Tài liệu Nghiên cứu tách nhóm lignan và triterpenoid từ cây rau gai thối (acacia pennata (l.) willd.) thu hái ở sơn la

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC VŨ THỊ YẾN NGHIÊN CỨU TÁCH NHÓM LIGNAN VÀ TRITERPENOID TỪ CÂY RAU GAI THỐI (Acacia pennata (L.) Willd.) THU HÁI Ở SƠN LA Chuyên ngành: TN2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Lò Thị Mai Thu Sơn La, tháng 05 năm 2018 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian học tập và nghiên cứu, khóa luận của em đã được hoàn thành, với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý thầy cô ở Khoa Sinh – Hóa, Phòng Sau đại học – Trường Đại học Tây Bắc đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong suốt thời gian em học tập, nghiên cứu tại trường. Em xin chân thành cảm ơn các anh, chị ở Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ trong quá trình làm thực nghiệm. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lò Thị Mai Thu đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em trong quá trình làm khóa luận. Để hoàn thành khóa luận, em còn nhận được sự quan tâm, giúp đỡ, động viên của các đồng nghiệp, bạn bè, gia đình. Em xin chân thành cảm ơn! Sơn La, tháng 05/2018 Sinh viên thực hiện Vũ Thị Yến MỤC LỤC A. MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1 I. Tổng quan tài liệu .......................................................................................................... 1 1. Tình hình sử dụng các hợp chất tự nhiên trong dược, mỹ phẩm trên thế giới và tại Việt Nam ........................................................................................................................... 1 1.1. Trên thế giới ............................................................................................................... 1 1.2. Tại Việt Nam.............................................................................................................. 5 2. Giới thiệu về cây rau gai thối ....................................................................................... 6 2.1 Phân loại...................................................................................................................... 6 2.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................................... 6 2.3. Tác dụng dược lý ....................................................................................................... 6 3. Giới thiệu về lignan và triterpenoid ............................................................................. 7 3.1. Tính chất .................................................................................................................... 7 3.2. Công dụng .................................................................................................................. 8 II. Lí do chọn đề tài ........................................................................................................... 8 III. Mục tiêu đề tài ............................................................................................................ 9 IV. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu ................................................................ 9 4.1. Nguyên liệu ................................................................................................................ 9 4.2. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................... 10 4.2.1. Hóa chất, dung môi ............................................................................................... 10 4.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................... 10 4.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 11 4.3.1. Thu hái và kiểm nghiệm dược liệu ....................................................................... 11 4.3.2. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập các hợp chất...................................................... 11 4.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập ....................................................... 11 4.4. Nghiên cứu hình thái giải phẫu cơ quan sinh dưỡng và cơ quan sinh sản ............. 11 4.5. Tách nhóm saponin .................................................................................................. 11 4.6. Các phương pháp phân lập hợp chất ....................................................................... 