn chế (Khandelwaal et al., 2003) 2.2.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vaccine phòng chống H5N1 ở Việt Nam Từ năm 2006 nhờ áp dụng chương trình tiêm chủng mở rộng trên toàn quốc đã hạn chế đáng kể sự lây lan dịch bệnh cúm gà. Nhu cầu sản xuất vaccine trở nên cấp bách hơn bao giờ hết. Vấn đề chẩn đoán và xây dựng phương pháp phát hiện nhanh và phân biệt cúm A với các tác nhân gây triệu chứng hô hấp khác, cũng như phân biệt các phân týp HA và NA đã được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm, kết hợp nghiên cứu với các tổ chức thế giới. Về nghiên cứu sản xuất vaccine, Viện Công nghệ Sinh học kết hợp với Viện Thú y, Xí nghiệp Thuốc thú y Trung ương, Công ty Thuốc thú y Trung ương II, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương, thực hiện nghiên cứu có được vaccine sản xuất từ chủng NIBRG-14 (Lê Trần Bình, 2007). Đây là chủng vaccine được tạo ra bằng công nghệ di truyền ngược tại Viện Tiêu chuẩn và kiểm định sinh học quốc gia (Vương quốc Anh), thích ứng trên phôi gà 10 ngày tuổi và vaccine tạo ra dưới dạng vô hoạt nhũ đầu. Kết quả là đã xây dựng được các quy trình sản xuất giống, sản xuất vaccine, kiểm nghiệm và bảo quản vaccine cúm A/H5N1, kiểm nghiệm miễn dịch đạt chất lượng bằng phương pháp huyết thanh học và thử thách cường độc. Ngoài ra, một số đề tài khác như nghiên cứu dịch tễ học phân tử, chẩn đoán, vector tái tổ hợp dẫn truyền kháng nguyên sử dụng adenovirus hoặc LaSoTa virus. Và đặc biệt nghiên cứu các gen HA và các biến chủng H5N1 làm cơ sở để chế 7 2007 – 2010 Báo cáo Tổng kết đề tài tạo vaccine được tiến hành trên một số Viện nghiên cứu ở nước ta và trên thế giới (Lê Trần Bình, 2007, Trần Quang Vui et al., 2008, Kodihalli et al., 1999). 2.3. Gen Hemagglutinin Gen HA có độ dài thay đổi tùy theo từng chủng virus cúm: A/H1N1 có độ dài 1778 bp, ở A/H9N1 – 1714 bp, còn ở A/H5N1 từ 1704 đến 1707 bp. Gen HA mã hóa cho protein kháng nguyên ngưng kết hồng cầu có độ dài 568−569 amino acid. Gen HA được phân lập từ chủng H1N1 (1934) Tây Ban Nha, chủng H5N1 (1996) ở Quảng Đông, Trung Quốc như các chủng nguyên thủy. Nhiều gen HA phân lập từ các chủng trong giai đoạn 1997-2003. Đó là các biến chủng có khả năng gây bệnh rất cao. Hệ gen của virus biến đổi nhanh, trong đó, những biến đổi gen HA thường xảy ra nhiều và sử dụng để phân định nhóm kháng nguyên, phân tuýp và phân tích mối quan hệ tiến hóa. Các chủng từ 1997-2002 vẫn mang tính đồng kháng nguyên, nhưng các chủng từ 2003 -2005 đã có bằng chứng của sự lệch kháng nguyên của A/H5N1. Cúm A/H5N1 có 12 genotype, những dạng cũ (A, B, C, D) trước 2002 không còn tồn tại, mà tồn tại 8 dạng mới (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+). Các chủng H5N1 phân lập tại Việt Nam từ 2004 đến 2006 đều thuộc dòng Quảng Đông, tập trung chủ yếu ở genotype Z, nhưng phân thành 2 nhóm: nhóm N – miền Bắc và nhóm S- miền Nam thuộc nhóm tiến hóa (clade) 1. Năm 2007 đã phát hiện thêm dưới dòng Phúc Kiến thuộc clade 2.3.4 ( Lê Thanh Hòa et al., 2008). Gen HA được phân lập từ chủng A/Ck/Vietnam/HG4/2005 (Hậu Giang) có 9 vị trí nucleotide sai khác hoàn toàn so với các chủng phân lập ở Việt Nam và Đông Nam Á, được xác định thuộc nhóm dưới dòng Quảng Đông và clade 1 (Trần Quang Vui et al., 2008). Hemagglutinin (HA) có thể được coi là một loại protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định tính độc lực của virus cúm A. Protein HA là một glycoprotein thuộc protein màng týp I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro). Kháng thể đặc hiệu với HA có thể phong tỏa sự ngưng kết đó, được gọi là kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI-Hemagglutinin Inhibitory antibody). Có 16 phân týp HA đã được phát hiện (H1-H16), ba phân týp (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử (Murphy & Webser, 1996). Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và khởi động quá trình xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender et al., 1999, Wagner et al., 2002). Phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130Å, thường ở dạng kết 3 (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ chuỗi HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa). Các đơn phân liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-). Các đơn phân sau khi tổng hợp đã được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là 8