Tài liệu Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển việt nam

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN ***** NGUYỄN LƢƠNG THOẠI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Mã ngành: 60. 42. 30 HÀ NỘI – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN VIỆT NAM ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÁI NGUYÊN ***** NGUYỄN LƢƠNG THOẠI NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT TỔ HỢP ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Mã ngành: 60. 42. 30 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Hoài Châu HÀ NỘI – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hoài Châu – Viện trƣởng Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hƣớng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ thân Môi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng đặc biệt là PGS.TSKH. Ngô Quốc Bƣu đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt – Trung tâm ứng dụng Khoa học & Công nghệ Nha Trang đã hƣớng dẫn tận tình và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi. Tôi cũng xin bày tỏ sự cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào tạo sau Đại học - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Nguyễn Lương Thoại Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác tại Việt Nam. Tác giả luận văn Nguyễn Lương Thoại Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate Tris.Base Tris (hydroxy methyl) amiomethane (HOCH3)CNH2 TEMED Trichloroacetic acid kb kilo base kDa kilo Dalton PCR Polymerase Chain Reaction U Unit ADN Acid Deoxyribonucleic EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid TCA Trichloroacetic acid OD Optical density SDS-PAGE Sodium dodecylSulphate polyacrylamide gel Electrophorei SDS Sodium dodecyl sulphate DEP Diethoxylphosphoryl DFP Di-isopropylfluorophosphate 3,4-DCI 3,4-Dichloroisocoumarin PMSF Phenylmethysulfonyl fluoride TLCK Tosyl-L-lysine Chloromethyl Ketone PCMB P-Chloromercuribenzoate v/p vòng/phút v/v Volume/volume Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả thử hoạt tính protease từ mẫu Nhà máy chế biến hải sản Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính dịch chiết chạy qua màng lọc 50kDa Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính với casein sau khi ủ với casein Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính protease với mẫu mua ghẹ Bảng 3.5. Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của enzyme Bảng 3.6. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 30%; 40% Bảng 3.7. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 50% Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 60%;70% và 80% Bảng 3.9. Kết quả thử hoạt tính protease ở tỉ lệ cồn 90% Bảng 3.10. Hoạt tính và hiệu suất thu hồi ở các tỉ tệ cồn khác nhau Bảng 3.11. Kết quả thử hoạt tính ở các tốc độ li tâm khác nhau. Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt qua lọc màng (10kDa;50kDa). Bảng 3.13. Kết quả thử hoạt qua lọc màng (50kDa;100kDa). Bảng 3.14. Kết quả thử hoạt tính theo các phân đoạn (NH4)2SO4 Bảng 3.15. So sánh giữa các phương pháp kết tủa thu hồi enzyme Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme Bảng 3.17. Ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme Bảng 3.18. Hàm lượng protease thu được so sánh với mẫu của Nga Bảng 3.19. Kết quả mẫu đem chạy điện di Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide Hình 1.2. Mô hình enzyme protease thủy phân Hình 1.3. Cấu trúc không gian enzyme protease Hình 1.4. Sơ đồ phân loại protease Hình 1.5. Sơ đồ cơ chế xúc tác trung tâm hoạt động của enzyme Hình 1.6. Cơ chế xúc tác của cysteine protease. Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của Aspartic protease Hình 1.8. Mô hình phân tử enzyme protease Hình 1.9. Nội tạng cua biển Hình 1.10. Sự phân bố của cua vua đỏ (vùng màu vàng) Hình 1.11. Loài cua vua (king crab)Paralithodes camtschaticus Hình 2. Đường chuẩn Tyrosine Hình 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ cồn tới enzyme protease. Hình 3.2. Ảnh hưởng của tốc độ máy lọc màng tới enzyme protease Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 lên hoạt tính của protease Hình 3.4. Ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính của enzyme protease Hình 3.5. So sánh giữa các phương pháp kết tủa thu hồi enzyme Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt tính của enzyme Hình 3.7. Điện di đồ sau khi tủa bằng (NH4)2SO4 và cồn 70% Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PROTEASE .............................. 3 1.1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới. .................................... 