Tài liệu Nghiên cứu tách dòng và đọc trình tự gen cry1ab, cry1ac mh protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy từ các chủng bacillus thuringiensis phân lập từ một số mẫu đất thuộc tỉnh tn

  • Số trang: 74 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 456 |
  • Lượt tải: 0
dangvantuan

Tham gia: 02/08/2015

Mô tả:

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ========== TRƯƠNG PHÚC HƯNG NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GEN cry1Ab, cry1Ac MÃ HÓA PROTEIN DIỆT CÔN TRÙNG BỌ CÁNH VẢY TỪ CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ MẪU ĐẤT THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Thái Nguyên là một tỉnh miền núi trung du, nằm trong vùng trung du và miền núi Bắc Bộ, có diện tích tự nhiên là 3.562,82 km 2. Với địa hình thấp dần từ núi cao xuống núi thấp, trung du, đồng bằng theo hướng Bắc – Nam làm cho khí hậu Thái Nguyên chia thành ba vùng rõ rệt trong mùa đông: vùng lạnh, vùng lạnh vừa, vùng ấm và hai mùa rõ rệt mùa mưa và mùa khô. Do ảnh hưởng của địa hình, đất đai ở Thái Nguyên được chia thành ba loại chính, trong đó, đất núi chiếm diện tích lớn nhất (48,4%) hình thành do sự phong hoá trên các đá Macma, đá biến chất và trầm tích, độ cao trên 200m, tạo điều kiện cho phát triển lâm nghiệp, trồng rừng, cây đặc sản….đất đồi chiềm 31,4% chủ yếu hình thành trên cát kết, bột kết phiến sét và một phần phù sa cổ kiến tạo, độ cao từ 150 – 200m, phù hợp với cây ăn quả lâu năm, cây công nghiệp và đất ruộng chỉ chiếm 14,4%. Thái Nguyên còn có một diện tích lớn đất chưa sử dụng. Kết cấu của đất, điều kiện khí hậu và đặc điểm về địa hình đã tạo ra cho Thái Nguyên sự đa dạng về thực vật, động vật, cũng như các loài vi sinh vậtt rong đó có vi khuẩn Bacillus thuringiensis[23]. B. thuringiensis là vi khuẩn gram dương, mang các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có hiệu quả diệt đối với nhiều loài côn trùng thuộc các bộ cánh vảy, cánh cứng và hai cánh. Trong những năm gần đây các chủng Bt đã được các nhà khoa học phân lập với số lượng rất phong phú [3]. Tuy nhiên, mỗi chủng chỉ chứa một số nhóm gen cry gây độc với một số loài côn trùng nhất định. Vì vậy việc sàng lọc các chủng B. thuringiensis có chứa gen cry mong muốn, tạo dòng và xác định trình tự gen độc tố đó là vấn đề rất cần thiết, nó làm cơ sở cho các nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như: nhằm tạo ra các chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng quan trọng; việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại cây trồng để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côn trùng. Protein tinh thể độc cry1Ab, cry1Ac là một trong nhiều protein có hoạt tính cao chống lại côn trùng bộ cánh vảy. Xuất phát từ mục đích này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu Tách dòng và đọc trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy phân lập từ một số mẫu đất thuộc tỉnh Thái Nguyên”. 2. Mục tiêu của đề tài - Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vẩy. - Tách dòng và đọc trình tự được các chủng Bt nghiên cứu mang gen cry1Ab và gen cry1Ac. 3. Nhiệm vụ của đề tài - Thu thập các chủng Bt đã được phân lập chưa qua tuyển chọn từ đất Thái Nguyên; - Phân loại các chủng Bt var kurstaki bằng phương pháp huyết thanh; - Phát hiện gen cry1Ab và gen cry1Ac bằng phương pháp PCR; - Sàng lọc các chủng Bt var kurstaki có hoạt tính diệt sâu tơ; - Tách dòng gen cry1Ab và gen cry1Ac; - Xác định trình tự đoạn gen cry1Ab và đoạn gen cry1Ac đã được tách dòng từ các chủng Bt nghiên cứu và so sánh với trình tự gen ở Ngân hàng Gen quốc tế. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lƣợc sử nghiên cứu và ứng dụng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) trên thế giới Năm 1901, nhà khoa học Nhật Bản Sigetane Ishiwata đã phát hiện ra một loại vi khuẩn gây bệnh sotto ở trên tằm và ông đặt tên là Bacillus sotto. Năm 1911, nhà khoa học Đức E. Berline cũng đã phân lập được một loại vi khuẩn tương tự từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải, Anagasta kaenniella. Mãi đến năm 1915, vi khuẩn này mới chính thức được mang tên Bacillus thuringiensis do vi khuẩn này được phân lập từ vùng Thuringen của Đức. Đến năm 1930, Bt đã được thử nghiệm chống sâu đục thân ở Châu Âu. Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mỳ tại Pháp. Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất protein. Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử. Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất ra một số lượng lớn thuốc trừ sâu Thuricide từ chủng Bt. var. kurstaki. Đến năm 1962, de Barjac và Bonnfoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho các chủng Bt và Bacillus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh. Vào những năm 1960 – 1976, nhiều chủng Bt có hoạt tính diệt sâu cao đã được phân lập và ứng dụng. Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện ra Bt var. isralensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Năm 1981, Schnepf và Whiteley đã lần đầu tiên phân lập và tách dòng gen độc tố mã hoá protein tinh thể diệt sâu của chủng Bt. var kurstaki HD-1 gọi là gen cry1 và biểu hiện ở E. coli. Từ đó, một số lượng lớn các gen đã được tách dòng và đọc trình tự. Năm 1983, Krieg và cộng sự đã phân lập ra loài phụ Bt var. tenebrionit diệt bọ cánh cứng hại lá khoai tây vùng Colorado, Hoa Kỳ từ sâu tenebrio molitar. Sau đó, công ty Mycogen phát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 hiện ra một chủng tương tự Bt. var. tenebrionit tên là Bt. var. sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gen độc tố của chúng. Năm 1985, gen cry của Bt đã được chuyển vào cây trồng để diệt sâu. Năm 1987, phát hiện ra Bt diệt giun tròn thực vật. Năm 1991, phát hiện ra Bt diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda. Năm 1995, cây chuyển gen thương phẩm đầu tiên đã được đưa và sản xuất. Năm 2003, saikai và cộng sự đã công bố protein tinh thể của Bt diệt tế bào ung thư. Năm 2005, Ohba đã phát hiện ra protein của 4 dưới loài Bt phân lập ở Việt Nam có khả năng chống tế bào ung thư cổ tử cung của người [3]. 1.1.2. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis tại Việt Nam Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện Bảo vệ Thực vật năm 1971. Nguyễn Văn Cảm và cs, đã khảo nghiệm 5 loại thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô, Trung Quốc...đã cho kết quả rất khả quan. Tuy nhiên, những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu tiên được Nguyễn Công Bình và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại Viện Sinh vật, Viện Khoa học (nay là Viện Khoa học và Công nghệ). Có thể chia lịch sử 30 năm phát triển Bt của thành 3 thời kỳ như sau: 1.1.2.1. Thời kỳ mở đầu nghiên cứu Nguyễn Công Bình, Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính là những người đầu tiên mở đường nghiên cứu Bt tại Việt Nam. Năm 1973, Viện Sinh vật đã tiến hành sản xuất Bt bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm. Năm 1973-1976, Bt đã được sản xuất chủ yếu trên môi trường đặc với giá thể là agar tự chế tạo từ rong câu và các nguyên liệu khác như: bã khô lạc, bột đậu tương, bột cá,...các chủng Bt được sử dụng để sản xuất ở thời kỳ này do Nguyễn Công Bình mang từ Trung Quốc về có loài phụ Bacillus thuringiensis var thuringiensis, B. thuringiensis var kurstaki. Các chế phẩm này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 quả tốt đẹp. Năm 1975, chế phẩm Bt đã được sản xuất theo phương pháp lên men chìm trong nồi lên men tự tạo tại Phòng Sinh học thực nghiệm thuộc phân viện Viện Khoa học đóng tại thành phố Hồ Chí Minh. Năm 1982, Viện Công nghệ thực phẩm cũng sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men chìm với dung tích nồi lên men là 5m3. Từ năm 1984-1993, việc sản xuất chế phẩm Bt đã bị giảm sút vì các chế phẩm Bt sản xuất ra có chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm. Nhìn chung, trong thời kỳ này đã bắt đầu sản xuất và áp dụng thành công chế phẩm Bt đã khiến cho các nghiên cứu Bt mở đầu khá thuận lợi và tốt đẹp. 1.1.2.2. Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994) Các chế phẩm Bt sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa giá bán không cao (khoảng 6000 đồng/lít) nên phù hợp với thu nhập của nông dân. Việc sản xuất chế phẩm Bt theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng đã được một số đơn vị thuộc các trường đại học đề xuất nhưng đã không thu đươc kết quả tốt. 1.1.2.3. Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (1994-nay) Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng 1984-1993, chế phẩm Bt kém chất lượng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng Bt bước vào thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu lại phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy, khoảng 10 năm trở lại đây, các nhà khoa học đã chuyển việc nghiêm cứu Bt sang hướng mới là tìm ra các chủng Bt có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu Bt và ứng dụng công nghệ chuyển gen Bt phục vụ sản xuất. Các chủng Bt phân lâp tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài và đa dạng về gen. Năm 1998, có 34 chủng chuẩn mang kháng nguyên tiêm mao H và đã chế tạo được 34 bộ sinh phẩm (kit) phục vụ cho phân loại Bt bằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 6 phương pháp huyết thanh. Bằng phương pháp PCR với hỗn hợp các cặp mồi đặc hiệu cho 7 gen thuộc nhóm gen cry typ 1 cho thấy có 102 chủng Bt trong tổng số 115 chủng có chứa 311 gen cry1 (chiếm 88.7%), đáng chú ý là các chủng chứa 5 gen cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1C và cry1D - chiếm 6,8% [1]. Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gen có trong các chủng Bt phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli từ các chủng Bt aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh, các protein tái tổ hợp thu được đã cho hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đôi chứng. Năm 2000, Võ Thị Thứ và cs đã tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein cry4A diệt ấu trùng muỗi. Năm 2003, Lê Thị Thu Hiền đã thiết kế thành công vectơ chuyển gen cry1A vào cây bông [1]. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gen kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gen cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium fumefaciens để tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông...[4.5,6,9,10]. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gen cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen, đến năm 2005, gen kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [11]. 1.2. Đại cƣơng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.2.1 Đặc điểm hình thái Theo các tài liệu về phân loại vi khuẩn gây bệnh côn trùng của Sneath (1986) Wistreich và Lechtman (1988), Syahly (1991) thì vi khuẩn Bt được xếp vào nhóm I, chi Bacillus, họ Bacillaceae, nghành Firmicutes [3]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 7 Bt thuộc chi Bacillus là vi khuẩn đất, hình que, gram dương, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, kích thước tế bào từ 3 – 6 µl, có phủ tiêm mao không dày, chuyển động được. Các loài thuộc chi Bacillus có khả năng hình thành bào tử khi gặp những điều kiện bất lợi của môi trường, bào tử có dạng hình trứng với kích thước từ 1,5 - 2 µl và có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi. Bào tử là dạng sống tiềm ẩn của vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt, bức xạ, hoá chất, áp suất thẩm thấu cao. Màng ngoài nằm ở ngoài cùng đó là phần sót lại của tế bào mẹ, chiếm khoảng 2 – 10% khối lượng khô của bào tử. Thành phần chủ yếu là lipoprotein, cũng có một lượng nhỏ axit amin, có tính thẩm thấu kém. Lớp áo bào tử có cấu tạo bởi 3 – 15 lớp, chủ yếu là protein sừng. Áo bào tử có sức đề kháng cao với lizozim, proteinaza, các chất hoạt động bề mặt, có tính thẩm thấu kém đối với các cation. Dưới áo bào tử là vỏ bào tử. Vỏ bào tử chứa một lượng lớn peptidoglucan đặc biệt, ít liên kết chéo, ngoài ra còn có 7 – 10% (tính theo khối lượng khô của bào tử) chất dipicolinat canxi (DPA- Ca) không chứa axit teicoic. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ bào tử cao tới 20atm, lượng chứa nước là 70%. Dưới lớp vỏ bào tử là lõi bào tử còn gọi là thể chất nguyên sinh cấu tạo bởi 4 thành phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân. Đặc biệt trong quá trình hình thành bào tử vi khuẩn Bt có thể sinh ra những tinh thể mang tính độc đối với côn trùng. Tinh thể là một loại protein có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 μm có thể chiếm 25% trọng lượng khô của tế bào và có hình dạng rất đa dạng: hình tháp, hình ovan, hình lập phương hoặc có hình dạng không xác định … Khi ở trong tế bào sinh dưỡng thì bào tử và tinh thể thường nằm kề nhau, khi tế bào tan thì bào tử và tinh thể cùng thoát ra ngoài [3,14]. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi ta thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt (hình 1.1) [3,6,7]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 8 A B Hình 1.1: Hình thái bào tử và tinh thể của một số chủng Bacillus thuringiensis (A: Kính hiển Vi quang học; B: Kính hiển vi điện tử quét) Bt có đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hoá rất giống với các nhóm trực khuẩn sinh bào tử B. cereus, B. mycoides và B. anthracis tuy nhiên Bt có khả năng sinh tinh thể còn loài khác thì không [4]. 1.2.2 Đặc điểm sinh hoá Bt không lên men sinh axit với arabinoza, xiloza và manitol nhưng tạo axít trong môi trường có glucoza, có khả năng thuỷ phân tinh bột, khử nitrat thành nitrit, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà, phát triển được trong môi trường thạch kị khí có chứa 1% lizozim. Bt có khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ 15 – 450C, nhiệt độ tối ưu là 28 – 300C, pH = 7. Bt không có khả năng khử amin của phenilalanin, không sử dụng axít axetic, không khử muối sunfit. 1.2.3. Tính chất nuôi cấy Tính chất nuôi cấy là đặc tính vốn có của vi sinh vật, là một trong những tiêu chuẩn để định loại vi sinh vật. Tính chất nuôi cấy của các dưới loài Bt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 9 khác nhau là khác nhau, đồng thời phụ thuộc vào thành phần môi trường, thời gian và nhiệt độ nuôi cấy. Khuẩn lạc của dưới loài Bt var . kurstaki nuôi cấy trên môi trường MPA ở 300C trong 72 giờ đa số có hình tròn, màu trắng sữa có mép nhăn đường kính có thể đạt tới 8 – 10mm. Trong khi đó khuẩn lạc loài phụ berlinner có dạng thảm, với các sợi hình phóng xạ, đường kính khoảng 10mm; màu vàng nhạt và trơn ướt, viền nhăn thành hình vải thô mở rộng ra xung quanh nên được gọi là dạng phóng xạ nhăn. Nếu nuôi cấy có bổ sung 2% gluco, nuôi ở 300C trong 24 giờ có thể thấy các điểm khuẩn lạc nhỏ màu vàng trên bề mặt, sau 42 giờ thành hình vành khăn tròn dày, đường kính 3mm, giữa có một vành tròn tương đối sâu, bề mặt trắng tối, hơi ánh quang, dạng hạt thô khô, sau 72 giờ đường kính có thể đạt 2cm. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc trơn nhẵn [3,4]. 