Tài liệu Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen dreb2.7 liên quan đến tính chịu hạn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------ Nguyễn Thùy Linh NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ Nguyễn Thùy Linh NGHIÊN CỨU TẠO CÂY NGÔ CHUYỂN GEN DREB2.7 LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Huỳnh Thị Thu Huệ TS. Lê Hồng Điệp Hà Nội, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Huỳnh Thị Thu Huệ và TS. Lê Hồng Điệp. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào. Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ. Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn. Học viên Nguyễn Thùy Linh LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Thị Thu Huệ – Viện Nghiên cứu hệ gen và TS. Lê Hồng Điệp –Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh bản Luận văn Thạc sĩ này. Xin được cảm ơn đề tài cấp nhà nước: ―Phân lập thiết kế gen chịu hạn phục vụ công tác tạo giống ngô biến đổi gen‖ do Viện Nghiên cứu hệ gen chủ trì, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ quản đã hỗ trợ tôi về mọi phương diện để thực hiện nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng Đa dạng sinh học hệ gen - Viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Học viên Nguyễn Thùy Linh i năm MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................. ii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. iv DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vi BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Cây ngô và hạn hán ....................................................................................... 3 1.1.1. Tình hình về cây ngô ở nước ta .............................................................. 3 1.1.2. Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô ............................................ 4 1.1.3. Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán .................................. 5 1.2. Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn ............................................. 6 1.2.1. Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới ............. 6 1.2.2. Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới ................................................................................................................ 7 1.2.3. Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam ....................... 9 1.3. Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB ....................... 10 1.3.1. Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật ............................... 10 1.3.2. Họ nhân tố phiên mã DREB................................................................. 12 1.3.3. Nhân tố phiên mã ZmDREB2.7 .......................................................... 13 Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..................................................... 15 2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 15 2.1.1. Mẫu thực vật......................................................................................... 15 2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector và mồi ............................................................ 15 2.1.3. Hóa chất và môi trường ........................................................................ 17 2.1.4. Thiết bị nghiên cứu .............................................................................. 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 19 2.2.1. Tách chiết DNA ................................................................................... 19 2.2.2. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA .................................................... 20 2.2.3. Phương pháp PCR ................................................................................ 21 2.2.4. Tinh sạch DNA .................................................................................... 21 ii 2.2.5. Tạo tế bào khả biến E. coli và biến nạp bằng sốc nhiệt ....................... 21 2.2.6. Tạo tế bào khả biến A. tumefaciens và biến nạp bằng xung điện ........ 22 2.2.7. Nhân dòng gen ZmDREB2.7tv ............................................................. 