Tài liệu Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen chitinase kháng bệnh đạo ôn nhờ vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Lúa gạo là cây lương thực chính của người dân Châu Á, cũng như ngô của dân Châu Mỹ, hạt kê của dân Châu Phi hoặc lúa mì của dân Châu Âu và Bắc Mỹ. Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo. Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính và hơn 110 quốc gia sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau. Lượng lúa gạo được sản xuất ra và mức tiêu thụ cao tập trung ở khu vực Châu Á. Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỉ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á. Con số này ước tính đã tăng lên gấp đôi, đối với những người này và người dân nghèo thường dùng lúa gạo là nguồn lương thực chính, và là nguồn thức ăn chủ yếu cho cuộc sống hằng ngày của họ. Khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn là năng lượng. Lúa gạo là cây lương thực quan trọng nhất của nước ta và trồng lúa là một nghề truyền thống của nhân dân Việt Nam từ rất xa xưa, từ người Việt cổ. Kinh nghiệm sản xuất lúa đã được hình thành, tích lũy và phát triển cùng với sự hình thành và phát triển của dân tộc ta. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật, sản xuất lúa trong nước và quốc tế đã thúc đẩy mạnh mẽ ngành trồng lúa nước ta vươn lên bắt kịp trình độ tiên tiến của thế giới. Những năm gần đây, Việt Nam đã tham gia vào thị trường lúa gạo quốc tế với sản lượng gạo xuất khẩu hàng năm đứng thứ 2 trong số các nước xuất khẩu gạo nhiều nhất thế giới. ĐBSCL và ĐBSH là hai vựa lúa lớn nhất của cả nước, đã góp phần quan trọng trong thành quả chung đó. Trong những năm qua Việt Nam đã chọn, tạo nhiều giống lúa có năng suất cao, phẩm chất tốt. Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu của Việt Nam nóng ẩm quanh năm, các yếu tố như đất đai, cỏ dại, dịch bệnh và hạn hán diễn biến rất phức tạp. Cây lúa dễ mắc các dịch bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra như 1 bệnh đạo ôn, khô vằn, bạc lá... đã làm giảm chất lượng và năng suất của lúa từ 20 – 80%, có nhiều nơi dịch bệnh đã làm cho mùa màng bị mất trắng. Việc sử dụng các chất độc hóa học trong bảo vệ thực vật đã ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe của con người và các sinh vật khác. Nghiêm trọng hơn là dư lượng các chất độc hóa học đó đã tồn tại trong đất, nước, qua chuỗi thức ăn ... làm mất cân bằng sinh thái, phá hủy môi trường sống đến mức báo động. Vì vậy, việc chọn tạo ra giống lúa mới có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu được sâu bệnh, côn trùng và những điều kiện khắc nghiệt của thời tiết, khí hậu để đáp ứng nhu cầu lương thực và bảo vệ môi trường đang là nhiệm vụ cấp thiết đối với nhà khoa học Ngày nay việc tạo ra các giống cây trồng mang gen kháng sâu, bệnh, đang được các nhà khoa học trong nước và quốc tế quan tâm nghiên cứu. Một trong các giải pháp được các nhà khoa học hướng tới là tạo giống mới bằng kĩ thuật chuyển gen, tuy còn khá mới mẻ nhưng kĩ thuật chuyển gen đã và đang được ứng dụng để tạo ra những vật liệu khởi đầu có giá trị cho nghiên cứu chọn tạo giống mới trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Tạo cây trồng mang gen kháng sâu, bệnh bằng phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là phương pháp nhanh nhất it tốn kém và đã đạt được kết quả trên nhiều đối tượng cây trồng như thuốc lá, cà chua, hoa cúc, đậu xanh, lúa và nhiều giống cây trồng khác. “Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen Chitinase kháng bệnh đạo ôn nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” là rất cần thiết mang tính ứng dụng cao nhằm tạo ra các giống lúa chuyển gen có năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh đạo ôn. 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu qui trình nuôi cấy mô thích hợp (môi trường tạo callus, môi trường tạo chồi từ callus, môi trường ra rễ ) từ hạt đối với hai giống lúa DT22 và lúa KDĐB (khang dân đột biến). 