1.2.4. Phƣơng pháp phân loại Bacillus thuringiensis Có nhiều phương pháp phân loại Bt khác nhau. Khóa phân loại đầu tiên được thiết lập dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus, 1958). Tuy nhiên phân loại theo phương pháp này không phân biệt được các chủng Bt một cách rõ ràng bởi vì Bt có các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá rât giống các đại diện trong nhóm trực khuẩn sinh bào tử Bacillus cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. anthacis. Mới đây phát hiện thêm 2 loài là B. weihenstephanensis và B. pseudomycoides [3,4,14]. Ngoài ra, người ta con phân loại vi khuẩn Bt theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể, typ huyết thanh kháng nguyên – O, theo loại hình enzym lipaza, dựa trên plasmit và phân loại theo nguồn bệnh. Nhưng trong cùng một chủng có sự tồn tại của các typ gen ngoại độc tố khác nhau (Sanchis và cộng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 sự, 1988) đã ngăn chặn việc sử dụng các đặc điểm này là cơ sở cho khoá phân loại các chủng B t [3,14]. Cho đến nay, khoá phân loại vi khuẩn Bt theo phương pháp huyết thanh được de Barjac và Bonnefoi đề nghị vào năm 1962, sau đó được Lauren và Thyery cải tiến năm 1996, được sử dụng phổ biến và là phương pháp đáng tin cậy được trung tâm quốc tế Bt đặt tại viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm nghiên cứu Bt trên thế giới từ năm 1982 [2,3]. Nguyên lí: Khi kháng nguyên lông roi kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết. Kết quả của phản ứng là tạo cặn lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được. Đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác của Bt [3,14]. Tế bào vi khuẩn với kháng nguyên bề mặt Phân tử kháng thể với 2 vị trí liên kết đặc hiệu. Phản ứng ngưng kết. Hình 1.2. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 1.2.5. Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var. kurstaki Bacillus thuringiensis var. kurstaki được phát hiện lần đầu tiên năm 1901, tuy vậy tiềm năng thương mại của nó đã bị lãng quên cho đến mãi năm 1951. Tuy nhiên, trong các thập kỷ gần đây, B. thuringiensis var. kurstaki đã trở thành phương tiện chủ yếu để kiểm soát sâu hại cây vân sam tại Canada. Đến năm 1986, việc sử dụng Bt. var. kurstaki tăng một cách đáng kể, khoảng 74% rừng được phun đối với sâu hại cây vân sam. Ở các nước khác, Bt. var. kurstaki được sử dụng để trừ sâu bướm, bướm đêm, sâu thuốc lá và đặc biệt là sâu tơ hại bắp cải, sinh sản nhanh, thời gian sống ngắn nhưng mức độ phá hoại cao. Bacillus thuringiensis var. kurstaki là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B. thuringiensis và chiếm tỉ lệ cao nhất. Theo các tài liệu công bố, thì trong số 83,5% số chủng kiểm tra ngưng kết với các typ huyết thanh đã có thì Bacillis thuringiensis var. kurstaki ngưng kết với typ H3a,3b,3c chiếm 27,6%, sau là B. thuringiensis var. azawai ngưng kết với typ H7 chiếm 15%, B. thuringiensis var. morrisoni ngưng kết với typ H8a,8b chiếm 13,8%,…Bacillus thuringiensis var. kurstaki sinh tinh thể hình lưỡng tháp, hình lập phương và hình cầu trong đó hình lưỡng tháp là chủ yếu cà có hoạt tính với côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera), và một số côn trùng bộ hai cánh (Diptera). Các tinh thể có trọng lương phân tử 130 – 140kDa được mã hóa bởi 130 gen cry1 khác nhau từ cry1A – cry1F. Dưới đây là bảng phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus thuringiensis var. kurstaki và côn trùng [3]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 Bảng 1. Phân loại độc tố Cry1 ở Bacillus thuringiensis var. kurstaki và côn trùng đích Độc tố Cry1Aa Trọng lƣợng Côn trùng đích phân tử (kDa) 132,2 Mandacasexta, Bomby mori, Pieris brassiace, Plutella xylostella, Ostri nianubilalis Cry1Ab 131 Heliothis vires cens, Mandacasexta, Pieris brassiace Cry1Ac 133,3 Tricho plusiani, Ostrinia