22 2.2.8. Tạo vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv: :polyA .............................................................................................................. 23 2.2.9. Chuyển gen vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens .............. 24 2.2.10. Real-time PCR định lượng để ước lượng số bản sao của gen trong cây chuyển gen................................................................................................... 26 2.2.11. Real-time PCR định lượng để đánh giá sự biểu hiện của gen trong cây chuyển gen................................................................................................... 27 2.2.12. Phân tích cây chuyển gen ................................................................. 28 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................... 29 3.1. Kết quả phân lập gen ZmDREB2.7tv từ cây ngô Tẻ vàng 1 ....................... 29 3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá cây ngô Tẻ vàng 1 ................................ 29 3.1.2. Phân lập và tạo dòng gen ZmDREB2.7tv ............................................. 30 3.1.3. Phân tích trình tự gen ZmDREB2.7tv ................................................... 32 3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2.7tv ......... 35 3.2.1. Thiết kế vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv................... 35 3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv ...... 39 3.2.3. Tạo chủng A. tumefaciens EHA105 mang vector biểu hiện ................ 42 3.3. Kết quả tạo cây ngô biến đổi gen mang gen ZmDREB2.7tv ....................... 42 3.3.1. Chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô thế hệ T0 .............................. 42 3.3.2. Đánh giá cây chuyển gen thế hệ T0 ..................................................... 47 3.3.3. Tạo và đánh giá cây chuyển gen thế hệ T1 .......................................... 50 3.3.4. hệ T1 Ước lượng số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế .............................................................................................................. 51 3.3.5. Đánh giá sự biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T2 ......................................................................................... 53 KẾT LUẬN ............................................................................................................. 56 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 58 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta. .................................................................................................................... 4 Hình 1.2. Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm [32]. ......................................................................................................................... 7 Hình 1.3. Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn [32]. ......................................................................................................................... 8 Hình 1.4. Các nhóm protein tham gia vào quá trình đáp ứng của cây khi gặp hạn [28]. ....................................................................................................................... 11 Hình 2.1. Phương pháp tạo vector biểu hiện mang gen ZmDREB2.7tv ................ 24 Hình 3.1. Điện di đồ kiểm tra DNA tổng số từ ba mẫu lá ngô Tẻ vàng 1 ............ 29 Hình 3.2. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pJET1.2/ZmDREB2.7tv ......................................................................................... 31 Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv bằng enzyme giới hạn BglII. .......................................................................................... 32 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự ZmDREB2tv phân lập từ giống ngô Tẻ vàng 1 và trình tự tham chiếu ngô B73 bằng công cụ BioEdit. ........................................ 34 Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv ............................................................................................................................... 36 Hình 3.6. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pRTL2/rd29A: :ZmDREB2.7tv ...................................................................................................... 37 Hình 3.7. Kết quả kiểm tra plasmid pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv..................... 38 Hình 3.8. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pCAMBIA1300/ rd29A::ZmDREB2.7tv ........................................................................................... 40 Hình 3.9. Kết quả tạo plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv .............. 41 Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA .... ............................................................................................................................... 42 Hình 3.11. Quá trình chuyển gen vào ngô trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium....................................................................................................... 43 Hình 3.12. Điện di đồ DNA tổng số tách từ các cây chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T0 ................................................................................................................ 47 Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T0 ....................................... 48 iv Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HygR trong cây chuyển gen thế hệ T0 ............................................................................................ 49 Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm kiểm tra sự có mặt của gen quan tâm trong cây chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T2 .................................................................... 54 Hình 3.17. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện tương đối của gen ZmDREB2.7 của cây chuyển gen khi gặp hạn............................................................................ 54 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ............................... 16 Bảng 2.2. Thành phần các môi trường được sử dụng trong nghiên cứu ............... 17 Bảng 3.1. Kết quả chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô .................................. 46 Bảng 3.2: Kết quả phân ly của gen ZmDREB2tv trong cây chuyển gen thế hệ T1 ............................................................................................................................... 50 Bảng 3.3. Đường chuẩn khuếch đại của hai gen ZmDREB2.7tv và Glb-1 ........... 52 Bảng 3.4. Giá trị Ct và số lượng bản sao gen ZmDREB2.7tv của trong các cây chuyển gen thế hệ T1 ............................................................................................ 53 vi BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Actin-1 Gen actin-1 AP2/ERF2 AP2/ethylene-responsive element-binding AS Acetone syringone CBF C-repeat Binding Factors DNA Deoxyribonucleic acid DREB Dehydration-responsive element-binding Glb-1 Gen globulin-1 HygR Gen hygromycin ISAAA International Service for the Acquisition of Agribiotech Applications KL Khuẩn Lạc MS Murashige and Skoog Medium PCR Polymerization Chain Reaction rd29A Gen/promoter của gen rd29A RNA Ribonucleic acid USDA The United States Department of Agriculture ZmDREB2.7tv Gen ZmDREB2.7 phân lập từ ngô Tẻ vàng 1 vii MỞ ĐẦU Cây ngô là một trong các loài cây trồng quan trọng đối với con người. Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa. Mặc dù sản lượng tăng lên đáng kể trong vài năm trở lại đây, năng suất trồng ngô vẫn chưa đạt được giá trị tiềm năng của nó do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong đó, nguyên nhân chính ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất ngô là khô hạn, nhất là khi hiện tượng biến đổi khí hậu khiến các đợt hạn hán xảy ra thường xuyên hơn và nghiêm trọng hơn. Do đó, bên cạnh các biện pháp thủy lợi, việc nghiên cứu tạo giống ngô có khả năng thích ứng cao với điều kiện hạn hán là một trong những mục tiêu chính trong các chương trình lai tạo giống. Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật và sự chấp thuận cây trồng biến đổi gen ở nước ta đã mở ra một cơ hội, đồng thời là thách thức lớn trong việc tạo ra giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn. Nguyên nhân gồm cả khách quan và chủ quan như nguồn gen chưa được tập trung khai thác/nghiên cứu nhiều, công nghệ chuyển gen chưa được tiếp cận sớm, đồng thời cây ngô cũng là đối tượng khó để chuyển gen. Giống ngô Tẻ vàng 1 sống ở vùng núi đá thuộc tỉnh Điện Biên, nơi có nhiệt độ và lượng mưa hằng năm thấp. Giống ngô này đang được sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho các chương trình cải tạo giống bởi khả năng chịu hạn và chịu lạnh tốt. Đặc điểm có lợi này có thể liên quan đến các gen tham gia vào con đường chống chịu với bất lợi của cây. Thực vật đáp ứng với các yếu tố bất lợi thông qua các thay đổi về hình thái và sinh lý, mà cơ sở là thay đổi sự biểu hiện của các gen tham gia quá trình đáp ứng và bảo vệ. Sự biểu hiện của gen có liên quan chặt chẽ với hoạt động của các nhân tố khởi đầu phiên mã. DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ nhân tố phiên mã lớn, tham gia vào con đường đáp ứng với bất lợi của cây. Các gen mã hóa cho các protein trong họ này lần lượt được phân lập và nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau. Ở ngô, họ gen DREB gồm nhiều thành viên và trong đó ZmDREB2.7 đã được nhận định là một gen tiềm năng và tham gia đáng kể vào phản ứng chịu hạn ở cây. 1 Do đó, với mục đích cung cấp nguyên liệu cho việc tạo giống ngô biến đổi gen có khả năng chịu hạn, luận văn thạc sĩ được tiến hành với nội dung: ―Nghiên cứu tạo cây ngô chuyển gen DREB2.7 liên quan đến tính chịu hạn‖. Mục tiêu của nghiên cứu là phân lập gen DREB2.7 từ dòng ngô Tẻ vàng 1 chịu hạn. Từ đó, phân tích đặc điểm trình tự của gen và protein được dự đoán. Tiếp theo, gen ZmDREB2.7tv dưới sự điều khiển của promoter cảm ứng mạnh với hạn - rd29A được chuyển vào dòng ngô thuần để đánh giá khả năng chống chịu hạn của cây ngô chuyển gen. 2 Chƣơng 1 - TỔNG QUAN 1.1. 1.1.1. Cây ngô và hạn hán Tình hình về cây ngô ở nước ta Ngô là cây lương thực quan trọng ở nước ta, đứng vị trí thứ hai sau lúa. Ngô là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng và là bữa ăn chính của người dân tại nhiều khu vực đồi núi Việt Nam. Ngô cũng được sử dụng để sản xuất một vài sản phẩm công nghiệp như cồn, siro ngô, bột ngô... Đồng thời, thân và hạt ngô được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi. Trong đó, 80% tổng sản lượng ngô tiêu thụ hằng năm phục vụ cho ngành công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi. Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, diện tích trồng ngô ở nước ta vào năm 2017 là 1,1 triệu héc ta [1]. Con số này được dự báo sẽ tăng trưởng nhẹ vào các năm tới, sau đó giữ ổn định trong khoảng 0,95 – 1,1 triệu héc ta sau năm 2025 [1]. Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc, Việt Nam đứng thứ 24 về sản lượng ngô và thứ 28 về diện tích trồng ngô nhưng chỉ đứng thứ 56 về năng suất ngô vào năm 2016 [31]. Năng suất ngô trung bình năm 2016/2017 chỉ đạt 4,60 tấn/ha và với chi phí sản xuất lớn, sản lượng ngô quốc nội không thể cạnh tranh với ngô từ các nước khác. Ngô sản xuất trong nước chỉ đủ để đáp ứng từ 40 - 50% nhu cầu của thị trường. Do đó, hàng năm, Việt Nam phải nhập khẩu hàng triệu tấn hạt để phục vụ công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi (Hình 1.1). Vài năm trở lại đây, lượng ngô nhập nhẩu tăng đáng kể khiến nhà nước phải có các chính sách khuyến khích người dân chuyển đổi các vùng trồng lúa sang trồng ngô. Tuy nhiên, lợi nhuận từ việc trồng ngô thấp, chi phí trồng ngô cao khiến người nông dân từ bỏ nhiều diện tích trồng ngô. Theo dự đoán, để đáp ứng được nhu cầu về ngô, năng suất ngô nước ta phải đạt ít nhất 5 tấn/ha, giảm giá thành sản xuất và tăng thu nhập trong người nông dân [19]. Do đó, vấn đề nâng cao sản xuất ngô nội địa không chỉ đóng vai trò trong nông nghiệp mà còn quan trọng đối với kinh tế nước nhà. 3 Hình 1.1. Tổng sản lượng ngô tiêu thụ theo năm tài chính giai đoạn 2015-2018 ở nước ta. Đơn vị: triệu tấn [33] 1.1.2. Hạn hán ảnh hưởng đến năng suất cây ngô Năng suất trồng ngô nước ta tăng đáng kể trong những năm gần đây. Tuy nhiên, con số 4,60 tấn/ha vẫn tương đối thấp và chưa đạt được đúng tiềm năng có thể có ở cây ngô (so với Mỹ 11,08 