3 1.1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc……………………..4 1.2. ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN - PROTEASE…………………….5 1.3. PHÂN LOẠI .............................................................................................. 7 1.3.1. Exopeptidase…………………………………………………………8 1.3.2. Endopeptidase ........................................................................................ 9 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI HOẠT TÍNH PROTEASE ............. 10 1.5. CƠ CHẾ XÚC TÁC PHẢN ỨNG ........................................................... 11 1.5.1. Serine protease……………………………………………………………..12 1.5.2. Metallo protease……………………………………………………………12 1.5.3. Cysteine protease…………………………………………………..………13 1.5.4. Aspartic protease…………………………………………………..……...14 1.6. CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE .................................................................. 15 1.7. NGUỒN THU NHẬN ENZYME PROTEASE ...................................... 18 1.7.1. Enzyme protease từ động vật ................................................................ 18 1.7.2. Enzyme protease từ thực vật ................................................................. 18 1.7.3. Enzyme protease từ vi sinh vật... .......................................................... 19 1.7.3.1. Vi khuẩn.......................................................................................19 1.7.3.2. Nấm …………………………………………………………………………20 1.7.3.3. Xạ khuẩn……………………………………………………………………21 1.7.3.4. Virus…………………………………………………………………………21 1.8. TỔ HỢP ENZYME HEPATOPANCREAS (HP) TỪ GAN TỤY CỦA CUA BIỂN ...................................................................................................... 22 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8.1. Sản phẩm thu đƣợc từ gan tụy cua biển………..…….……………….22 1.8.2. Ứng dụng trong y học……………………………….………………..24 1.8.3. Giới thiệu về loài cua nghiên cứu tại Nga…………………………...25 1.9. ỨNG DỤNG CỦA PROTEASE .............................................................. 26 1.9.1. Trong công nghiệp chế biến thực phẩm………………………………27 1.9.2. Trong chế biến thuỷ sản ........................................................................ 27 1.9.3. Trong công nghiệp chế biến sữa ........................................................... 28 1.9.4.Trong công nghiệp sản xuất bia ............................................................. 28 1.9.5. Trong công nghiệp da ............................................................................ 28 1.9.6. Trong công nghiệp dệt........................................................................... 29 1.9.7. Trong công nghiệp y – dƣợc ................................................................. 29 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 31 2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................ 31 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 31 2.1.2. Hoá chất................................................................................................. 31 2.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 32 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................ 32 2.2.1. Xác định hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas theo phƣơng pháp Anson cải tiến, 1972 ........................................................................................ 33 2.2.2. Xác định hàm lƣợng tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phƣơng pháp Lowry cải tiến.................................................................................................. 35 2.2.3. Phƣơng pháp định tính hoạt tính của tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cơ chất casein ......................................................................................... 36 2.2.4. Phƣơng pháp tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas ...................... 37 2.2.5. Phƣơng pháp tinh sạch .......................................................................... 37 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng dung dịch (NH4)2SO4…………………………………………………………………………..38 2.2.5.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc màng…………………………………………………………………………….…..39 2.2.5.3. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác nhau…………………………………………………………………………………40 2.2.6. Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………………………………….40 2.2.7. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas……………………………………………………41 2.2.8. Khảo sát ảnh hƣởng của pH tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………………………………………….41 2.2.