2 Ứng dụng qui trình tái sinh để chuyển gen Chitinase kháng bệnh đạo ôn vào hai giống lúa DT22 và lúa KDĐB nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Tạo ra giống lúa mang gen kháng bệnh đạo ôn Sử dụng các kỹ thuật PCR để xác định cây lúa chuyển gen 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Xuất phát từ các mục tiêu nói trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: Hiệu quả, thời gian và nồng độ thích hợp của hóa chất khử trùng với hai giống lúa. Bước đầu Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp để tạo callus, nhân nhanh callus, tái sinh chồi từ callus và ra rễ. Bước đầu xác định qui trình chuyển gen Chitinase vào hai giống lúa DT22 và lúa KDĐB nhờ Agrobacterium tumefaciens. Sử dụng các kỹ thuật PCR để xác định cây lúa chuyển gen 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Ý nghĩa khoa học Đề tài đã xác định được loại hóa chất, thời gian và nồng độ khử trùng thích hợp đối với hai giống lúa nghiên cứu trên. Bước đầu xác định được các điều kiện và thành phần môi trường thích hợp cho việc tái sinh cây chuyển gen từ hai giống lúa trên. Tạo nguồn nguyên liêu phục vụ cho nghiên cứu chuyển gen. Áp dụng qui trình tái sinh trong nghiên cứu chuyển gen kháng bệnh đạo ôn vào hai giống lúa DT22 và lúa KDĐB nhờ Agrobacterium tumefaciens. Ý nghĩa thực tiễn Xác định được môi trường nuôi cấy mô, tái sinh cây từ callus hạt gạo của hai giống lúa DT22 và KDĐB sau biến nạp phục vụ cho công tác tái sinh cây lúa chuyển gen 3 Tạo cây lúa chuyển gen kháng nấm đạo ôn làm vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác chọn tạo ra các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh đáp ưng nhu cầu an ninh lương thực trong nước và quốc tế ngày càng cao. Kết quả nghiên cứu cung cấp thêm thông tin khoa học cho các nghiên cứu chuyển gen kháng sâu bệnh vào một số giống lúa nhờ Agrobacterium tumefaciens. 4 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 1.1. Nguồn gốc, vị trí và phân loại cây lúa Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khảo cổ học, nguồn gốc của cây lúa là vùng Đông Nam Á và Đông Dương, những nơi mà có nhiều di tích của cây lúa phát triển khoảng 10.000 năm trước Công nguyên. Sau đó nghề trồng lúa được phát triển vào các nước Châu Á như hiện nay [6],[7],[43]. Cây lúa thuộc họ Graminae (hòa thảo), chi Oryza, loài Oryza sativa L. Chi Oryza có 23 loài trong đó có 2 loài lúa trồng là O. sativa phổ biến ở Châu Á và O. glaberrima phổ biến ở Tây Phi. O. sativa có 2n = 24 nhiễm sắc thể và được chia thành 3 loài phụ là Indica, Japonica và Javanica (hay Japonica nhiệt đới) [6], [35], [43], [44]. Lúa Indica thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có thân cao, dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá xanh nhạt cong và kháng được nhiều sâu bệnh. Hạt gạo dài và trung bình, có nhiều tinh bột. Năng suất kém hơn lúa Japonica. Lúa Japonica thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc nơi có độ cao trên 1000m (so với mặt nước biển), có thân ngắn, chống đổ, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thường tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì hàm lượng tinh bột ít. Lúa Japonica thường có năng suất cao hơn Indica. Lúa Japonica nhiệt đới được trồng phổ biến ở Indonesia, mang đặc điểm của 2 loại lúa Japonica và Indica. Hình thức gần giống như lúa Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi, thân cứng, chắc và ít cảm quang, hạt lúa thường có đuôi. Lúa Oryra glaberrima được trồng ở tây Châu Phi cách đây 3500 năm. Nguồn gốc của chúng có thể ở lưu vực sông Niger ở Mali, có thân cao như Indica, gié lúa thẳng, có ít hoặc không có nhánh phụ. Hạt lúa không có lông 5 trên vỏ trấu, gạo đỏ, có thể kháng nhiều sâu bệnh và chịu được hạn, nhưng năng suất kém hơn những loại lúa nói trên [43]. Nghiên cứu bằng isozyme, người ta có thể phân biệt O. sativa làm 6 nhóm rõ ràng hơn: Nhóm I (Indica), II, III, IV, V, và VI (Japonica). Trong đề tài này chúng tôi sử dụng callus của loài O. sativa L. với hai thứ là: O. sativa var. utitissima A. Camus (lúa tẻ) và O. sativa var. glutinosa Tanka (lúa nếp) để tiến hành nghiên cứu [20]. 