nianubilalis, Heliothis virescens, Manduca sexta, Pieris brassiace Cry1B 138 Pieris brassiace Cry1C 134,8 Spodoptera littoralis, Pieris brassiace, Spodoptera exigua, Mamestra brassicae Cry1D 132,5 Manduca sexta, Spodoptera exgua Cry1E 130 Manduca sexta, Spodoptera exgua, Spodoptera littoralis Cry1F 133,6 Ostrinia nianubilalis, Heliothis virescens, Spodoptera exgua 1.2.6. Hệ thống di truyền của vi khuẩn 1.2.6.1. Hệ gen của vi khuẩn Bt Kích thước hệ gen của vi khuẩn Bt vào khoảng 2,4 – 5,7 triệu bp .Thể nhân (Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng nhất định, và vì vậy được gọi là vùng nhân. Khi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 13 nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím. Đó là một nhiễm sắc thể duy nhất dạng vòng chứa một sợi ADN xoắn kép. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn Bt. Hầu hết các chủng Bt phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài NST, các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng. 1.2.6.2. Phân loại gen độc tố diệt côn trùng của Bacillus thuringiensis Năm 1982, Held và cộng sự đã lần đầu tiên sử dụng chữ viết tắt cry từ chữ Crytal có nghĩa là tinh thể để biểu diễn gen tổng hợp protein tinh thể diệt sâu. Các chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố đó là: Độc tố Cry (dạng chủ yếu – tinh thể độc) được mã hóa bởi các gen cry khác nhau và độc tố Cyt (độc tố phân huỷ tế bào) do gen cyt mã hoá, độc tố này làm tăng khả năng diệt côn trùng của độc tố Cry và độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp. Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể. Các chủng Bt khác nhau có hoạt tính diệt côn trùng khác nhau. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng hoạt tính và phổ tác dụng diệt côn trùng được quyết định bởi cấu trúc protein tinh thể [3]. 1.2.6.3. Vị trí của các gen mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng trong tế bào Từ những năm đầu thập kỷ 80, nhiều nhà nhiên cứu tập trung vào sự tồn tại của các gen ICPs (insecticidal crytal protein) ở các loài phụ Bt khác nhau. Một số nghiên cứu về mối tương quan về sự có mặt của plasmid và khả năng hình thành tinh thể diệt côn trùng. Các phương pháp xử lý plasmid, tiếp hợp và các thí nghiệm tách dòng đã chứng minh rằng các gen mã hoá protein diệt côn trùng thường nằm trên các plasmid có hệ số copy thấp. Tuy nhiên, có những công bố về sự tồn tại của gen mã hoá protein tinh thể diệt sâu trong nhiễm sắc thể của một số dưới loài như: kustaki HD1 entomocidus, aizawai 7.92, dendrolimus và wuhanensis. Carlton và Gonzalez đã tiến hành cuộc điều Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 tra về sự có mặt của plasmid trong hầu hết các chủng Bt. Những nghiên cứu của họ trên 21 loài phụ Bt cho thấy số plasmid dao động từ 2 đến 12 trong các chủng nghiên cứu. Các thí nghiệm lai gen đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại của các gen tổng hợp nhiều loại độc tố trong một tế bào Bt. Ví dụ các plasmid trong Bt var aizawai và kurstaki HD1 có 5 gen mã hóa protein diệt côn trùng nằm nhiều vị trí khác nhau trong tế bào [4,21]. Sau những nghiên cứu về xác định vị trí của các gen độc tố trong tế bào vi khuẩn, rất nhiều nhóm nghiên cứu đã tách dòng gen ICP của một số dưới loài Bt. Năm 1981, Schnepf và Whitelay công bố đã tách dòng và biểu hiện gen cry từ Bt. var kustaki HD1 trong chế phẩm Dipel. Họ đã biểu hiện được gen trong E.coli và chỉ ra rằng chủng này có hoạt lực đối với ấu trùng Manduca sexta. Tiếp theo công bố này, hàng loạt công bố về gen mã hoá cho tiền độc tố (protoxin), đã được tách và đọc trình tự. Các gen này tổng hợp protein diệt côn trùng bộ cánh vảy, hai cánh và cánh cứng. Hiện nay có tới hơn 300 gen đã được tách dòng và đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen (Gene Database) [7]. 