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ tới hoạt tính tổ hợp enzyme hepatopancreas ……………………………………………………………42 2.2.10. Điện di protein trên gel polyacrylamide xác định khối lƣợng tổ hợp enzyme…………………………………………………………………….. 42 2.2.11. Phƣơng pháp sấy đông khô dịch chiết enzyme …………………..44 3.1. Khảo sát mẫu nội tạng cua biển thu nhận từ 2 nguồn thu nhận khác nhau ......................................................................................................................... 45 3.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas…………………………….48 3.2.1. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cồn theo các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................. 48 3.2.2. Tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng phương pháp lọc màng ......................................................................................................................... 52 3.2.3. Tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas từ gan tụy cua biển dùng (NH4)2SO4 ........................................................................................................ 54 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.4. Thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas bằng cách điều chỉnh pH dịch ly tâm ............................................................................................................. 545 3.3. So sánh giữa các phƣơng pháp tủa pH, cồn và ammonium sulfate ......... 57 3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của dung dịch đệm đến hoạt tính của tổ hợp enzyme hepatopancreas ................................................................................................ 58 3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến khả năng tinh sạch tổ hợp enzyme hepatopancreas ................................................................................... 59 3.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH tới hoạt tính của enzyme.......... 60 3.7. Hàm lƣợng protein ................................................................................... 62 3.8. Chạy điện di xác định khối lƣợng phân tử tổ hợp enzyme ...................... 62 3.9. Quy trình nghiên cứu ............................................................................... 64 KẾT LUẬN .................................................................................................... 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 68 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 73 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Hàng năm, lƣợng enzyme đƣợc sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, trong đó khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân đƣợc sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease đƣợc coi là một trong ba nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất (60%) và là nhóm enzyme thủy phân protein đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: sản xuất chất tẩy rửa, chế biến thực phẩm, thuộc da, mỹ phẩm, y học và nông nghiệp [35]. Protease có thể đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau từ động vật, thực vật đến các vi sinh vật. Hiện nay từ gan tụy cua ngƣời ta có thể thu nhận chế phẩm enzyme có độ sạch cao chứa chất xúc tác hydrolase, cụ thể là tổ hợp enzyme hepatopancreas (HP) phân giải protein có khả năng ứng dụng trong điều trị vết thƣơng tốt nhất [20]. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano chế tạo vật liệu phủ vết thƣơng trên cơ sở xenlulo đƣợc cấy enzyme phân huỷ protein là một hƣớng nghiên cứu tƣơng đối mới trên thế giới, là thành quả nghiên cứu khoa học hàng chục năm qua của đội ngũ các nhà khoa học Nga. Vấn đề này tại nƣớc ta hiện chƣa có cơ sở nghiên cứu khoa học nào triển khai nghiên cứu. Tại Việt Nam có nhiều cơ sở chế biến sản phẩm hải sản xuất khẩu từ cua biển, trong đó phần nội tạng của cua đƣợc loại bỏ dƣới dạng chất thải. Từ lâu ngƣời ta biết rằng gan tụy cua biển chứa một lƣợng đáng kể các loại enzyme tiêu hóa có khả năng phân hủy protein với phổ rộng và hoạt tính cao trong điều trị tổn thƣơng đối với các vết thƣơng mủ - hoại tử hoặc các vết loét khó lành. Tổ hợp enzyme hepatopancreas tách từ cua biển trong thành phần của mình, ngoài colagenase còn chứa các protease serin, nhờ vậy mà chúng có khả năng thủy phân nhiều đối tƣợng cơ chất khác nhau và thể hiện tính năng 1 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn điều trị đặc thù. Vì vậy, nhóm nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đề xuất đề tài: “Nghiên cứu tách