1.2. Đặc điểm sinh học của lúa Các giống lúa có nhiều đặc điểm khác nhau về chiều cao, thời gian sinh trưởng, khả năng chịu thâm canh, chịu chua mặn, chống chịu sâu bệnh… tuy nhiên, chúng đều có những đặc điểm chung về hình thái, giải phẫu và sinh lý hóa sinh [10],[11],[19]. Trước hết về mặt hình thái, cơ quan sinh dưỡng của lúa bao gồm các bộ phận như thân, lá, rễ, hoa và hạt, mỗi bộ phận đều có đặc điểm riêng phù hợp với chức năng nhất định: Rễ: rễ lúa là loại rễ chùm. Nó được chia làm hai loại: loại thứ nhất là rễ mầm mọc từ phôi hạt, có tác dụng hút nước và chất dinh dưỡng đến lúc cây có 3 lá, loại thứ 2 là rễ đốt mọc ra từ các đốt thân nằm dưới mặt đất, có tác dụng hút chất dinh dưỡng nuôi cây, trao đổi không khí, giữ cho cây lúa đứng vững. Thân: thân lúa là loại thân thảo. Ở thời kì mạ và lúc lúa còn non thân lúa do các bẹ lá tạo thành. Sau khi làm đốt, thân lúa do các lóng và đốt tạo thành. Lá lúa: bao gồm lá mầm và lá thật. Lá mầm mọc ra trong quá trình ngâm ủ và thời gian đầu sau khi gieo mạ. Lá thật là lá mọc trong quá trình sinh trưởng sinh dưỡng của cây lúa và tồn tại trong suốt quá trình sinh trưởng của cây lúa. Hoa lúa: do có nhiều hoa trên 1 bông lúa quá trình trổ lại không đồng thời nên hoa lúa nở theo quy luật từ trên xuống dưới, từ ngoài vào trong. 6 Thời gian nở của hoa phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thời tiết: nếu thuận lợi, nhiệt độ thích hợp, đủ nắng, trời quang mây, gió nhẹ hoa nở rộ vào 8 – 9 giờ sáng; nếu trời nắng nóng hoa lúa sẽ nở sớm vào lúc 7 – 8 giờ sáng; nếu trời âm u thiếu ánh sáng hoặc gặp rét hoa lúa sẽ nở muộn từ 12 – 14 giờ trưa. Thời gian phơi màu, thụ tinh của hoa lúa từ khi mở vỏ trấu đến lúc khép lại khoảng 50 – 60 phút. Hạt lúa: mỗi hạt lúa được hình thành từ hoa lúa. Các hạt lúa xếp sít và gối lên nhau tạo thành bông lúa. [6],[7]. 1.3. Yêu cầu sinh thái 1. Yêu cầu lượng mưa: lúa được yêu cầu nhiều nước hơn các cây trồng khác. Lượng mưa cần thiết cho cây lúa trung bình từ 6 – 7 mm/ngày trong mùa mưa, 8 – 9 mm/ngày trong mùa khô. Một tháng cây lúa cần khoảng 200mm nước. Sự thiếu hụt hay thừa nước đều ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây lúa. 2. Yêu cầu ánh sáng: ánh sáng ảnh hưởng đến cây lúa trên 2 mặt. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quang hợp, số giờ chiếu sáng trong ngày ảnh hưởng đến sự phát triển, ra hoa, kết quả của lúa sớm hay muộn. Cường độ ánh sáng thích hợp cho lúa từ 250 - 400 calo/cm2/ngày. 3. Yêu cầu về nhiệt độ: nhiệt độ làm lúa sinh trưởng nhanh hay chậm, phát dục tốt hay xấu. Lúa sinh trưởng bình thường ở nhiệt độ 25 - 28 0C. Nếu nhiệt độ thấp hơn 170C sinh trưởng của cây lúa chậm lại, thấp hơn 13 0C thì lúa ngừng sinh trưởng, nếu nhiệt độ thấp kéo dài nhiều ngày lúa có thể chết. Nhiệt độ cao, trong phạm vi từ 28 - 35 0C thì lúa sinh trưởng nhanh nhưng chất lượng kém. Nhiệt độ lớn hơn 400C cây lúa sinh trưởng nhanh nhưng tình trạng sinh trưởng xấu, nếu kéo theo gió lào, ẩm độ thấp thì cây chết. Mức độ ảnh hưởng nhiệt độ cao hay thấp, mạnh hay yếu là tùy thuộc vào giống lúa và giai đoạn sinh trưởng, phát triển của lúa. Nhiệt độ thích hợp cho lúa nảy mầm là 28 - 320C, trổ bông, phơi màu yêu cầu nhiệt độ 20 - 38 0C. Nhiệt độ ảnh hưởng đến ra hoa kết quả sớm hay muộn của lúa. Một số giống lúa mẫn cảm 7 với nhiệt độ, khi tích lũy đủ một số nhiệt nhất định (tổng tích ôn) trong đời sống của mình thì sẽ ra hoa kết quả. Tổng tích ôn của giống ngắn ngày là 2000 - 25000C, giống dài ngày là 3000 - 35000C. 4. Yêu cầu thổ nhưỡng: đối với lúa nước được gieo cấy ở hầu hết các nhóm và các loại đất, nhưng muốn lúa có năng suất cao thì đất trồng phải đáp ứng một số yêu cầu sau: thứ nhất là địa hình bằng phẳng, thành phần cơ giới từ thịt trung bình đến thịt nặng; thứ hai về hàm lượng N,P,K tổng số đạt mức khá; thứ ba là độ pH từ 4,5 - 7,0; thứ tư là độ mặn phải thấp hơn 0,5% tổng số muối tan [7] 1.4. Giá trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế của cây lúa 1.4.1. Giá trị dinh dưỡng của cây lúa Lúa là một loại cây lương thực có giá trị dinh dưỡng cao. Bộ phận được sử dụng chủ yếu của cây lúa là hạt lúa. Ở hạt lúa hàm lượng tinh bột là 62,4%, đây là nguồn cung cấp năng lượng chủ yếu cho con người. Về hàm lượng protein, các giống lúa Việt Nam có hàm lượng protein chủ yếu trong khoảng 7 – 8 %, các giống lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn giống lúa tẻ. Hàm lượng lipit chủ yếu ở lớp vỏ cám, nếu ở gạo xay là 2,02% thì ở gạo đã xát chỉ còn 0,52%. Hàm lượng vitamin nhóm B như B1, B2, B6, PP… lượng vitamin B1 là 0,45 mg/100 hạt (trong đó phôi 47%, vỏ cám 34,5%, hạt gạo 3,8%). 