13 4.6.1. Kết tinh phân đoạn ................................................................................................ 14 4.6.2. Thăng hoa.............................................................................................................. 14 4.6.3. Chưng cất phân đoạn ............................................................................................ 14 4.6.4. Các phương pháp sắc ký ....................................................................................... 14 4.6.4.1. Phương pháp sắc ký cột ..................................................................................... 14 4.6.4.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế ............................................................ 15 4.6.4.3. Sắc ký lỏng cao áp điều chế .............................................................................. 16 V. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ............................................................................ 16 5.1. Đối tượng nghiên cứu. ............................................................................................. 16 5.2. Phạm vi nghiên cứu. ................................................................................................ 16 5.3. Đặc điểm điều kiện tự nhiên khu vực nghiên cứu .................................................. 16 5.3.1 Vị trí địa lý ............................................................ Error! Bookmark not defined. 5.3.2 Đất đai ................................................................... Error! Bookmark not defined. 5.3.3. Tài nguyên rừng ................................................... Error! Bookmark not defined. 5.3.4. Khí hậu ................................................................. Error! Bookmark not defined. 5.3.5. Thủy văn .............................................................. Error! Bookmark not defined. B. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ. ....................................... 19 1. Sơ đồ tách các chất ..................................................................................................... 19 2. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng... ...................................................................................................................... 21 C. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................... 22 1. Kết luận ....................................................................................................................... 22 2. Kiến nghị ..................................................................................................................... 22 D. TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 23 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu................................................. 10 Bảng 2. Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu.......................................... 10 DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cấu trúc của lignan .............................................................................................. 7 Hình 2. Sơ đồ định lượng lignan và triterpenoid toàn phần trong nguyên liệu Rau gai thối theo phương pháp cân .............................................................................................. 13 Hình 3. Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn các chất từ thân cây rau gai thối (Acacia pennata (L.) Willd.) ........................................................................................................ 19 Hình 4. Quy trình phân lập hợp chất LO từ cắn n-hexan của lá cây gai rau thối .......... 21 Hình 5. Sắc ký đồ SKLM của hợp chất LO ................................................................... 21 A. MỞ ĐẦU I. Tổng quan tài liệu 1. Tình hình sử dụng các hợp chất tự nhiên trong dƣợc, mỹ phẩm trên thế giới và tại Việt Nam 1.1. Trên thế giới Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến. Dược điển các nước khu vực châu Á như Việt Nam, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản đều có các chuyên luận về dược liệu. Một số chuyên luận dược liệu cũng đã được đưa vào Dược điển Mĩ, châu Âu... Theo ước tính, 70% dân số toàn cầu vẫn sử dụng thuốc từ dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu tại cộng đồng. Vì vậy, tổ chức y tế thế giới đã nhấn mạnh việc đảm bảo chất lượng của các thuốc này phải dựa trên các kĩ thuật phân tích hiện đại, với việc sử dụng