tấn/ha) [31]. Năng suất của cây ngô có thể cao hơn nhiều, nhưng trên thực tế, nhiều nhân tố chủ quan và khách quan có tác động tiêu cực đến sản lượng ngô. Trong đó, hạn hán là một trong những nguyên nhân chính gây mất mùa ở ngô. Nhất là khi, cùng với hiện tượng biến đổi khí hậu, các đợt nắng nóng và hạn hán kéo dài xảy ra với tần suất ngày càng cao. Năm 2018 chứng kiến nhiều đợt hạn hán nghiêm trọng kéo dài ở khu vực châu Âu; Mỹ phải chịu đựng nhiều làn sóng nhiệt trong suốt mùa hè; châu Úc cũng báo cáo năm 2018 là năm nắng nóng kỉ lục. Ở nước ta, thời điểm cuối tháng 6, đầu tháng 7 năm nay, nắng nóng gay gắt xảy ra trên diện rộng các tỉnh Bắc Bộ và Trung Bộ đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động canh tác của nông dân. Trong khi đó, vụ đông xuân năm 2018-2019 cũng dược dự báo sẽ xảy ra nắng hạn đối với các tỉnh nam Trung bộ và Tây Nguyên. Do đó, hạn hán là vấn đề cấp bách không chỉ đối với cây ngô mà cả sản xuất nông nghiệp nói chung. Hạn hán gây ảnh hưởng đến toàn bộ chu trình sống của cây ngô, đặc biệt nghiêm trọng nếu hạn xảy ra vào giai đoạn phát triển, trước và sau khi ra hoa [12]. 4 Khi bị thiếu nước, cây ngô biểu hiện một loạt các triệu chứng như toàn bộ thân và lá sẽ chuyển từ màu xanh sang màu xanh xám, các lá có hiện tượng cuộn lại từ dưới lên trên ngọn, khí khổng lá đóng lại, quang hợp giảm mạnh, giảm cố định carbon và do đó sinh trưởng bị chậm lại. Nếu cây gặp hạn trước khi ra hoa 7-10 ngày, sự phát triển của bắp sẽ chậm hơn cờ, do đó quá trình phun râu chậm hơn sự tung phấn, điều này dẫn đến khả năng thụ phấn thấp. Nếu hạn nặng ở giai đoạn ra hoa có thể dẫn đến việc mất hoàn toàn bắp và do đó mất năng suất [8]. Nếu hạn hán xảy ra trong thời gian tạo hạt, bắp ngô sẽ có ít hàng hạt và các hàng không có nhiều hạt [13]. Như vậy, hạn hán dù ngắn hay dài, nhẹ hay nghiêm trọng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất của cây ngô. 1.1.3. Nâng cao năng suất ngô trong điều kiện hạn hán Hai hướng tiếp cận chính để giảm thiểu thiệt hại do thiên tai nói chung và hạn hán nói riêng đối với cây trồng là (1) giảm khả năng cây gặp điều kiện bất lợi và (2) làm tăng khả năng cây chống chịu với các bất lợi đó. Để giảm khả năng cây gặp hạn, thông thường cần cải tạo hệ thống thủy lợi tưới tiêu, xây dựng các hồ dự trữ nước để đối phó với điều kiện hạn. Đôi khi, việc thay đổi phương thức canh tác, thời gian canh tác cũng có thể giúp cây hạn chế gặp hạn ở các giai đoạn quan trọng trong chu trình sống. Tuy nhiên, thực tế là, ước tính khoảng 80% diện tích trồng ngô của nước ta không có hệ thống thủy lợi, hoạt động tưới tiêu phụ thuộc vào nguồn nước mưa tự nhiên. Hơn nữa, phần lớn ngô được trồng trên khu vực đồi núi trọc, núi đá, các khu vực này thường có khí hậu khắc nghiệt, điều kiện thời tiết thất thường, khả năng giữ nước của đất kém. Vì vậy, biện pháp giảm khả năng cây ngô gặp hạn trở nên bất khả thi trong thời gian cấp bách khi các đợt hạn xảy ra nhiều và khó dự báo hơn. Biện pháp làm tăng khả năng chống chịu với hạn của cây ngô được cho là có tiềm năng và lợi thế hơn. Hiện nay, người ta có thể dùng phương pháp lai tạo giống hoặc tạo cây chuyển gen để tạo ra các cây có tính trạng mới tốt hơn. Phương pháp lai tạo được coi là phương pháp truyền thống để tạo giống mới. Tuy nhiên, lai tạo 5 ngô cần nhiều thời gian, công sức và diện tích trồng. Hơn nữa, trong quá trình lai tạo, bên cạnh tính trạng mong muốn thường đi kèm với các tính trạng không mong muốn. Ngoài ra, sự cách ly sinh sản giữa các loài cũng là một trong những hạn chế của phương pháp lai tạo giống này [6]. Trong khi đó, phương pháp tạo cây biến đổi gen mang lại nhiều lợi thế cho người tạo giống. Thời gian để tạo cây mang tính trạng mong muốn cần ít thời gian hơn, phương pháp sàng lọc đơn giản hơn. Đồng thời, sự cách biệt về khoảng cách di truyền được xóa bỏ giúp các nhà khoa học có thể đưa vào cây trồng các đặc tính tốt của những loài nằm rất xa trong cây phát sinh chủng loại [6]. Do đó, ngày càng nhiều các giống cây trồng mới được tạo ra là kết quả của công nghệ tạo cây biến đổi gen. 1.2. 