1.4.2. Ý nghĩa kinh tế của cây lúa Theo số liệu của FAO, 2005: Trên thế giới, cây lúa được 250 triệu nông dân trồng. Cây lúa vừa là lương thực chính của 1,3 tỉ người nghèo trên thế giới, vừa là sinh kế chủ yếu của nông dân và là nguồn cung cấp năng lượng lớn nhất cho con người, bình quân 180-200 kg gạo/người/năm tại các nước Châu Á, khoảng 10 kg gạo/người/năm tại các nước Châu Mỹ [41], [43], 8 [44]. Việt Nam có tổng dân số trên 80 triệu người và 100% dân số sử dụng gạo làm lương thực chính. Hạt lúa là bộ phận chính được dùng làm lương thực, tất cả các bộ phận khác của cây lúa đều được con người sử dụng phục vụ cho nhu cầu cần thiết, thậm chí bộ phận rễ lúa còn nằm trong đất sau khi thu hoạch cũng được cày bừa vùi lấp để tăng chất mùn cho đất [7]. Do đó cây lúa có vai trò quan trọng trong đời sống của con người. Những nghiên cứu của cây lúa không chỉ có ý nghĩa về khoa học mà còn có ý nghĩa thực tế rất lớn [45],[48]. II. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LÚA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới Theo thống kê của FAO, năm 2005 cây lúa được trồng ở 114 nước và có mặt trên khấp các châu lục. Trong đó, Châu Phi có 41 nước, Châu Á có 30 nước, Bắc Trung Mỹ có 14 nước, Nam Mỹ có 13 nước, Châu Âu có 11 nước và Châu Đại Dương có 5 nước. Diện tích lúa biến động và đạt khoảng 152000 triệu ha, năng suất lúa bình quân xấp xỉ 4,0 tấn/ha. Ấn Độ là nước có diện tích trồng lúa lớn nhất 44790 triệu ha, ngược lại Jamaica là nước có diện tích trồng lúa thấp nhất 24 ha. Năng suất lúa cao nhất đạt 9,45 tấn/ha tại Australia và thấp nhất là 0,9 tấn/ha tại Iraq [43], [44]. Giai đoạn 2001- 2005, sản lượng lúa trên thế giới đều tăng, năm 2005 đạt 618441 triệu tấn. Trong đó, sản lượng lúa Châu Á đạt 559349 triệu tấn chiếm 90,45%; tương tự ở Nam Mỹ là 24020 triệu tấn (3,88%); ở Châu Phi là 18851 triệu tấn chiếm (3,04%); ở Bắc Trung Mỹ là 12537 triệu tấn (2,03%); ở Châu Âu và Châu Đại Dương là 3684 triệu tấn (0,6%). Như vậy trong giai đoạn này, Châu Á có sản lượng lúa lớn nhất thế giới. 2.2. Tình hình sản xuất lúa ở Việt Nam Nghề trồng lúa ở Việt Nam có lịch sử lâu đời nhất so với nghề trồng lúa ở các nước Châu Á. Theo các tài liệu khảo cổ ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam…cây lúa đã có mặt từ 3000-2000 năm trước công nguyên. Tổ tiên 9 chúng ta đã thuần hóa cây lúa dại thành cây lúa trồng và đã phát triển nghề trồng lúa đạt được những tiến bộ như ngày nay [4] Từ khi thực hiện đổi mới (năm 1986) đến nay, Việt Nam đã có những tiến bộ vượt bậc trong sản xuất lúa; đưa nước ta từ nước thiếu ăn triền miên đã không những đảm bảo đủ lương thực cho nhu cầu trong nước mà còn xuất khẩu từ 3 - 4 triệu tấn gạo/năm, đứng hàng thứ 2 trên thế giới về các nước xuất khẩu gạo. Tính đến ngày 06/10/2008 (theo số liệu của VFA), tình hình xuất khẩu gạo trong tháng 09/2008 đạt 342170 tấn, trị giá 211,222 triệu USD. Từ ngày 01/01/2008 đến ngày 30/9/2008 thì xuất khẩu gạo đạt 3554303 tấn, trị giá FOB 2153 tỷ USD [45]. III. BỆNH HẠI LÚA (DISEASES) Chúng ta có thể chia các bệnh lúa ra làm 5 nhóm tùy theo tác nhân gây bệnh: bệnh do vi khuẩn, bệnh do siêu vi khuẩn, bệnh do tuyến trùng, bệnh do sinh lý và bệnh do nấm như: bệnh đốm nâu, bệnh khô vằn, bệnh thối bẹ, bệnh đạo ôn… 3.1. Bệnh đạo ôn (Rice blast): Bệnh đạo ôn là một trong những bệnh làm thiệt hại nghiêm trọng năng suất ở lúa. Bệnh có ở khắp các vùng trồng lúa trên thế giới. Những thiệt hại do bệnh đạo ôn gây ra đối với lúa đã được thông báo thường xuyên trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Theo báo cáo thì năng suất có thể giảm tới 80% ở vùng dịch và thiệt hại do bệnh gây ra hàng năm vào khoảng 10 - 25%, (1992) [22]. Bệnh đạo ôn có thể xuât hiện lúc lúa non, đặc biệt gây tác hại mạnh nhất lúc lúa trổ. Do vậy, gây nên bông bạc hoặc hạt thóc bị đen, lep lửng, làm giảm sản lượng và chất lượng của lúa khá nhiều. Bệnh có thể gây hại rất sớm từ nương mạ nhưng thường bị nặng nhất là giai đoạn làm đòng đến sau trổ một thời gian. Nấm có thể tấn công ở mọi bộ phận của cây lúa nhưng nhiều nhất là ở phiến lá. Bệnh cũng xuất hiện trên các đốt thân làm gãy