các chất chuẩn đối chiếu phù hợp [21] Trên thế giới, đã phát hiện được 265.000 loài thực vật. Trong đó có 150.000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới, 35.000 loài có ở các nước ASEAN. Trong số này có ít nhất 6.000 loài được dùng làm thuốc. Các loài thực vật có chứa khoảng 5 triệu hợp chất hóa học. Cho tới nay, đã có 0,5%, nghĩa là 1.300 cây được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và giá trị chữa bệnh. Thuốc từ dược liệu được sử dụng không chỉ các nước Á Đông mà còn được tiêu thụ một lượng khá lớn ở các nước Phương Tây. Ở các nước có nền công nghiệp phát triển thì một phần tư số thuốc kê trong các đơn có chứa hoạt chất từ dược liệu. Tại Mĩ năm 1980 giá trị số thuốc đó lên tới 8 tỉ đô la, tại thị trường Châu Âu lượng thuốc đông dược tiêu thụ cũng lên tới 2,3 tỉ đô la. Nhiều biệt dược đông dược của Trung Quốc được tiêu thụ mạnh ở các nước phát triển.[21] Về sử dụng thuốc, ở khu vực Đông Á, Trung Quốc, Nhật Bản, cùng với Ấn Độ, là các nước tiêu thụ đông dược nhiều nhất. Tại Trung Quốc, đông dược chiếm khoảng 30% lượng dược phẩm tiêu thụ, doanh số đông dược sản xuất tại Trung Quốc để tiêu thụ nội địa và xuất khẩu năm 2003 ước đạt 20 tỉ đô la. Tại Nhật Bản, đông dược được gọi với tên “Kampo”, cũng được chấp nhận và sử dụng rộng rãi, với doanh số khoảng 1 tỉ đô la mỗi năm. Ở khu vực Đông Nam Á, Indonesia là nước đứng thứ hai trên thế giới sau Brazil về đa dạng sinh học cây thuốc, có tới 90% số lượng cây thuốc trên thế giới được tìm thấy ở đây. Theo số liệu năm 1995, có 40% dân số Indonesia sử dụng 1 đông dược, trong đó có 70% sinh sống ở vùng nông thôn. Các nước Đông Nam Á khác đều có tỉ lệ sử dụng đông dược đáng kể trong cộng đồng và hệ thống y tế.[21] Hóa học các hợp chất thiên nhiên trong phát triển thuốc đã trải qua thời kỳ vàng son vào những năm 1940 đến những năm 1960. Ngày nay, với những kỹ thuật sàng lọc hoạt tính sinh học mới, hiện đại, với tốc độ nhanh, lượng mẫu nhỏ, việc phát hiện các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mới là rất có triển vọng. Sau khi phát hiện ra các hoạt chất có hoạt tính mới thì việc nghiên cứu chuyễn hóa chúng thành các dẫn xuất bằng nhiều con đường trong đó có hóa tổ hợp để thử hoạt tính sinh học vẫn là một lĩnh vực hấp dẫn.[21] Về nghiên cứu phát triển, hiện nay các công ty đa quốc gia đang có xu hướng phát triển các dược phẩm có chứa một hoạt chất từ cây thuốc (tinh chất dược liệu) do các chế phẩm này có giá trị kinh tế lớn hơn nhiều so với các sản phẩm chứa cao thuốc (extracts) hoặc hợp chất toàn phần chưa xác định được trong các công thức cổ truyền, kinh điển. Ở Trung Quốc giai đoạn 1979 - 1990 có 42 chế phẩm thuốc mới từ cây thuốc được đưa ra thị trường, trong đó có 11 chế phẩm chữa bệnh tim mạch, 5 chế phẩm chữa ung thư, 6 chế phẩm chữa tiêu hóa. Cho đến nay đã có trên 4.000 bằng sáng chế về thuốc đông dược của Trung Quốc được đăng kí, với 40 dạng bào chế khác nhau, được sản xuất ở 684 nhà máy chuyên về đông dược. Từ năm 1990 đến nay là giai đoạn phát triển rất mạnh đối với lĩnh vực sản xuất thuốc từ dược liệu với hàng trăm chế phẩm mới ra đời. Nhật Bản là nước dẫn đầu thế giới về nghiên cứu các hợp chất có tác dụng sinh học từ cây thuốc, chiếm 60% bằng phát minh trên thế giới về lĩnh vực này trong 5 năm (1990 - 1995). Trong giai đoạn 2000 – 2005 các công ty dược phẩm đa quốc gia đã có 23 thuốc mới từ nguồn gốc tự nhiên được phép đưa ra thị trường để điều trị bệnh ung thư, bệnh thần kinh, bệnh nhiễm trùng, bệnh tim mạch, các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch, chống viêm… Điển hình là các thuốc Bivalirudin (MDCO, 2000), Ozogamicin (Wyeth – Ayerst, 2000), Pimecrolimus (Novatis, 2001), Nitisinone (Swedish Orphan, 2002), Ziconotide (Elan, 2004), Exenatide (Eli Lilly, 2005), Micafungin (Fujisawa, 2005)... Ở Việt Nam, một số thuốc đang được nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I, II, III như thuốc viêm lợi Dentonin, thuốc trị lỵ và hương hàn Geranin, thuốc hỗ trợ và điều trị ung thư Panacrin, thuốc điều hòa miễn dịch Angala….[21] 2 Về pháp chế dược và đăng kí thuốc, theo báo cáo của WHO năm 2011, tốc độ xây dựng và ban hành qui chế quản lí thuốc từ dược liệu phát triển khá nhanh trong khoảng thời gian từ năm 1986 đến 2007. [21] Sự phát triển nhanh chóng các thuốc từ cây cỏ là do xu hướng của các nước phương Tây nhằm tăng cường tự điều trị, và do lo lắng về tác dụng bất lợi của chế phẩm hóa dược và sự nâng cao nhận thức của cộng đồng về vai trò của thuốc từ dược liệu trong điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thông thường.[21] Với sự phát triển của các kĩ thuật phân tích hiện đại, nhiều hoạt chất được tách chiết từ dược liệu, nghiên cứu xác định cấu trúc và tác dụng dược lí. Kết hợp với công nghệ bào chế, các nhà sản xuất đã cho ra đời những dạng thuốc thuận tiện cho người sử dụng như viên nén, viên nang, cốm thuốc, trong đó nguyên liệu đầu vào là tinh chất hoặc cao dược liệu chuẩn hóa có hàm lượng hoạt chất chính xác.[21] Điển hình trong nhóm này là các chế phẩm viên nén, viên nang cao Bạch quả (Ginkgo biloba), chứa các hoạt chất ginkgo flavnol glycosides, terpene lactones, bilobalide, ginkgolide A, ginkgolide B, ginkgolide C; viên tỏi chứa dịch chiết tỏi có hoạt chất chính là allicin, viên nén cao Cúc gai dài (Cardus marianus) chứa hoạt chất chính là silymarin... Nhiều hoạt chất chiết xuất từ dược liệu được tinh chế đạt đến độ tinh khiết có thể sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc tiêm. Điển hình trong nhóm này là các chế phẩm thuốc tiêm chứa flavonoid của Ginkgo biloba (biệt dược Tanakan®, Pháp; thuốc tiêm chứa paclitaxel phân lập từ cây Taxus Brevifolia (biệt dược Taxol ®, Mĩ); thuốc tiêm chứa vinblastin phân lập từ cây Vinca rosea (biệt dược Velbe ®, Pháp)… Do sự phức tạp về cấu trúc hóa học nhiều chất trong nhóm này cho đến nay vẫn chưa tổng hợp được.[21] Hiện nay, nguồn tài nguyên cây cỏ và tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc là cơ sở quan trọng để sàng lọc và tìm ra thuốc mới. Hướng nghiên cứu này đang rất được coi trọng ở các nước có nền y học tiên tiến như Mĩ, Pháp, Nhật Bản, Trung Quốc.[21] Ứng dụng công nghệ thông tin trong việc thiết kế các phân tử thuốc mới, cũng như trong nghiên cứu mối tương quan cấu trúc – hoạt tính đang ngày càng phát triển. Mặc dù đa số các công ty dược lớn trên thế giới trong thời gian vừa qua chưa đầu tư tích cực lắm cho việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên. Tuy nhiên, việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên vẫn được đẩy mạnh trong các thập niên vừa qua và chắc chắn sẽ phát triển mạnh trong thời gian tới.[21] 3 Đặc biệt, trong những năm gần đây đã có những thay đổi đáng kể trong việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất thiên nhiên.[21] * Cách tiếp cận trong thu thập mẫu nghiên cứu Cho đến nay có 6 cách tiếp cận khi thu thập mẫu nghiên cứu. Đó là: chọn địa điểm một cách ngẫu nhiên, dựa vào phân loại học, dựa vào y học dân tộc, dựa vào hóa thực vật, dựa vào cơ sở thông tin dữ liệu và dựa vào sự cầu may. Gần đây, cách tiếp cận dựa vào hóa thực vật và cơ sở thông tin đã có những thay đổi do sự phát triển mạnh mẽ của hai lĩnh vực này. Ví dụ khi cần thu thập các mẫu có một hoạt tính nào đó thì cơ sở dữ liệu có thể cho ta: - Danh sách của những cây có hoạt tính này theo kinh nghiệm của y học dân tộc - Danh sách các cây đã có số liệu về hoạt tính này qua phép thử in vitro, in vivo hoặc trên người. - Danh sách các nguồn hợp chất thiên nhiên có hoạt tính này hoặc có hoạt tính của một trong các phép thử trên. Trường hợp danh sách này quá dài thì người ta kết hợp với các yếu tố khác như: Mẫu dễ kiểm tra hay khó kiểm, sự độc đáo về mặt thực vật hoặc hóa thực vật, tính đặc hữu để lựa chọn một danh sách ngắn hơn. Quan trọng là phải thu tất cả các bộ phận của cây. Một trong những con đường để tìm kiếm nhanh các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là dựa vào Thực vật dân tộc học (Ethnobotany) với tạp chí dẫn đầu là Journal of Ethno – pharmacology. [21] * Về các phƣơng pháp phân tích. Nhiều kỹ thuật mới đã được sử dụng để tách chất như: sắc ký giọt ngược dòng, sắc ký ngược dòng quay, sắc ký phân chia ly tâm. Việc sử dụng pha đảo trong sắc ký tách chất (sắc ký lớp mỏng và sắc kỷ lỏng hiệu năng cao) đã góp phần giải quyết những khó khăn lớn trong lĩnh vực các hợp chất thiên nhiên. Những năm gần đây kỹ thuật chiết cặp ion và sắc ký lỏng hiệu năng cao cặp ion đã được sử dụng để tách điều chế các alkaloid quinolin và isoquinolin bậc bốn.[21] Kỹ thuật sử dụng các chất đồng phân quang học làm pha tĩnh trong sắc ký khí và sắc ký lỏng để tách các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính quang học cũng đem lại kết quả tốt..