1.2.1. Nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen chịu hạn Tình hình nghiên cứu tạo giống ngô biến đổi gen trên thế giới Các nghiên cứu tạo cây ngô biến đổi gen trên thế giới bắt đầu từ những cuối những năm 1980, sau đó tăng dần vào đầu những năm 1990 và tăng mạnh trong giai đoạn 2000 - 2010 cùng với sự phát triển của cây trồng biến đổi gen nói chung (Hình 1.2) [32]. Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm trên đồng ruộng của cây ngô biến đổi gen luôn chiếm tỉ lệ cao trong tổng số các thử nghiệm được USDA cấp phép trong những năm qua, khoảng 30-50% (Hình 1.2). Đồng thời, diện tích trồng ngô biến đổi gen cũng tăng mạnh trong những năm gần đây. Tuy nhiên, số lượng các thử nghiệm trên đồng ruộng của cây ngô chuyển gen đang có xu hướng giảm trong vài năm gần đây, cùng với xu hướng của cây chuyển gen nói chung. Nguyên nhân là do cây số lượng lớn các nghiên cứu tìm kiếm các gen và con đường tiềm năng liên quan đến các tính trạng tốt đã được thực hiện từ những năm 2000. Do đó, các nghiên cứu hiện tại phần lớn tập trung vào việc khai thác các gen giá trị, tích hợp các gen này vào cùng một cây và tối ưu các yếu tố liên quan đến điều hòa gen trong cây chuyển gen. 6 Hình 1.2. Số lượng các thử nghiệm cây biến đổi gen trên đồng ruộng qua các năm [32]. Đến nay, ngô là loài cây trồng có số lượng sự kiện chuyển gen được USDA thông qua nhiều nhất với 148 sự kiện [18]. Từ đó đến nay, không thể phủ nhận lợi ích của ngô chuyển gen mang lại cho kinh tế, xã hội và môi trường. Năm 2017, diện tích trồng ngô biến đổi gen đạt 59,7 triệu ha toàn cầu, chiếm 32% tổng diện tích trồng ngô nói chung (188 triệu ha) [19]. Trong đó, 5,3 triệu ha trồng ngô có khả năng kháng sâu, 6,3 triệu ha ngô kháng thuốc diệt cỏ và 48,1 triệu ha trồng ngô có cả hai đặc tính trên. Việc trồng ngô biến đổi gen đã mang lại lợi nhuận cho người nông dân trong giai đoạn 21 năm (1996-2016) ước tính đạt 63,7 tỷ đô la Mỹ và chỉ riêng trong năm 2016 là 6,9 tỷ đô la Mỹ [19]. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu tạo giông ngô biến đổi gen chịu hạn trên thế giới Những thử nghiệm trên đồng ruộng đối với các giống cây biến đổi gen chịu hạn nói chung và cây ngô nói riêng bắt đầu từ năm 1998 với số lượng ít và tăng chậm trong 6 năm sau đó [32]. Tuy nhiên, con số này tăng dần từ năm 2005, đạt ổn định tương đối vào giai đoạn 2008-2015 (khoảng 100-150 thử nghiệm mỗi năm). Sau đó, số lượng các thử nghiệm giảm từ từ, đến năm 2017, chỉ 55 thử nghiệm về cây chuyển gen chịu hạn được cấp phép (Hình 1.3). Trong đó, cây ngô có số lượng thử nghiệm trên đồng ruộng cao nhất, trung bình chiếm 87% trong tổng số các loài cây trồng. Tuy vậy, so với các tính trạng trên cây ngô như kháng thuốc diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu, các thử nghiệm về tính trạng chịu hạn vẫn còn hạn chế (chiếm 9%). 7 Hình 1.3. Số lượng các thử nghiệm đồng ruộng của cây biến đổi gen chịu hạn [32]. Giống ngô chịu hạn đầu tiên là Genuity® DroughtGard™, do Công ty Mosanto sản xuất, được phê duyệt bởi USDA vào tháng 12 năm 2011, chứa gen CspB (cold shock protein B) có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus subtilis. Theo thống kê của ISAAA [19], diện tích trồng ngô Genuity® DroughtGard™ tăng từ 50.000 ha vào năm 2013 lên 810.000 ha vào năm 2015. Năm 2016, diện tích trồng ngô biến đổi gen chịu hạn đạt 1,2 triệu ha đã tạo ra lợi ích về kinh tế đạt 20 triệu đô la Mỹ, so với giai đoạn 2014-2016 là 33,3 triệu đô la Mỹ [19]. Giống ngô này sử dụng nước hiệu quả trong điều kiện bất lợi, do đó đã làm giảm các chi phí liên quan đến động tưới tiêu. Người nông dân ở các nước đang phát triển, có cánh đồng nhỏ và ít tập trung hơn sẽ thu được nhiều lợi ích hơn từ công nghệ này. Hơn nữa, các sự kiện ngô với tính trạng kết hợp như chịu hạn, chịu thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu đã được thử nghiệm từ năm 2014. Năm 2017, khoảng 1,4 triệu ha ngô chuyển gen chịu hạn với các tính trạng kết hợp khác [19]. Giống ngô biến đổi gen chịu hạn này cũng sẽ mang lại lợi ích cho người nông dân ở các nước thường xuyên phải đối mặt với các đợt hạn nghiêm trọng như châu Phi, châu Âu và một vài khu vực châu Mỹ Latin và châu Á. 8 1.2.3. Tình hình nghiên cứu cây ngô biến đổi gen ở Việt Nam Công nghệ sinh học được coi là công cụ quan trọng để đạt các mục tiêu