ngang thân lúa hoặc trên cổ bông (bệnh khô 10 cổ bông) làm tắt nghẽn mạch dẫn nhựa nuôi hạt, bông lúa bị gãy, hạt bị lép và lững (hình1.1) Tác nhân gây bệnh là một loại nấm ký sinh có tên khoa học là: Pyricularia grisea hay P. Oryzae Cav. (1988) [14] thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Monilaceae. Loại nấm bệnh này xâm nhập và ký sinh ở lá, cổ bông và thân lúa để hút chất dinh dưỡng của cây chủ. Khi xâm nhập vào lúa, sợi nấm hình thành một đĩa bám, bám chặt vào bề mặt cây chủ, đồng thời hình thành một sợi xuyên đục thủng lớp biểu bì của tế bào để hút chất dinh dưỡng. Sợi nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong tế bào qua khí khổng. Trên lá, vết bệnh nhỏ màu nâu, sau phát triển thành vết bệnh điển hình có dạng hình mắt én hoặc hình thoi, thuôn nhọn hai đầu, ở trung tâm có màu xám, xung quanh có viềng nâu, ngoài viền nâu thường có một quầng vàng. Nhiều vết bệnh liên kết lại làm cả lá lúa bị cháy khô. Sau đó, sợi nấm mọc ra cuống bào tử, cuống đâm qua các lỗ khí hay các lỗ thoát nước của cây lúa và lộ ra ngoài. Trên cuống có nhiều bào tử hình quả lê có một đến hai vách ngang. Sợi nấm, cuống bào tử và bào tử nấm rất bé, qua kính hiển vi mới nhìn thấy được. Khi trời râm mát, ẩm ướt ta thường thấy trên vết bệnh có phủ một lớp mốc màu xám xanh, đó chính là cuống và bào tử của nấm. Việc lây nhiễm và phá hoại lúa của bệnh đạo ôn theo trình tự như sau: sợi nấm nằm trong thóc giống hay rơm rạ bị bệnh cũ, đến vụ sau lúc gieo cấy gặp thời tiết thích hợp, sợi nấm sinh bào tử, bào tử bay rơi bám vào cây lúa, mọc mầm sinh sợi nấm, kết bám vào cây, tiếp tục sinh bào tử, phát triển và lan truyền ra gây hại cho đến lúc thu hoạch thì nấm lại nằm trong thóc và rơm rạ (1988) [14]. Tốc độ xâm nhập vào tế bào cây chủ tuỳ thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm, nhiệt độ thuận lợi nhất cho sự xâm nhập này là ở 24 - 28 0C, độ ẩm khoảng 85 - 100% và ít ánh sáng mặt trời. Do vậy, những lúc trời mát, có sương mù hay mưa phùn ruộng thiếu nước và bón nhiều phân đạm, sạ cấy quá dày thì khả năng phát bệnh tăng lên. 11 Để phòng trừ bệnh đạo ôn có hiệu quả, nhiều phương pháp đã được sử dụng như: diệt sạch cỏ dại, rơm rạ có chứa mầm bệnh trước khi canh tác, gieo sạ với mật độ vừa phải, bón phân cân đối N, P và K; đặc biệt là phân kali để tăng cường tính kháng của tế bào cây đối với sự xâm nhập của nấm bệnh. Dùng thuốc hoá học, cấy xen kẽ nhiều giống lúa trên môt vùng, điều khiển thời vụ, gieo trồng các giống kháng. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy triển khai gieo trồng giống kháng là một hướng mang lại hiệu quả kinh tế và không gây hại cho môi trường trong công tác phòng trừ bệnh đạo ôn (bonman và cs, 1988; Trần Duy Quý, 1997 [13] [16]). Hình 1.1. Bệnh đạo ôn Ngoài ra lúa còn mắc các bệnh do vi khuẩn như bệnh bạc lá, bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá, bệnh tungro, bệnh bướu rễ...và các bệnh do tuyến trùng gây ra IV. NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG TÁC GIỐNG CÂY TRỒNG 4.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật Mỗi tế bào sống tách ra từ một cơ thể, khi ở điều kiện thích hợp đều có khả năng phân chia và phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh, tính chất này gọi là tính toàn năng (totipotence) của tế bào, lần đầu tiên được Habelandt sử dụng. 12 Tính toàn năng là cơ sở của nuôi cấy tế bào in vitro, từ tế bào thực vật riêng rẽ có thể tái sinh thành cơ thể thực vật hoàn chỉnh. [2] Tính toàn năng của tế bào nói lên khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào soma nào đó tách ra từ cơ thể. Các tế bào lấy từ bất kì một mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) nếu được nuôi cấy trong môi trường thích hợp đều có khả năng phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, ra hoa và kết quả bình thường. Các loại mô phân tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc có thể phát triển thành callus. Callus là loại tế bào chưa phân hóa, phân chia liên tục và có khả năng phát triển thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh. Tính toàn năng là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật, trong đó kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào đang ngày càng phát triển và hoàn thiện.Nuôi cấy mô và tế bào đã nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực công tác cải tạo giống cây trồng, đưa ngành trồng trọt vào thế kỷ công nghệ hiện đại [15]. 