[21] Gần đây người ta phát triển kỹ thuật “Quan sát toàn cột” ứng dụng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao và điện di mao quản. Ở phương pháp quan sát toàn cột người ta sử 4 dụng nhiều bộ diod trên một đoạn cột dài 1cm để kiểm soát độ pic trong quá trình tách chất. .[21] Những năm gần đây đã xuất hiện khái niệm “Metabolomic” trong phân tích. Đó là một lĩnh vực khoa học nghiên cứu các chất trao đổi của tế bào sống. Metabolom được định nghĩa là một tập hợp định lượng và định tính tất cả những chất phân tử lượng thấp có mặt trong tế bào. Những chất này tham gia vào phản ứng trao đổi chất và cần thiết cho việc duy trì, sinh trưởng cũng như chức năng bình thường của một tế bào. Chiến lược phân tích Metabolomic bao gồm 5 thành phần như sau: - Metabolomic: là phép phân tích định tính và định lượng tất cả các chất trao đổi (metabolit) trong một hệ sinh học. Độ chọn lọc và độ nhạy của phương pháp phân tích đòi hỏi ở đây rất cao.[21] - Metabolite profiling: là phân tích định tính và định lượng một số chất trao đổi chọn lọc theo định hướng, thường là theo con đường trao đổi chất đặc thù. Trong công nghiệp dược phương pháp này được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu thuốc, sản phẩm biến đổi của thuốc và hiệu quả của quá trình điều trị.[21] - Metabolic fingerprinting: phân tích nhanh mẫu để có thể phân loại được mẫu. Vì không phân tích định tính và định lượng nên thời gian phân tích mẫu ngắn, thường chỉ một phút (hoặc ngắn hơn). Đây là một công cụ sàng lọc để phân biệt mẫu của những trạng thái hoặc nguồn gốc sinh học khác nhau. [21] - Metabolite target analysis: định lượng và định tính một hoặc vài chất trao đổi (metabolit) liên quan đến một phản ứng trao đổi đặc thù. [21] - Metabonomic: đánh giá sự thay đổi của các mô và dịch sinh học trong hệ thống trao đổi chất nội sinh, hình thành do quá trình bệnh sinh hoặc quá trình điều trị.[21] 1.2. Tại Việt Nam Việt Nam cũng có một số mặt hàng đông dược xuất khẩu có uy tín ở thị trường nước ngoài như hoa hòe, quế, sa nhân, dừa cạn, các loại tinh dầu hồi, quế, tràm... Nhu cầu sử dụng đông dược ở nước ta cũng rất lớn. Theo đánh giá của Viện Dược liệu năm 1995, nhu cầu dược liệu toàn quốc khoảng 30.000 tấn, cung cấp cho 145 bệnh viện y học cổ truyền, 242 khoa y học cổ truyền trong bệnh viên đa khoa và khoảng 30.000 lương y đang hành nghề, ngoài ra còn cần khoảng 20.000 tấn cho nhu cầu xuất khẩu. Nhiều chế phẩm đông dược đã được nghiên cứu tại các viện nghiên cứu 5 và chuyển giao kĩ thuật cho các xí nghiệp sản xuất trong nước, như thuốc viêm gan Haina, thuốc hạ cholesterol máu và hạ huyết áp Ruventat, thuốc chống đái tháo đường Morantin, thuốc nhỏ mũi Ngũ sắc, thuốc hòa tan sỏi thận Somatan, Sotinin, thuốc tăng tuần hoàn máu Angelin, thuốc viêm gan Phyllantin.[21] Trong năm 2010, Cục quản lí Dược, Bộ Y tế Việt Nam đã cấp phép nhập khẩu cho 106 chế phẩm từ dược liệu thuộc 15 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới, số lượng cụ thể như sau: Hàn Quốc: 44, Ấn Độ: 20, Trung Quốc: 15, Hồng Kông: 1, Đài Loan: 1, Nhật Bản: 1, Thái Lan: 3, Malaysia: 2, Pakistan: 1, Argentina: 2, Thụy Sĩ: 1, Australia: 1, Đức: 2, Pháp: 1, Mĩ: 7. [21] 2. Giới thiệu về cây rau gai thối Nước ta là một nước nông nghiệp, chính vì vậy, các công trình nghiên cứu về thực vật ngày càng phát triển và mang lại những ý nghĩa vô cùng to lớn; hiểu biết về các đặc điểm sinh lí của thực vật, ta có thể kiểm soát được sự phát triển của chúng, chủ động trong việc phòng ngừa sâu bệnh, điều hòa sinh trưởng, nâng cao năng suất, chất lượng cây trồng. Ở Việt Nam thường gặp loài Acacia pennata (L.) Willd. 2.1. Phân loại Bộ: Bộ Đậu (Fabales) Họ: Họ Đậu (Fabaceae) Chi: Chi Senegalia Tên khoa học: Acacia pennata (L.) Willd [22] 2.2. Đặc điểm hình thái Dây leo, có khi là cây bụi phân nhánh nhiều, mọc trườn, có nhiều gai, nhánh non có lông. Lá kép lông chim hai lần; cuống chung có tuyến mang 16 cặp lá chét bậc nhất, mỗi lá chét này lại mang 17-35 cặp lá chét bậc hai; dài 4-5mm, rộng 1-2mm; lá kèm 2-3mm. Chuỳ hoa ở ngọn hay ở nách gồm nhiều đầu hoa trắng, to cỡ 13mm. Quả thuôn, mỏng dài tới 13cm, rộng tới 3cm; hạt thuôn, không đều, dẹp, màu nâu hay đen.[22] 2.3. Tác dụng dƣợc lý Ở Campuchia, người ta dùng các chồi dinh dưỡng làm rau ăn, vỏ cây dùng trong y học dân gian.[22] Ở Lào, người ta dùng rễ của thứ insuavis làm thuốc trị thiếu máu.[22] 6 Ở Ấn Độ, cây được sử dụng nhiều: dịch lá lẫn với sữa dùng cho trẻ em ăn không tiêu, còn lá giã ra với đường và nghệ dùng đắp vết thương; dịch vỏ dùng trị nọc độc; quả và thân dùng để duốc cá. [22] 3. Giới thiệu về lignan và triterpenoid 3.1. Tính chất Lignans thực vật là các chất polyphenolic có nguồn gốc từ phenylalanine thông qua sự dimer hóa của rượu cinnamic thay thế, được gọi là monolignols (1) và khung dibenzylbutane (2). Phản ứng này được xúc tác bởi các enzym oxy hóa và thường được kiểm soát bởi các protein dirigent. Hình 1. Cấu trúc của lignan Nhiều sản phẩm tự nhiên, được gọi là phenylpropanoids, được tạo thành từ các đơn vị C6C3 (n-propylbenzene skeleton) (1), có nguồn gốc từ các đơn vị cinnamyl cũng giống như cấu trúc hóa học terpene được xây dựng trên các đơn vị isoprene. Cấu trúc (3) là một neolignan, một cấu trúc được hình thành bằng cách kết hợp hai dư lượng propylbenzen khác với nguyên tử cacbon của chuỗi phía propyl. Các terpenoid là một nhóm lớn các hợp chất thiên nhiên, chúng là dẫn chất của các đơn vị là isopren. Cấu trúc hóa học của nó có chứa các khung cacbon (C5)n và được phân loại như sau: - Các hemiterpen (C5) - Các monoterpen (C10) - Các sesquiterpen (C15) - Các diterpen (C20) - Các sesterterpen (C25) - Các triterpen (C30) - Các tetraterpen (C40) 7 Các polymer có cấu tạo lớn hơn như cao su. Các terpenoid được sinh tổng hợp từ acid mevalonic và deoxyxylulose phosphat dưối sự tác dụng của nhiều tác nhân khác. Triterpenes là một loại hợp chất hóa học gồm ba đơn vị terpene với công thức phân tử C30H48 ; chúng cũng bao gồm sáu đơn vị isoprene. Động vật, thực vật và nấm tất cả tạo ra triterpenes, ví dụ quan trọng nhất là squalene vì nó tạo thành cơ sở của hầu như tất cả các steroid. Các Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O; Carbanil C=O; nối đôi C=C. [26] 3.2. Công dụng Các hợp chất lignan trên có một số tác dụng sinh học đáng chú ý như kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ký sinh trùng sốt rét, diệt tế bào ung thư bạch cầu, kháng nấm, chống oxi hóa - bảo vệ tế bào gan. Lignan xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid béo, ức chế hấp thụ cholesterol và sinh tổng hợp, chất chống oxi hóa và giảm tác dụng vitamin A, tác dụng hạ huyết áp, cải thiện chức năng gan kết hợp với quá trình chuyển hóa rượu, và các hiệu ứng chống lão hóa. Nghiên cứu gần đây đã tập trung nghiên cứu các tính năng đặc biệt của các hợp chất lignans có trong nhiều loại mè khác nhau, trong đó đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc giảm lượng mỡ trong máu và huyết áp, chống viêm và ung thư, tăng cường khả năng chống oxi hóa của cơ thể, tăng cường vitamin E sinh khả dụng. Triterpenoids có tính chất hóa học phong phú và dược học (ví dụ như cholesterol ) với một số motiefs pentacyclic; đặc biệt lupane, oleanane và ursane cho thấy hứa hẹn là chất chống ung thư. Triterpenoids là những hợp chất hữu cơ có cấu trúc đa dạng. Một số triterpenoids, bao gồm ursolic và acid oleanolic, acid betulinic, celastrol, pristimerin, lupeol, và avicins có kháng u và đặc tính kháng viêm. Triterpenoids có tính đa chức năng và các hoạt động chống khối u của các hợp chất được đo bằng khả năng của mình để ngăn chặn hạt nhân tố-kappaB kích hoạt, gây apoptosis, ức chế tín hiệu đầu dò, và kích hoạt phiên mã và hình thành mạch. [27] II. Lí do chọn đề tài Dân tộc Thái có mặt ở Tây Bắc Việt Nam từ rất sớm, sống tập trung ở các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Yên Bái, Hoà Bình và Điện Biên có hai nhóm địa phương là Thái đen và Thái trắng. Người Thái có kinh nghiệm và kỹ thuật thâm canh cây nông nghiệp và các loại cây thuốc trên nương từ rất lâu để phục vụ nhu cầu đời sống. Người Thái 8 Tây Bắc biết rất nhiều loài thuốc và cây thuốc quý có dược tính cao, khả năng phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh, trong đó có các bệnh nan y, bệnh hiểm nghèo nguy hiểm đến tính mạng người bệnh. Các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập một số chất chuyển hóa thứ cấp từ Cây rau gai thối (Tiếng Thái: Co phắc nam min) (Acacia pennata (L). Willd.) họ Fabaceae bao gồm alkaloid, saponin, polysaccharides, terpenoid, tannin ngưng tụ và flavonoid. Gần đây, hoạt động chống viêm, chống ung thư bằng cách ức enzyme COX-1 đã được báo cáo trong một số nghiên cứu của Úc và Trung Quốc. Các chất này giúp giảm đau, chống viêm, gia tăng tầm độ hoạt động các khớp, cải thiện sức chịu lực và sức cơ quanh ổ khớp. Hồi phục lại các thành phần cấu tạo nên khớp và sụn khớp, ngăn ngừa sự tiến triển của các bệnh viêm khớp có nguy cơ làm biến dạng khớp. Ngoài ra, cung cấp canxi, giúp xương khớp chắc khỏe. Kích thích cơ thể sản xuất insulin và tránh tình trạng kháng insulin giúp ngăn ngừa và điều trị bệnh tiểu đường hiệu quả. Đồng thời, ức chế sự tăng trưởng của tuyến tiền liệt theo tuổi tác, nâng cao hệ thống miễn dịch giúp tuyến tiền liệt bài tiết, ngăn ngừa và điều trị tốt bệnh phì đại tiền liệt tuyến. Cây rau gai thối từ lâu không chỉ là món ăn đặc sản bổ dưỡng dùng ngọn luộc, làm nộm, nấu canh của người Thái Sơn La mà còn được biết đến là vị thuốc chữa sỏi thận, viêm khớp, mát gan thông tiểu, lợi mật. Cây rau gai thối rất nổi tiếng ở Thái Lan được dùng để chế biến các món ăn cho du khách quốc tế với tên là “Cha-om” nhưng ở Việt Nam việc nghiên cứu về chúng gần như chưa có công bố khoa học nào mà thường là các kinh nghiệm dân gian. Xuất phát từ thực tiễn trên, tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu tách nhóm lignan và triterpenoid từ cây rau gai thối (Acacia pennata (L.) Willd.) thu hái ở Sơn La. III. Mục tiêu đề tài - Tách chiết nhóm lignan và triterpenoid từ cây rau gai thối. IV. Cách tiếp cận và phƣơng pháp nghiên cứu 4.1. Nguyên liệu Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là bộ phận lá của cây rau gai thối thu hái tại huyện thành phố Sơn La, tỉnh Sơn La tháng 06 năm 2017 và đã được xác định tên khoa học là (Acacia pennata (L.) Willd.) Mẫu nghiên cứu hiện được lưu giữ tại khoa 9 Sinh Hóa – Trường Đại học Tây Bắc và Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. 4.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 4.2.1. Hóa chất, dung môi Bảng 1. Dung môi, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu STT Hóa chất, dung môi sử dụng Tiêu chuẩn 1 Acid sulfuric (H2SO4) DĐVN IV 2 Methanol (MeOH) DĐVN IV 3 n-butanol (BuOH) DĐVN IV 4 n- hexan (Hx) DĐVN IV 5 Ethyl acetat (EtOAc) DĐVN IV 6 Nước cất DĐVN IV 7 Chất nhồi cột là Silica gel GF254, cỡ hạt 63-200 µm (Merck) DĐVN IV 8 Silica gel Merck LiChroprep® RP-18, Sephadex LH-20. DĐVN IV 9 Bản mỏng silica gel F254, RP18 F254s (Merck) DĐVN IV 4.2.2. Thiết bị, dụng cụ Bảng 2. Trang thiết bị, máy móc sử dụng trong nghiên cứu STT Tên thiết bị, dụng cụ Xuất sứ 1 Cân kỹ thuật Precisa Thụy sỹ 2 Ống đong các loại (10-2000ml) Đức 3 Bình cầu đáy tròn các loại 100-2000ml Đức 4 Bình gạn 1-2 lít Đức 5 Bình chiết, phễu, cốc, buret… Đức 6 Máy chiết cách thủy (dung tích 10 lít) Đức 7 Các loại cột sắc ký (cột thủy tinh) Đức 8 Máy cất thu hồi dung môi 9 Tủ sấy Memmert 10 Tủ lạnh Nhật Bản 11 Bình chạy sắc ký lớp mỏng Nhật Bản 12 Đèn tử ngoại Nhật Bản Nhật Bản Đức 10 4.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 4.3.1. Thu hái và kiểm nghiệm dƣợc liệu - Dược liệu lá rau gai thối sau khi thu hái được rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô chuẩn bị cho nghiên cứu. - Dược liệu được thẩm định tên khoa học theo khóa phân loại thực vật và có sự trợ giúp của các chuyên gia thực vật và dược liệu. - Dược liệu được kiểm nghiệm theo các tiêu chí đơn giản như độ ẩm, độ nhiễm nấm mốc, sơ bộ đánh giá hàm lượng hoạt chất trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng . 4.3.2. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập các hợp chất Chiết hoạt chất từ dược liệu bằng ethanol 96% theo phương pháp ngâm chiết (ở nhiệt độ phòng). Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Phân đoạn dịch chiết bằng dung môi công nghiệp có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat và n-butanol. Sử dụng sắc ký cột với các chất hấp phụ silica gel pha thường, pha đảo, Sephadex LH-20 để phân lập các chất. Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn. 4.3.3. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 365 nm) phun thuốc thử H2SO4 10% /ethanol và hơ nóng ở 110oC, kiểm tra bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (nếu cần thiết). 