1.2.6.4. Đặc điểm riêng của một số nhóm gen và độc tố của chúng Nhóm gen cry1: gồm trên 130 gen thuộc các nhóm gen cry1A-cry1L mã hoá cho các protein có khối lượng 130kDa, tích luỹ thể vùi dạng hình tháp và thường chỉ có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, điển hình là ấu trùng bướm ngài, côn trùng keo, côn trùng tơ... Nhóm gen này được phân thành các nhóm phụ sau: cry1A, cry1B, cry1C, cry1D, cry1E …. Trong đó gen cry1A được chia làm 3 gen cry khác nhau : cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac với hơn 80% các axit amin tương đồng. Nhóm gen cry2: Mã hóa tổng hợp protein có trọng lượng phân tử khoảng 71 kDa, tạo thể vùi hình lập phương trong đó bao gồm cry2A, cry2B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 15 và cry2C, cả ba gen này đều mã hoá tổng hợp protein có trên dưới 633 axit amin. Có độc tính đối với côn trùng bộ cánh vảy (Heliothis virecens và Lymantri adipans), bộ 2 cánh (Aedes aegypti). Riêng gen cry2B và cry2C tổng hợp protein chỉ gây độc cho bộ côn trùng cánh vẩy. Nhóm gen cry3: Gồm 16 gen thuộc các nhóm cry3A-cry3C mã hoá cho các protein có khối lượng khoảng 73kDa tạo tinh thể hình lưỡng tháp, hình lập phươn, có hoạt tính chống lại các loài thuộc bộ cánh cứng. Nhóm gen cry4: Gồm 8 gen thuộc nhóm cry4A - cry4B mã hoá cho cả 2 loại protein tinh thể có khối lượng 70kDa và 130kDa tạo tinh thể hình cầu và hình lập phương, có hoạt tính đối với các loài thuộc bộ 2 cánh. Độc tính của protein nhóm 4 tăng mạnh khi chúng tạo phức với protein 27kDa do gen cyt mã hoá. Nhóm gen cry5: Mã hoá cho protein có khối lượng 81kDa, gây độc với côn trùng thuộc bộ cánh vảy và cánh cứng [20]. Nhóm gen mã hoá cho độc tố Cyt: Nhóm gen cyt bao gồm 2 lớp cyt1 và cyt2 mã hoá tổng hợp protein 27kDa, là thành phần chính của tinh thể, protein này có tác dụng tiêu hủy tế bào động vật không xương sống. Nhóm gen cyt thông thường tồn tại ở các chủng Bt chứa nhóm gen cry4. Nhóm gen cyt mã hoá protein có trọng lượng khoảng 27KDa và có trong thể vùi (chiếm khoảng 40 – 50% tinh thể). Tinh thể độc này thường có tác dụng yếu với côn trùng thuộc bộ 2 cánh và giun tròn thuộc bộ thân mềm. Nhóm gen mã hoá cho độc tố Vip: Gần đây người ta đã phát hiện ra một số loại protein tiết ra môi trường nuôi cấy Bt trong pha sinh trưởng, có một độc lực lớn đối với côn trùng. Protein này được gọi là Vip (vegetative insecticidal protein) do gen vip mã hoá tổng hợp. Gen này không xếp vào họ gen cry vì không sinh tinh thể. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 16 1.2.6.5. Đặc điểm về gen cry1Ab, cry1Ac Gen cry1Ab kích thước gen 3468 bp mã hóa tổng hợp protein tinh thể độc tố Cry1Ab với trọng lượng phân tử 131kDa, có hoạt tính độc với côn trùng cánh vẩy, và có trong các dưới loài Bacillus thuringiensis var. kurstaki, var. berliner, var. aizawai [40]. A B Hình 1.3. A: Cấu trúc không gian của độc tố cry1Ab B: Cấu trúc không gian của độc tố cry1Ac Gen cry1Ac có kích thước 3537 bp mã hóa tinh thể độc tố có trọng lượng phân tử 133,3 kDa diệt côn trùng cánh vẩy. Nhóm dưới loài B. thuringiensis var. kurstaki, var. enyae có sinh tinh thể hình thoi chứa gen cry1Ac [17]. Khi phân tích vùng 2 của độc tố Cry1Ac và Cry1Ab, người ta nhận thấy chúng có cấu trúc bậc 1 gần giống nhau. Ngoài ra, trong nghiên cứu khả năng tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn trùng thì vùng 2 của độc tố Cry1Ac có khả năng liên kết cả 3 loại thụ thể có khối lượng phân tử khác nhau [17]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 17 1.3. Các loại độc tố của Bt Bt có 4 loại độc tố: ba ngoại độc tố và một nội độc tố. * Ngoại độc tố α Ngoại độc tố α có bản chất là một enzym gọi là photpholipase hoặc leucithinase có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá. Độc tố này có khối lượng phân tử thấp, không bền với nhiệt. Tác dụng độc của ngoại độc tố có liên quan tới sự phân hủy photpholipit ở mô của côn trùng. Nghiên cứu này được phát hiện bởi Toumanoff năm 1953. * Ngoại độc tố β Ngoại độc tố β có trọng lượng phân tử thấp 707 – 850 kDa, là độc tố bền nhiệt, tan trong nước. Ngoại độc tố β có tác dụng kìm hãm nucleaza và ARN – polymeaza dẫn tới cản trở việc tổng hợp ARNt. Ngoại độc tố β có phổ hoạt tính rộng, có hoạt tính với côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh. Qua nghiên cứu Brian Federici và Dongwu cũng nhận thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử dụng ngoại độc tố β thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ sung độc tố γ thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%. * Ngoại độc tố γ Ngoại độc tố có γ trọng lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không khí, có khả năng tan trong nước. Độc tố này thuộc nhóm photpholipase, có tác dụng lên photpholipit và giải phóng ra axit béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở nhiệt độ từ 600C trở nên trong vòng từ 10 – 15 phút đã bị vô hoạt. * Nội độc tố δ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 18 Nội độc tố δ có tác dụng diệt côn trùng mạnh nhất. Nó có bản chất là một protein gồm 1180 axit amin, các axit amin chủ yếu là glutamic, asparaginic, chiếm trên 20% tổng số axit amin trong phân tử protein, đây cũng là một nguyên nhân gây ra điểm đẳng điện thấp. Lượng xistin nhỏ hơn 20% tổng số axit amin quy định sự không hòa tan của tinh thể, ngoài ra còn có các axit amin: acginic, treonin, lơxin, izolơxin. Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: hydratcacbon, tuy nhiên cũng có thể hydratcacbon chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong quá trình hình thành bào tử. Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S. Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn. Tuy nhiên, nguyên tố P hầu như không có. Nội độc tố δ có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt. Khi đun nóng ở 650C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 100 0C trong 30 – 40 phút thì tinh thể bị mất tính độc. 1.4. Đặc điểm của protein tinh thể độc 1.4.1. Cấu trúc của protein tinh thể Cry Cấu trúc của protein tinh thể đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật nghiên cứu tinh thể bằng tia X với những nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc Cry3A và Cry1Aa, sau đó được mở rộng cho các độc tố khác. Các protein tinh thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng riêng biệt: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 19 Hình 1.4. Mô hình cấu trúc chung của một protein độc tố Cry Vùng 1 gồm 1 bó 7 chuỗi , trong đó chuỗi -5 nằm ở trung tâm được bao quanh bởi 6 chuỗi còn lại. 6 chuỗi  này có tính lưỡng cực và đủ dài để bắc cầu xuyên qua lớp kị nước dầy 30 Å của màng kép và tạo nên kênh trên màng. Để tạo được lỗ rò xuyên qua màng tế bào, những chuỗi  bên ngoài phải biến đổi đảo ngược để mặt kị nước của nó tiếp xúc lớp màng photpholipid trong khi mặt ưa nước kết hợp với vùng 2 tạo ra một lỗ rò không còn tính đặc hiệu. Một số nghiên cứu gần đây phát hiện ra những đoạn oligomer rất quan trọng trong hoạt động của -endotoxin. Khi bị mất Glu-129, Arg-131, Asp-136 của chuỗi -4 thì Cry1Aa không còn độc tính với côn trùng, trong khi mất Arg-127 và Asn-138 thì độc tính không hề bị ảnh hưởng. Vùng 2 gồm 3 tấm  đối song song quấn quanh một lõi kị nước. Nhiều nghiên cứu cho rằng vùng 2 đóng vai trò quan trong trọng việc gắn kết với thụ thể. Có một sự tương đồng lớn giữa cấu trúc 3 tấm  này với 3 loại thụ thể glycoprotein ở nhiều loài côn trùng (Amino peptidase N, Cadherin - like Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Xem thêm -