4.2. Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô Quy trình vi nhân giống thông thường gồm 5 giai đoạn chính, mỗi giai đoạn có những yêu cầu riêng: * Giai đoan 1: Chuẩn bị cây làm vật liệu. * Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng. * Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi * Giai đoạn 4: Tạo rễ * Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng. 4.3. Ứng dụng nuôi cấy mô trong công tác giống cây trồng Ngày nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực đang phát triển mạnh mẽ theo những hướng ứng dụng chính sau đây: Nhân nhanh các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc khó nhân giống bằng các phương pháp nhân giống thông thường khác. 13 Duy trì và nhân nhanh những kiểu gen quý đặc biệt là những kiểu gen có nguy cơ bị tyuệt chủng nhằm mục đích làm nguyên liệu khởi đầu cho việc nhângiống cây trồng. Duy trì và nhân nhanh những dòng bố mẹ đồng hợp tử để phục vụ cho công tác sản xuất hạt lai. Bảo quản nguồn gen thực vật - Làm sạch virut - Sản xuất và chuyển hoá sinh học các hợp chất tự nhiên. - Làm công cụ để các phương pháp cải tiến giống bằng công nghệ hiện đại như lai tế bào soma, chuyển ghép gen ở thực vật có thể ứng dụng được. [3] Ở Việt Nam, từ năm 1975 nhiều phòng nuôi cấy mô đã được thành lập và thu được nhiều kết quả. Viện di truyền nông nghiệp và Viện CNSH đã hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô và đưa vào sản xuất nhiều giống cây trồng như hoa hồng, lan, cúc, đồng tiền …Trường Đại học Nông nghiệp I đã hoàn thiện quy trình và đưa vào sản xuất giống khoai tây sạch virus. Sự mở rộng của công nghiệp vi nhân giống không chỉ làm tăng tiềm năng sản xuất cây trồng mà còn thúc đẩy việc đồn điền hoá, trang trại hoá, công nghệ hóa các mặt hàng nông nghiệp. V. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN Kỹ thuật chuyển gen đã và đang trở thành nhân tố quan trọng trong chương trình chọn tạo giống cây trồng. Có thể chia nguyên lý chuyển gen lam 2 cách: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. 5.1. Chuyển gen trưc tiếp 5.1.1. Chuyển gen bằng xung điện Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh. Khi đặt các tế bào trần (protoplast) trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổI, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào. Một 14 loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành tuỳ thuộc vào điện trường, làm cho DNA bên ngoài môi trường được truyền qua lỗ hổng vào tế bào. Môt số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện mà không cần xử lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. Zang và cs,(1988) đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần sử dụng phương pháp xung điện [6]. Sau một năm shimamoto và cs, (1989) đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở giống lúa japonica sử dụng phương pháp xung điện [6]. 5.1.2. Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection) Người ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn. Phương pháp này có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được. Phương pháp này cần có thiết bị có độ chính xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải chính xác. 5.1.3. Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube) Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nẩy mầm và hình thành ống phấn. Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào. Phương pháp này khá thành công, Đặc biệt trên cây lúa và cây bông. 5.1.4. Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics) Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou và cs, (1991) và kỹ thuật này đươc cải tiến bởi Cao va cs, (1992); Li và cs, (1993) [5]. Ngay lập tức, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa japonica. Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen cũng đã được áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều giống japonica (Christou và cs, 1998; Datta và cs, 1999 [6]. Cheng và cs 15 (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen [6]. Đây là kỹ thuât tương đối hiện đại và có hiệu quả. Khi sử dụng thiết bị (súng bắn gen) tạo được áp lực sẽ đẩy viên đạn được làm bằng kim loại trơ (vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích thước vào khoảng 1μm, với vận tôc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ. Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phương pháp dùng súng bắn gen không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao. Ở một vài trường hợp, tần suất chuyển gen bằng phương pháp này ngang bằng với tần suất chuyển gen với cây hai lá mầm [6] 5.2 Chuyển gen gián tiếp 5.2.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng được coi như là một vectơ. Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau: - Bộ gen có cấu trúc DNA - Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại - Phổ ký chủ rộng - Có khả năng tải - Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào Có hai loại virus đảm nhận được vai trò làm vectơ chuyển gen là: * Cauliflower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải đặc biệt là suplơ. DNA ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật nhờ sự lây nhiễm lá bởi virus. Các CaMV có thể nhân lên trong bào tương một cách độc lập, không gây trở ngại cho tế bào vật chủ [1]. Song vectơ CaMV có một số hạn chế: - Phổ ký chủ không rộng (chỉ ở các cây họ cải) - Lượng DNA ngoại lai gắn vào ít, chỉ khoảng 250bp 16 * Genini virus: - Có phổ ký chủ rộng: cây một lá mầm, hai lá mầm - Có nhược điểm lớn là hầu như không truyền được qua hạt. Do đó muốn nhân các cây chuyển gen trong trường hợp này phải nhân vô tính. 5.2.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyển gen vào thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium. VI. VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS VÀ QUÁ TRÌNH CHUYỂN GEN TỰ NHIÊN VÀO THỰC VẬT 6.1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Vào những năm đầu thế kỷ XIX, người ta đã nhận thấy ở một số cây hai lá mầm xuất hiện những nốt sần hay khối u và đã phân lập được một loài vi khuẩn và đặt tên cho chúng là Agrobacterium tumefaciens (sau đó người ta tìm thấy một loại vi khuẩn Agrobacterium gây bệnh rễ tơ ở thực vật, đó là vi khuẩn A. rhizogenes, chúng làm mất khả năng điều khiển sự phát triển của rễ dẫn đến sự tăng sinh khối và phân nhánh cao tạo ra rất nhiều rễ tơ (còn gọi là bệnh rễ tóc) gọi là vi khuẩn A. rhizogenes [3]. Agrobacterium thuộc họ Rhizobiaceae, là vi khuẩn yếm khí gram âm. Chi này có ba loài sau: A. Radiobacter, A. rhizogenes, A. tumefaciens [1] [7] [25]. Qua nhiều công trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định, ở những tế bào của cây bị tổn thương, A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm và kích thích tạo khối u tại vị trí đó. Các khối u là nơi cư trú và cung cấp các chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của A. tumefaciens trong tế bào thực vật. Khi phân tích khối u, người ta thấy trong nó có các chất lạ chưa hề có trong đó như các acid amin lạ: octopin, nopalin. khối u không ngừng phát triển kể cả khi diệt hết vi khuẩn. Như vậy, chứng tỏ vi khuẩn đã chuyển vào 17 trong cây một tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ, tác nhân có bản chất là vật chất di truyền. Khi nghiên cứu vi khuẩn này, người ta thấy trong vi khuẩn có chứa một plasmid có kích thước lớn mà nếu xử lí vết thương cho cây bằng vi khuẩn không chứa plasmid thì không gây khối u, còn nếu chữa vết thương bằng vi khuẩn có chứa plasmid thì gây ra khối u. Như vậy có thể nói plasmid chính là tác nhân gây khối u và sản sinh ra vật chất lạ do vi khuẩn chuyển vào, plasmid này được gọi tên là Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) Sự hình thành khối u xảy ra ở nhiệt độ từ 28 0C - 300C, trùng với nhiệt độ chuyển plasmid trong quá trình tiếp hợp của vi khuẩn. Khả năng tạo khối u bị mất đi khi vi khuẩn sinh trưởng ở 360C. Người ta cũng phát hiện thấy khả năng gây độc của vi khuẩn mất đi cùng với sự biến mất của một plasmid cỡ lớn, plasmid gây tạo khối u hay Ti-phlasmid (Walden R, 1988) [25]. 6.2 Ti-plasmid và quá trình gây tạo khối u bởi Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid là một phân tử DNA mạch vòng, kích thước khoảng 200kb, phân tử lượng của nó sấp xỉ 1,2.10 8 tức bằng 3 - 5% NST vi khuẩn. Trong tế bào thực vật chúng tồn tại như một đơn vị sao chép độc lập. Ti-plasmid ở các chủng Agrobacterium khác nhau đều có bốn vùng tương đồng (Swapan K. Datta et.al, 1997; (Walden R, 1988) [24] [25]. - Vùng có liên quan đến sự tái bản - Vùng liên quan đến sự tiếp hợp. - Vùng gây độc hay còn gọi là vùng vir (Virulen region). - Vùng T-DNA. Qúa trình gây tạo khối u có liên quan trực tiếp đến hai vùng T-DNA và vùng gây độc (vùng vir). 6.2.1 Vùng T-DNA Vùng T-DNA là vùng được chuyển vào tế bào thực vật và gây nên các khối u thực vật. Có hai hệ gen tồn tại trên T-DNA là: 18 - Hệ gen thứ nhất quy định quá trình sinh tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Khi các gen này được dịch mã sẽ dẫn đến sự phân chia các tế bào một cách liên tục do nồng độ auxin và cytokinin tăng lên, gây ra khối u. - Hệ gen thứ hai quy định quá trình sinh tổng hợp các opine. Đây la các acid amin lạ có nguồn gốc từ arginine và không bao giờ xuất hiện trong tế bào bình thường. Cac opine này được phân giải nhờ các enzym do gen nằm trên Ti-plasmid quy định và được sử dụng làm nguồn dinh dưỡng nitơ và cacbon cho vi khuẩn. Dựa vào các opine ta có các chủng A.tumefaciens khác nhau [25]: - Chủng tạo octopine. - Chủng tạo nopaline. - Chủng tạo succinamopine hoặc L-succinamopine. T-DNA được giới hạn bởi hai bờ phải (Right border) và bờ trái (left border). Hai bờ có cấu trúc lặp lại gồm 24 cặp bazơ nitơ. Chỉ những đoạn DNA nằm giữa hai bờ mới được chuyển vào tế bào thực vật, còn hai bờ phải và bờ trái là những yếu tố cần thiết cho sự chuyển DNA. Tuy nhiên, quá trình chuyển T-DNA lại do vùng gây độc quy định [25]. 6.2.2 Vùng gen vir Vùng vir dài 35kb mang các gen gây độc. Vùng này bao gồm gen vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, vir G (một số chủng còn có vir F). Trong đó gen vir A, vir B, vir D, vir G cần thiết cho tạo độc tính [25]. Hoạt động của gen vir giúp T-DNA này ra khỏi vi khuẩn, xâm nhập vào tế bào thực vật. Sự biểu hiện của các gen vùng vir là một quá trình sinh hoá phức tạp ma các tác nhân đầu tiên tác động đến nó là hợp chất phenolic. Với những đặc tính này A.tumafaciens được sử dụng như một vectơ để chuyển gen vào cây [24]. 6.3 Các vectơ chuyển gen và quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật Cấu trúc của vectơ chuyển gen vào thực vật là đặt các gen mong muốn vào môi trường di truyền và vi khuẩn thích hợp để chuyển gen mong muốn 19 nào vào cây và hợp nhất với bộ gen của cây chủ. Một vectơ chuyển gen cần chứa các thành phần sau: - Gen khởi động (thường có nguồn gốc từ thực vật hoăc liên quan trực tiếp với thực vật như CaMV) - Một đoạn gen kết thúc (như NOS-terminater). - Đoạn chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản như EColR1. - Đoạn nhận biết enzym gới hạn (Multicloning Site). - Các gen chỉ cho phép chọn lọc tế bào vi khuẩn và các mô tái sinh thực vật. Các vectơ chuyển gen ở vi khuẩn A.tumefaciens được tạo ra nhờ gắn trực tiếp một gen quan tâm vào giữa hai bờ của T-DNA, là những đoạn cần thiết để định hướng cho quá trình chuyển gen [25]. Một cơ sở quan trọng giúp cho kỹ thuật này phát triển là nhờ cấu trúc 2 bờ phải và trái của Ti-plasmid, là yếu tố cần thiết cho quá trình xâm nhập của T-DNA vào tế bào chủ. Điều này có nghĩa rằng nếu thay thế các gen nằm trên T-DNA bằng những gen mong muốn thì chúng cũng có thể chuyển vào tế bào thực vật. Hơn nữa, khi những gen tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng trên T-DNA bị loại bỏ, tế bào được biến nạp sẽ không sinh sản quá nhanh và khối u không hình thành. Tuy nhiên, những tế bào này có khả năng tái sinh và phát triển bình thường. Bên cạnh đó, dãy vật chất của Agrobacterium có phổ rất rộng, nó có khả năng xâm nhập vào hầu hết các loại cây hai lá mầm. Hơn nữa các gen trên T-DNA được di truyền theo quy luật Mendel và mỗi gen có promoter riêng nên các gen ngoại lai đưa vào có thể kết hợp và được biểu hiện [3]. Các hệ thống vectơ dựa trên Ti-plasmid đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu và phát triển theo cách riêng, hiện nay chúng vẫn đang được cải tiến nhằm mang lại hiệu quả tối ưu. Tuy nhiên có thể chia chúng thành hai nhóm chính. 20