4.4. Nghiên cứu hình thái giải phẫu cơ quan sinh dƣỡng và cơ quan sinh sản Thu thập mẫu ở ngoài tự nhiên đưa về phòng thực hành quan sát, đo kích thước và làm các tiêu bản lát cắt rễ, lá. 4.5. Tách nhóm saponin Saponin toàn phần được định lượng theo phương pháp cân như sau: Cân chính xác 20g bột nguyên liệu, gói vào túi giấy lọc, cho vào cốc thuỷ tinh 200ml, ngâm bằng 100ml methanol trong 24 giờ. Sau đó đặt vào bình Soxhlet chiết trong 8 giờ. Cất thu hồi dung môi được cắn, thêm 30ml nước lắc cho tan, chuyển sang bình gạn 100ml, dùng ether ethylic lắc để loại tạp cho đến khi lớp ether ethylic không có màu. Dịch thu được lắc với n-butanol bão hoà nước đến khi lớp n-butanol không có màu. Gộp dịch nbutanol, bốc hơi n-butanol đến còn khoảng 4-5ml, cho vào chén cân đã sấy khô và xác định khối lượng trước, bốc hơi dung môi đến cắn. Sấy cắn ở nhiệt độ 60-650C đến khối lượng không đổi và đem cân. Lặp lại thí nghiệm 3 lần để lấy giá trị trung bình. 11 Hàm lượng saponin toàn phần được tính theo công thức: X% = a x 100 m−mb Trong đó: X%: Hàm lượng saponin toàn phần b: Độ ẩm của nguyên liệu (%) a: Khối lượng cắn saponin thu được (g) m: khối lượng dược liệu đem chiết (g)  Xác định độ ẩm mẫu nghiên cứu Độ ẩm nguyên liệu được xác định theo phương pháp sấy . Nguyên tắc: Mẫu thử được sấy ở 1050C, nước trong mẫu sẽ bốc hơi làm giảm khối lượng mẫu, cân khối lượng mẫu sau khi sấy sẽ tính được độ ẩm của mẫu. Tiến hành: Cân chính xác 5g nguyên liệu cho vào chén cân dùng để xác định độ ẩm đã được cân bì trước. Cho chén chứa nguyên liệu vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1001050C trong 4 giờ. Cho chén vào bình hút ẩm đến khi nguội. Cân, làm lại nhiều lần đến khi khối lượng nguyên liệu không đổi. Độ ẩm (b %) của nguyên liệu được tính theo công thức sau: b= p −a p x 100 (%) Trong đó: b: Độ ẩm nguyên liệu (%) p: khối lượng nguyên liệu trước khi sấy (g) a: Khối lượng nguyên liệu sau khi sấy (g) 12 Hình 2. Sơ đồ định lƣợng lignan và triterpenoid toàn phần trong nguyên liệu Rau gai thối theo phƣơng pháp cân Ngâm methanol Bột nguyên liệu Chiết Soxhlet Bã Dịch chiết Cất thu hồi dung môi Cắn MeOH Nước Dịch nước Ether ethylic Lớp nước Lớp ether ethylic Butanol bão hoà nước Lớp nước Lớp ebutanol thu hồi butanol Cắn lignan và triterpenoid Butanol Sấy đến khối lượng không đổi (60-650C) Cắn khô lignan và triterpenoid 4.6. Các phƣơng pháp phân lập hợp chất Phân lập là tách riêng một chất dưới dạng tinh khiết ra khỏi hỗn hợp. Thành phần của một dược liệu thường rất phức tạp, nhiều trường hợp, chỉ một hoặc một vài thành phần trong đó được sử dụng làm thuốc. Do đó, người ta phải tiến hành chiết xuất phân lập các hợp chất tinh khiết để xác định cấu trúc, làm chất chuẩn, thử tác dụng dược lý… Có nhiều phương pháp được tiến hành sử dụng để phân lập các chất như kết tinh phân đoạn, thăng hoa, chưng cất phân đoạn, các phương pháp sắc ký [4]. 13 4.6.1. Kết tinh phân đoạn Phương pháp dựa vào độ hòa tan khác nhau của các chất khi hòa tan vào một hoặc hỗn hợp dung môi. Trong quá trình để dung môi bốc hơi, thành phần khó tan nhất sẽ tủa hoặc kết tinh trước. Lọc lấy phần tinh thể thô và kết tinh lại một vài lần như vậy sẽ thu được chất tinh khiết. Phần dung dịch còn lại có thể cho bay hơi dung môi và kết tinh để tách các chất khác. Có thể kết hợp việc bay hơi dung môi với giảm nhiệt độ để quá trình kết tinh hiệu quả hơn [4]. 4.6.2. Thăng hoa Một số chất hay nhóm hợp chất có khả năng thăng hoa như các coumarin và anthranoid ở dạng tự do (aglycon); cafein, ephedrin, camphor, borneol… có thể được tách ra khỏi hỗn hợp hay được tinh chế bằng cách cho thăng hoa. Quá trình thăng hoa có thể được thực hiện ở áp suất thường hay áp suất giảm. Khi thăng hoa dưới áp suất giảm, nhiệt độ thăng hoa của các chất giảm làm giảm tác động phân hủy của nhiệt độ lên các chất [4]. 4.6.3. Chƣng cất phân đoạn Chưng cất phân đoạn là một trong những phương pháp kinh điển dùng để tách các chất bay hơi ra khỏi một hỗn hợp dựa vào sự khác biệt nhiệt độ sôi của các chất trong hỗn hợp. Quá trình chưng cất có thể thực hiện ở áp suất khí quyển hay áp suất giảm. Phương pháp này thường áp dụng để tách các chất trong thành phần của tinh dầu [4]. 4.6.4. Các phƣơng pháp sắc ký Sắc ký điều chế là phương pháp được sử dụng rất nhiều và đóng vai trò quan trong trong việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên. Thành phần của các dịch chiết thực vật thường rất khác nhau từ các chất không phân cực tới các chất phân cực mạnh, từ các chất phân tử nhỏ tới đại phân tử. Hàm lượng các chất trong hỗn hợp cũng thay đổi. Khi đó, các các phương pháp phân lập cổ điển như kết tinh phân đoạn, chưng cất phân đoạn v.v… không thể đáp ứng được mà phải sử dụng các kỹ thuật sắc ký như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng điều chế, sắc ký lỏng cao áp điều chế [4]. 4.6.4.1. Phương pháp sắc ký cột Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể khai triển dung môi liên tục với nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh [2], [4]. 14