quốc gia, do đó đang được tập trung nghiên cứu và phát triển để hiện đại hóa nền nông nghiệp và góp phần phát triển nông thôn Việt Nam. Tầm nhìn của nước ta đến năm 2020 là 70% các sản phẩm công nghiệp có nguồn gốc từ công nghệ sinh học. Trong đó, 30-50% là cây trồng biến đổi gen, 70% các cây giống có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro, 80% diện tích trồng rau và hoa quả sử dụng phân bón và chế phẩm trừ sâu có nguồn gốc sinh học. Cuối cùng, công nghệ sinh học với vai trò là một cấu thành của khoa học và công nghệ đóng góp 50% vào giá trị nông nghiệp ở nước ta [19]. Ở Việt Nam, ngô là cây trồng biến đổi gen đầu tiên được chấp thuận trồng thương mại [19]. Với con số 45.000 ha vào năm 2017, diện tích trồng ngô đạt mức tăng trưởng 13 lần so với năm 2015 là 3.500 ha. Đồng thời, ước tính 37.500 người nông dân đã chấp thuận và trồng ngô biến đổi gen vào năm 2017, tăng 29% so với năm 2016 [19]. Đến nay, Việt Nam đã cấp phép cho 22 sự kiện cây biến đổi gen, trong đó có 14 sự kiện là cây ngô được sử dụng làm thức ăn và thức ăn chăn nuôi. Trong đó, năm sự kiện (một sự kiện kháng thuốc diệt cỏ và bốn sự kiện đồng thời kháng côn trùng và thuốc diệt cỏ) được cho phép trồng thương mại ở nước ta [19]. Các giống ngô chuyển gen được trồng từ năm 2015 chủ yếu mang tính trạng kết hợp kháng côn trùng và kháng thuốc diệt cỏ. Nghiên cứu của Brookes và Barfoot đã ước tính rằng, việc chấp thuận ngô biến đổi gen vào năm 2015 đã dần dần mang lại lợi nhuận cho người nông dân và đồng thời được cho là làm giảm lượng ngô nhập khẩu [7]. Cụ thể, lợi ích của việc trồng ngô biến đổi gen từ năm 2015 đến 2016 ở Việt Nam đạt 5,45 triệu đô la Mỹ, trong đó 5 triệu đô la Mỹ chỉ tính trong năm 2016. Do đó, người nông dân Việt Nam sẽ có lợi nhiều hơn khi xu hướng chấp nhận cây biến đổi gen tăng nhanh [7]. Các nghiên cứu phân lập gen và tạo cây ngô chuyển gen ở Việt Nam mới đang ở giai đoạn đầu tuy nhiên đã đạt được những thành tựu nhất định. Nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đồng [2-4] đã phân lập và chuyển thành công 9 các gen chịu hạn ZmNF-YB2 và IPT vào các dòng ngô VH1 và C8H9 cho kết quả ổn định và đồng đều. Một nghiên cứu khác thực hiện chuyển gen CspB đã tối ưu hóa codon vào ba dòng ngô Việt Nam V152N, C436 và C7N với hiệu suất chuyển gen của ba dòng lần lượt là 0,90%, 0,28% và 0,50% [5]. Các nghiên cứu khác hiện nay tập trung vào việc phân lập các gen có giá trị và tiềm năng liên quan đến các tính trạng mong muốn; tối ưu hóa các quy trình chuyển gen và nuôi cấy mô để phù hợp với các dòng ngô nền của Việt Nam. 1.3. 1.3.1. Tính trạng chịu hạn ở thực vật và nhân tố phiên mã DREB Cơ sở phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật Khi cây đối mặt với hạn, một loạt các thay đổi về mặt sinh lý và hóa sinh được diễn ra ở cấp độ tế bào, bao gồm mất lực trương, thay đổi tính thấm và thành phần của màng, thay đổi nồng độ các chất hòa tan và sự tương tác của proteinprotein hay protein-lipid [9]. Cây có thể chống chịu với hạn bằng các cơ chế như tránh sự mất nước, thích ứng với sự mất nước, hoặc cả hai. Các hình thức chống chịu trên được điều khiển bởi các tính trạng hình thái và sinh trưởng như độ dày của rễ, khả năng rễ xâm nhập vào các lớp đất đặc, độ sâu và sinh khối rễ. Các tính trạng mang tính cơ định trên được thể hiện kể cả khi cây không gặp điều kiện hạn. Trong khi đó, các tính trạng mang tính thích ứng, ví dụ như khả năng điều hòa thẩm thấu và thích nghi với hạn, xuất hiện khi hiện tượng thiếu nước xảy ra [17]. Sự giảm hoạt động quang hợp, tích lũy các chất hữu cơ và hòa tan và sự thay đổi trong quá trình chuyển hóa carbohydrate là các đáp ứng sinh lý và hóa sinh điển hình khi cây gặp bất lợi. Sự giảm các hoạt động quang hợp là do các sự kiện khác nhau, ví dụ việc đóng khí khổng và giảm hoạt động của enzyme trong chu trình. Việc tổng hợp các chất có hoạt tính điều hòa thẩm thấu là một trong các cơ chế giúp cây thích nghi với điều kiện thiếu nước. Các phân tử này, hoạt động như là các nhân tố giúp cân bằng thẩm thấu, sẽ tích lũy trong các tế bào thực vật khi hạn xảy ra và sau đó bị phân giải khi điều kiện môi trường trở về bình thường. Đồng thời, các protein tham gia vào 10