chiết tổ hợp enzyme phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam” nhằm bƣớc đầu thu nhận tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải protein từ gan tụy cua biển ở Việt Nam, tiến tới chế tạo băng gạc điều trị vết thƣơng mang lại sản phẩm có giá trị công nghệ cao ứng dụng trong y học và cuộc sống. Trong khuôn khổ của đề tài luận văn này, chúng tôi tiến hành: - Khảo sát quá trình tách chiết tổ hợp enzyme hepatopancreas phân giải protein từ gan tụy cua biển Việt Nam. - Nghiên cứu các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết và đánh giá hoạt tính tổ hợp enzyme thu đƣợc. 2 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PROTEASE 1.1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới. Trên thế giới, protease động vật đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả. Ngay từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp Recmur đã phát hiện ra một loại protease ở hệ tiêu hóa của loài chim ăn thịt. Năm 1857, Corvisart tách đƣợc tripsin từ dịch tụy, đó là protease đầu tiên nhận đƣợc ở dạng chế phẩm. Năm 1861, Brucke cũng đã tách đƣợc pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tƣơng đối tinh khiết. Năm 1869-1872, Schmidt đã có những phát hiện đầu tiên về enzyme tham gia quá trình đông máu là fibrin mà ngày nay gọi là thrombin. Ông cũng đã tách chiết enzyme này và kết tủa bằng ethanol, chế phẩm nhận đƣợc có tác dụng làm cho fibrinogen đông lại nhanh hơn [40]. Các protease thực vật đƣợc phát hiện muộn hơn. Năm 1879, Wurtz đƣợc xem là ngƣời đầu tiên tách đƣợc protease thực vật. Ông đã tách chiết đƣợc papain từ nhựa quả đu đủ Carica papaya [2]. Đến nay ngƣời ta đã nghiên cứu đƣợc khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease nhƣ: papain, tripsin, kimotripsin, subtilizin... Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt protease động vật, thực vật và vi sinh vật đƣợc tách chiết nghiên cứu. Những nƣớc có công nghệ sản xuất và ứng dụng từ enzyme protease tiên tiến trên thế giới nhƣ Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức và Áo. Hằng năm, nhịp độ sản xuất protease ở quy mô công nghiệp tại các nƣớc phát triển tăng vào khoảng 5% - 10%. Ngày nay, ngƣời ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều 3 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn lần. Vì vậy mà việc ứng dụng enzyme protease vào cuộc sống ngày càng gia tăng. Viện Nghiên cứu Vật liệu dệt Moskva (NCVLD) đã chế tạo thành công băng gạc phủ vết thƣơng trên cơ sở xenlulo vi mô đƣợc cấy enzyme phân giải protein có khả năng làm sạch vết thƣơng mà không cần đến sự trợ giúp của phẫu thuật, nghĩa là có khả năng làm tan các protein hoại tử để chúng thấm vào lớp vải phủ. Trong số các loại vật liệu phủ vết thƣơng đã nghiên cứu chế tạo và đƣa vào sử dụng trong điều trị nhƣ các loại băng Proteox, Dalcektripsin trên ơ sở vật liệu xenlulo tự nhiên có chứa các loại enzyme phân giải protein và các chất hoạt tính sinh học khác nhau, loại băng Multiferm chứa tổ hợp enzyme đƣợc lấy ra từ gan tụy của một số động vật biển cho hiệu quả điều trị cao nhất. Sử dụng chế phẩm Multiferm cho phép làm sạch bề mặt vết thƣơng khỏi các mô hoại tử cũng nhƣ quá trình lên da non diễn ra nhanh 2,3 lần so với phƣơng pháp điều trị truyền thống. Nhiều kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng băng Multiferm chứa tổ hợp enzyme hepatopancreat phân giải protein cho phép làm sạch vết loét dinh dƣỡng khỏi khối mủ - hoại tử hiệu quả hơn 2,3 lần so cới băng chứa tripsin và mexidon [21]... 1.1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nƣớc. Năm 1960, protease mới bắt đầu đƣợc nghiên cứu chính thức ở Việt Nam. Ở động vật, có những nghiên cứu ban đầu về protease ở các loài cá dùng trong sản xuất nƣớc mắm [7]. Ở thực vật, có những nghiên cứu về bromelain ở dứa [3], papain ở đu đủ [2] và các protease ở bí đao [4]. Vai trò của enzyme protease đƣợc ứng dụng rất rộng rãi vào trong đời sống của con ngƣời. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hƣớng tách, tinh sạch 4 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã đƣợc tiến hành bởi nhiều tác giả nhƣ sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, trypsin... sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Hiện nay, protease đã có những ứng dụng sản xuất thử nghiệm nhƣ sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, sản xuất bột protein thịt bằng bromelain từ đọt dứa, lên men rƣợu bằng enzyme cố định trên cột. Cũng đã có những nghiên cứu sử dụng peroxydase, cyt-P450 trong chế tạo biosensor và thuốc phát hiện chất độc... Trong lĩnh vực y dƣợc, việc nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của một số enzyme nhằm mục đích kiến tạo nên một số thuốc dùng điều trị một số bệnh đặc biệt là tạo ra một số chế phẩm thuốc chống suy dinh dƣỡng ở trẻ em, đồng thời đã tiến hành sản xuất đại trà. Đây là một đóng góp rất thiết thực và kịp thời trong việc phòng chống suy dinh dƣỡng ở nƣớc ta [40]. Những nghiên cứu gần đây tại Việt Nam cho thấy, protease có thể đƣợc thu nhận từ rất nhiều nguồn khác nhau. Tại các phòng thí nghiệm trọng điểm của các Viện nghiên cứu, các trung tâm nghiên cứu hoặc từ một số trƣờng đại học lớn trên cả nƣớc đã tiến hành nghiên cứu tách chiết và tìm các điều kiện ảnh hƣởng tới hoạt tính của enzyme này. Chúng ta có thể thu nhận enzyme protease từ ruột cá basa [5], từ vi sinh vật, từ môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Baccillus hay từ môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn P. aeruginosa CB07 [6]… 1.2. ENZYME PHÂN GIẢI PROTEIN - PROTEASE Protease hay peptidase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết peptide (-CO~NH-) trong các phân tử polypeptide, protein và một số cơ chất khác tƣơng tự thành các amino acid tự do hoặc các peptide phân tử 5 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thấp. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin. Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide Hình 1.2. Mô hình enzyme protease thủy phân Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý nhƣ: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng. Các protease có thể hoạt động nhƣ các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thƣờng, trong sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN… Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên đƣợc phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tƣợng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, tụy, dạ giày,...). 6 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cấu trúc không gian đặc trƣng của protease. Đáng chú ý là cấu trúc không gian của protease tách chiết từ gan tụy của loài cua vua (king crab) đƣợc ông Kuzmin. S và cs…[30] mô phỏng theo cấu trúc không gian dƣới đây: Hình 1.3. Cấu trúc không gian enzyme phân giải protein 1.3. PHÂN LOẠI Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) [24]. Trong hệ thống danh pháp MEROPS trên website www.merops.ac.uk [43] đã phân loại protease, subtilisin (EC.3.4.21.62) thuộc phân nhánh Subtilases (SB) của nhóm serine protease (EC.3.4.21.-) với điểm đặc trƣng là sử dụng đơn phân serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme. Ngoài 7 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn subtilisin, trong phân nhánh SB còn có các protease liên quan đến quá trình xử lý tiền hormone nhƣ KEX2 protease, furin, và PC2. Protease đƣợc phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase. Hình 1.4. Sơ đồ phân loại protease Protease (E.C.3.4) Exopeptidase Endopeptidase (E.C. 3.4.11-17) (E.C. 3.4.21-99) Serine proteinase Aminopeptidase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Metallo proteinase 1.3.1. Exopeptidase Exopeptidase phân cắt liên kết peptide ở hai đầu tự do của chuỗi polypeptide. Dựa vào vị trí phân cắt liên kết peptide ở đầu C và đầu N , exopeptidase đƣợc phân chia thành hai loại : Aminopeptidase và Carboxypeptidase. 8 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. 1.3.2. Endopeptidase Endopeptidase phân cắt liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide cách xa hai đầu tự do N và C. Sự có mặt của hai đầu tự do này không ảnh hƣởng tới hoạt tính của enzyme. Theo tác giả Herley (1960), dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase đƣợc chia thành bốn nhóm nhƣ sau [22]: Serin protease (EC 3.4.21): là những protease chƣ́a nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn nhƣ subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Serine protease bị kìm hãm bởi 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI), L3-carboxytrans 2,3-epoxypropyl-leucylamido (4-guanidine) butane (E.64), diisopropylfluorophosphate (DFP), phenylmethysulfonyl fluoride (PMSF) và tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK). Một số khác bị kìm hãm bởi thuốc thử thiol ví dụ nhƣ p-chloromercuribenzoate (PCMB). Serine protease hoạt động ở vùng pH trung tính và kiềm với phổ pH 7-11, điểm đẳng điện thƣờng ở pH 4-6. Serine protease có tính đặc hiệu rất rộng [23]. Cysteine protease (E.C.3.4.22): Các protease chƣ́a nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Hoạt tính của Cysteine protease phụ thuộc vào sự có mặt 9 Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn