BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ ĐÔNG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ CƠ CHẾ HẠ
GLUCOSE MÁU CỦA DỊCH ÉP THÂN CÂY
CHUỐI TIÊU (MUSA X PARADISIACA L.)
TRÊN THỰC NGHIỆM
Chuyên ngành: Hoá sinh Dược
Mã số: 62720408
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI, NĂM 2017
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Bộ môn Hoá sinh,
trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Phùng Thanh Hƣơng
GS.TS. Nguyễn Hải Nam
Phản biện 1 : …………………………………………..
…………………………………………..
Phản biện 2 : …………………………………………..
…………………………………………..
Phản biện 3 : …………………………………………..
…………………………………………..
Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án
cấp trƣờng họp tại: Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội
Vào hồi ….giờ……ngày….tháng…. năm 2017
Có thể tìm hiểu luận án tại: Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
Thƣ viện Trƣờng ĐH Dƣợc HN
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm qua số các nghiên cứu về đái tháo đường đã
,
tăng lên nhanh chóng. Kết quả là sự ra đời của các thuốc mới và các
ứng dụng trong điều trị Các thuốc điề u tri đái tháo đường đang đươ ̣c sử
.
̣
dụng đã cho thấy những hiệu quả nhất định
. Tuy nhiên hiê ̣u quả lâu dài
,
trong viê ̣c ngăn ngừa các biế n chứng của đái tháo đường thông qua
kiể m soát glucose máuvẫn còn hạn chế, đồ ng thời những phản ứng bấ t
lơ ̣i khi sử du ̣ng thuố c vẫn là một vấn đề đáng lưu ý. Do đó, mô ̣t trong
những mố i quan tâm hàng đầ u của các nhà khoa ho ̣c hiê ̣n nay là viê ̣c
tìm ra những thuốc mới điều trị đái tháo đường dựa trên sự khám phá
các đích tác dụng mới nhằ m nâng cao hiê ̣u quả điề u tri ̣đái tháo đường
,
,
đồ ng thời giảm đươ ̣c những phản ứng bấ t lơ ̣iTừ hướng nghiên cứu đó,
.
đã có nhiều loại thảo dược được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ
glucose máu như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh.
Cây Chuối tiêu (Musa x paradisiaca L.) được biết đến như một loại
thực phẩm và cũng là một vị thuốc. Theo kinh nghiệm dân gian của
đồng bào dân tộc thiểu số phía Bắc Việt Nam và một số quốc gia trên
thế giới, phần thân chuối ép lấy nước uống để điều trị đái tháo đường,
kết quả hạ glucose máu. Tuy nhiên, cho đến thời điểm này chưa có tài
liệu khoa học nào của Việt Nam nghiên cứu về tác dụng sinh học của
thân cây chuối tiêu. Hiện nay, trên thế giới có một vài nghiên cứu về tác
dụng điều trị đái tháo đường của thân cây chuối tiêu nhưng chỉ mới ở
mức độ sàng lọc, kết quả chưa thống nhất, chưa có một nghiên cứu có
hệ thống nào đánh giá được tác dụng và cơ chế tác dụng hạ glucose
máu của dược liệu này. Để có những bằng chứng khoa học về tác dụng
và cơ chế tác dụng của thân cây chuối tiêu trong điều trị đái tháo đường
luận án tiến hành đề tài “Nghiên cứu tác dụng và cơ chế hạ glucose
máu của dịch ép thân cây chuối tiêu (Musa x paradisiacal L.) trên
thực nghiệm” với 2 mục tiêu.
1. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của cắn toàn phần từ
dịch ép thân cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm.
2. Nghiên cứu cơ chế hạ glucose máu của cắn toàn phần và
một số chất phân lập từ dịch ép thân cây chuối tiêu
1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƢỜNG
Trong phần đại cương về bệnh đái tháo đường, luận án đã
trình bày các nội dung: định nghĩa, dịch tễ, phân loại, tiêu chuẩ n
chẩ n đoán, cơ chế bệnh sinh của bệnh đái tháo đường .
1.2. CÁC CƠ CHẾ GÂY HẠ GLUCOSE MÁU
Tăng glucose máu mạn tính là đặc trưng cơ bản của bệnh đái
tháo đường , gây ra các biến chứng nguy hiểm. Vì vậy hầu hết các
thuốc điều trị bệnh đái tháo đường đều nhằm mục đích làm hạ
glucose máu với các cơ chế khác nhau. Nhìn chung, cơ chế hạ
glucose máu rất phong phú. Mỗi thuốc có thể tác động theo một
hoặc nhiều cơ chế khác nhau. Luận án đã trình bày một số cơ chế hạ
glucose máu đã được áp dụng trong điều trị hoặc trong các nghiên
cứu thực nghiệm như:
Tăng cường số lượng insulin thông qua ức chế kênh KATP,
tăng nồng độ calci nội bào, kích thích tiểu đảo tụy sản xuất insulin
và thông qua các incretin, một số hormon nguồn gốc từ ruột tăng tiết
insulin.
Tăng cường nhạy cảm của mô đích với insulin thông qua
việc hoạt hóa AMPK, tăng gia nhâ ̣p glucose vào cơ , giảm tân tạo
glucose ở gan , tăng hoa ̣t đô ̣ng của ty thể ... gây ha ̣ glucose máu .
Thông qua receptor PPAR là kích thích biệt hoá tế bào mỡ, kích
thích các enzym và protein vận chuyển của tế bào mỡ, làm tăng nhạy
cảm với insulin ở mô đích . Thông qua quá trình truyền tín hiệu của
insulin ở tế bào đích tác động vào nguyên nhân gây kháng insulin
Tác dụng điều hòa, chuyển hóa tương tự như insulin thông
qua ức chế G6Pase và thông qua hoạt hóa GLUT4.
Ức chế tiêu hóa carbohydrat thông qua ức chế enzym αamylase và α-glucosidase làm hạ glucose máu sau ăn.
2
1.3. CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU
THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƢỜNG
Luận án đề cập tới mô hình thực nghiệm in vivo và in vitro.
Mô hình thực nghiệm in vivo luận án trình bày các mô hình
gây bệnh đái tháo đường typ 1 và typ 2. Trong đó mô hình gây bệnh
đái tháo đường typ 1 bao gồm các phương pháp: Đái tháo đường typ
1 do di truyền, cắt bỏ tuyến tụy, nhiễm virus, sử dụng hóa chất
(Streptozocin, Alloxan liều cao). Mô hình gây bệnh đái tháo đường
typ 2 gồm các phương pháp: gây đái tháo đường typ 2 do đột biến
gen, chế độ ăn nhiều carbohydrat, sử dụng hóa chất (Streptozocin
liều thấp, Streptozocin kết hợp với nicotinamid, kết hợp STZ liều
thấp và chế độ ăn giàu chất béo)
Mô hình thực nghiệm in vitro bao gồm: Đánh giá tác động
lên hoạt tính của các enzym tiêu hóa và chuyển hóa glucid. Đánh giá
khả năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy (trên đảo tụy cô lập
hoặc tế bào β đảo tụy, trên khả năng chết theo chương trình hoặc sự
sinh sản, thay đổi kích thước tế bào β). Đánh giá mức độ nhạy cảm
của mô đích với insulin (thông qua mức độ mức độ biểu hiện của các
protein có vai trò quan trọng trong hoạt động của insulin như IRS-1,
Akt, GSK3, AMPK, PPAR, GLUT4 trên các dòng tế bào cơ xương
và tế bào mô mỡ). Đánh giá thông qua ức chế PTP1B, GSK-3α giảm
kháng insulin trong con đường truyền tín hiệu của insulin.
1.4. CÂY CHUỐI TIÊU
Phần tổng quan về cây chuối tiêu, luận án trình bày các nội
dung về: vị trí phân loại và đặc điểm thực vật, tên khoa học, bộ phận
dùng, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của
cây chuối tiêu đặc biệt là các nghiên cứu về tác dụng hạ glucose máu
liên quan đến đái tháo đường của thân cây chuối tiêu.
Mặc dù đã có một số nghiên cứu bước đầu chứng minh tác
dụng hạ glucose máu của thân cây chuối tiêu trên chuột thực nghiệm
nhưng chưa có nghiên cứu nào đi vào tìm hiểu cơ chế hạ glucose
máu cũng như tác động trên chuyển hóa của bộ phận dùng này.
3
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Dƣợc liệu nghiên cứu: Thân giả cây chuối tiêu (Musa x
paradisiaca L.) thống nhất gọi thân cây chuối tiêu.
2.1.2. Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt và chuột cống trắng
2.1.3. Các dòng tế bào: Tế bào cơ vân chuột nhắt (C2C12) và tế bào
mô mỡ chuột nhắt (3T3-L1).
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp điều chế mẫu nghiên cứu
- Điều chế cắn toàn phần: Thân cây chuối tiêu ép lấy dịch,
cất quay chân không thu cắn, sấy áp xuất giảm, thu cắn toàn phần.
- Điều chế cắn phân đoạn: Dịch ép toàn phần được lắc với
các dung môi hữu cơ (n-hexan, chloroform, ethylacetat, n-butanol,
cắn nước còn lại), sấy áp xuất giảm thu được cắn phân đoạn.
Cắn toàn phần và cắn phân đoạn được pha trong dung môi
NaCMC 0,5% thành hỗn dịch. Sử dụng liều 1000mg/kg chuột nhắt
và 500mg/kg chuột cống. Thí nghiệm in vitro phụ thuộc mô hình
thực nghiệm để sử dụng các dung môi pha mẫu thử cho thích hợp.
2.3.2. Đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên chuột thực nghiệm
- Trên chuột nhắt trắng tăng glucose máu thực nghiệm
bởi Streptozocin (STZ) liều 150 mg/kg
+ Đánh giá tác dụng của cắn toàn phần: Chuột nhắt thí
nghiệm gây tăng glucose máu bằng cách tiêm màng bụng STZ liều
150 mg/kg. Sau 72 giờ, chọn các chuột có glucose máu trên 11,0
mmol/L chia thành 4 lô (chứng bệnh, gliclazid, metformin, mẫu
thử), song song tiến hành thí nghiệm với 1 lô chuột bình thường.
Chuột được uống mẫu thử liên tục 15 ngày. Ngày thứ 16 chuột nhịn
đói 10h, thu máu toàn phần để định lượng glucose, insulin huyết
thanh, xác định hoạt độ G6Pase.
- Trên chuột cống đái tháo đƣờng typ 2 thực nghiệm
+ Mô hình gây bệnh đái tháo đường typ 2 thực nghiệm:
chuột cống trắng, được nuôi bằng chế độ ăn 60% tổng số calo của
khẩu phần ăn là chất béo. Sau 60 ngày tiêm màng bụng STZ với liều
4
50 mg/kg. Sau 72 giờ định lượng glucose máu lúc đói của chuột.
Chọn những chuột có glucose máu trên 11 mmol/L để làm thí
nghiệm
+ Đánh giá tác dụng của cắn toàn phần: Chuột đái tháo
đường typ 2 được chia thành 3 lô (chứng bệnh, chứng dương, mẫu
thử) lô chuột bình thường uống dung môi pha hỗn dịch thử. Ngày
thứ 16, chuột nhịn đói 10h, định lượng glucose, insulin huyết thanh,
triglycerid (TG), cholesterol toàn phần (Cho TP), hoạt độ G6Pase
gan, tình trạng đại thể và vi thể của tụy.
- Trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống đái
tháo đƣờng typ 2 thực nghiệm
Chuột đái tháo đường typ 2 uống mẫu thử 15 ngày, cho
chuột nhịn đói 10 giờ, sau đó cho uống dung dịch glucose 3 g/kg thể
trọng. Định lượng glucose máu sau khi uống dung dịch glucose ở
các thời điểm 0 phút; 30, 60, 90 và 120 phút.
- Đánh giá tác dụng của cắn phân đoạn: Tiến hành trên
chuột tiêm STZ liều 150 mg/kg để tìm ra phân đoạn có tác dụng hạ
glucose máu chiếm ưu thế. Sau đó chọn phân đoạn này thử nghiệm
trên chuột đái tháo đường typ 2 thực nghiệm. Từ đó lựa chọn phân
đoạn phân lập chất định hướng điều trị đái tháo đường.
2.3.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh trong thực nghiệm in vivo
Định lượng glucose máu, insulin, cholesterol toàn phần,
triglycerid huyết thanh, xác định hoạt độ enzym G6Pase.
2.3.4. Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học
Nguyên tắc: Theo phương pháp nhuộm (HE) thường quy
nhân tế bào beta bắt màu xanh đen, bào tương bắt màu hồng.
2.3.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzym G6Pase gan (EC 3.1.3.9)
- Nguyên tắ c
G6 Pase
Glucose-6-phosphat + H2O
Glucose + phospho vô cơ (Pi)
2.3.6. Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế các enzym in vitro
- Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase
1B (PTP1B - EC 3.1.3.48)
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng loại bỏ nhóm phosphat ở
phân tử tyrosin đã được phosphoryl hóa (pTyr 1158) trong tiểu đơn
vị beta của insulin receptor dưới tác dụng của PTP1B. Phần phospho
5
tự do (Pi) tạo ra từ phản ứng được định lượng bằng phương pháp đo
quang ở bước sóng 595nm.
- Đánh giá khả năng ức chế α-amylase (EC 3.2.1.1)
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất là 2chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotriosid bởi enzym α-amylase tạo
thành 2-chloro-4-nitrophenol, phát hiện màu của 2-chloro-4nitrophenol ở bước sóng 400 nm.
- Đánh giá khả năng ức chế α-glucosidase (EC 3.2.1.20)
Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất pnitrophenyl-α-D-glucopyranosid (PNP-G) bởi α-glucosidase tạo ra
p-nitrophenol (PNP). Định lượng p-nitrophenol/môi trường kiềm
bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 405nm.
2.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng trên sự phosphoryl hóa AMPK và
IRS-1
Nguyên tắc: AMPK được hoạt hóa khi phosphoryl hóa gốc
Threonin 172 trên tiểu đơn vị α của AMPK. Trong khi đó IRS-1 bị
mất hoạt tính, từ đó làm gián đoạn chuỗi truyền tín hiệu nội bào của
insulin khi gốc Serin 307 trên protein này được phosphoryl hóa.
Đánh giá khả năng phosphoryl hóa AMPK và ức chế sự phosphoryl
hóa IRS-1 (Ser307) thông qua bán định lượng p-AMPKα (Thr 172)
và p-IRS-1 (Ser 307) ở tế bào C2C12 sau khi đã được ủ với các mẫu
thử bằng kĩ thuật Western Blot.
2.3.5. Đánh giá khả năng ức chế biệt hóa của TB mô mỡ 3T3-L1
Nguyên tắc: Tế bào 3T3-L1 trong môi trường nuôi cấy thích
hợp sẽ biệt hóa để tạo thành các tế bào mô mỡ thông qua khả năng
tổng hợp triglycerid (TG). Lượng TG hòa tan trong dầu đỏ (Oil Red)
được định lượng bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 500nm.
2.3.7. Phƣơng pháp nghiên cứu thành phần hóa học
Định tính các nhóm chất hóa học bằng các phản ứng hoá học
thường quy, phân lập chất từ 2 phân đoạn có tác dụng hạ glucose
máu chiếm ưu thế bằng sắc ký cột ở pha thường và pha đảo. Xác
định cấu trúc thông qua nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu các phổ...
2.3.8. Xử lý số liệu
Kết quả được biểu diễn dưới dạng Xtb±SD (giá trị trung
bình của từng lô và độ lệch chuẩn). Xử lí số liệu bằng phần mềm
SPSS 16 và Microft Excel 2007, Graphpad Prism 7.03,
Wolframalpha, Image J, khác biệt khi p < 0,05.
6
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU
TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
3.1.1. Kết quả tác dụng hạ của cắn toàn phần
3.1.1.1. Tác dụng của cắn toàn phần trên glucose máu của chuột
tiêm STZ liều 150mg/kg
Sau 15 ngày uống mẫu thử, mức hạ glucose máu của các lô
chuột thí nghiệm so với ngày đầu tiên được trình bày tại hình 3.1
Hình 3.1. Mức hạ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm tiêm
STZ (150 mg/kg) sau 15 ngày uống mẫu thử
Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, mức hạ glucose máu của lô
chuột uống hỗn dịch cắn toàn phần khác biệt (p < 0,01) so với lô
chứng bệnh.
3.1.1.2. Tác dụng của cắn toàn phần trên nồng độ glucose máu
của chuột đái tháo đƣờng typ 2
Sự thay đổi nồng độ glucose máu của các lô chuột đái tháo
đường typ 2 sau 15 ngày điều trị được thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Nồng độ glucose máu của chuột cống đái tháo đường
typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử
Lô chuột
Mẫu thử
Lô 1 (chứng sinh lý)
Lô 2 (chứng bệnh)
Lô 3 (chứng dương)
Lô 4 (Thử)
DM pha hỗn dịch thử
DM pha hỗn dịch thử
Metformin
Cắn TP
7
Glucose máu (mmol/L)
Ngày 1
Ngày 16
***
5,88 0,94
5,69 0,88***
18,95 2,48
18,75 2,00
19,18 1,97
9,01 1,37**
19,07 2,17
14,02 1,66*
Nhận xét: sau 15 ngày uống mẫu thử, nồng độ glucose máu của lô 3
giảm khác so với lô chứng bệnh (p < 0,05). Kết quả mức hạ glucose
máu của các lô chuột thử nghiệm sau 15 ngày uống mẫu thử được
thể hiện trên hình 3.2.
Hình 3.2. Mức hạ glucose máu của các lô chuột đái tháo đường
typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử
Nhận xét: lô chuột uống hỗn dịch cắn toàn phần có mức hạ glucose
máu khác so với lô chứng bệnh (p<0,05)
3.1.1.3. Tác dụng của cắn toàn phần trên khả năng dung nạp
glucose của chuột cống đái tháo đƣờng typ 2
Đồ thị biểu diễn nồng độ glucose máu của các lô chuột đái
tháo đường typ 2 trong test dung nạp glucose bằng đường uống được
thể hiện trong hình 3.3.
Hình 3.3. sự thay đổi nồng độ glucose máu của các lô chuột đái
tháo đường typ 2 thực nghiệm trong test dung nạp glucose
8
Nhận xét: glucose máu của các lô chuột uống metformin và cắn toàn
phần tăng khác so với lô chứng bệnh (p<0,01 và p<0,05). Sự tồn lưu
glucose trong máu của chuột được đánh giá bằng diện tích dưới
đường cong (AUC), kết quả được thể hiện trong hình 3.4.
Hình 3.4. Sự tồn lưu glucose trong máu của chuột cống đái tháo
đường typ 2
Nhận xét: AUC glucose của lô 3 và lô 4 (uống metformin và
cắn toàn phần), giảm khác biệt so với lô chứng bệnh (p<0,01 và 0,05)
3.1.2. Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn
3.1.2.1. Tác dụng của cắn phân đoạn trên glucose máu của chuột
tiêm STZ liều 150mg/kg
Mức hạ glucose máu của các lô chuột thí nghiệm sau 15
ngày uống hỗn dịch cắn các phân đoạn, cắn toàn phần và metformin
được thể hiện trong hình 3.5.
Hình 3.5. Mức hạ glucose máu của các lô chuột tiêm STZ 150
mg/kg sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn các phân đoạn
9
Nhận xét: trong các phân đoạn dịch chiết, chỉ có lô 5 và lô 6 (uống
cắn phân đoạn ethylacetat và phân đoạn n-buthanol) có mức hạ
glucose khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p<0,01)
3.1.2.2. Kết quả tác dụng của cắn phân đoạn ethylacetat và nbutanol trên chuột đái tháo đƣờng typ 2.
Sau 15 ngày uống cắn ethylacetat và n-butanol, mức hạ
glucose máu của các lô chuột được thể hiện trong hình 3.6.
Hình 3.6. Mức hạ glucose máu của các lô chuột đái tháo đường
typ 2 sau 15 ngày uống cắn phân đoạn n-butanol và ethylacetat
Nhận xét: mức hạ glucose máu ở cả 2 lô chuột uống cắn PĐ
ethylacetat và n-butanol khác (p<0,01) so với lô chứng bệnh.
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
3.2.1. Định tính các nhóm chất
Thân cây chuối tiêu có chứa các hợp chất tanin, sterol,
đường khử và acid hữu cơ. Phân đoạn ethylacetat có tannin, sterol,
acid hữu cơ và phân đoạn n-butanol có sterol, đường khử.
3.2.2. Kết quả phân lập chất
Phân đoạn ethylacetat và n-butanol phân lập được 6 chất là:
cycloeucalenon, acid procatechuic, acid myristic, daucosterol, βsitosterol và bis-(2-ethyl hexyl hexanoat).
3.3. KẾT QUẢ CƠ CHẾ HẠ GLUCOSE MÁU
3.3.1. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vivo
3.3.1.1. Kết quả nồng độ insulin huyết thanh
10
- Trên chuột tiêm tiêm STZ liều 150mg/kg: sau 15 ngày
uống mẫu thử, định lượng insulin huyết thanh, tính chỉ số kháng
insulin và chức năng tế bào beta của chuột thể hiện trong bảng 3.12.
Bảng 3.12. Nồng độ insulin huyết thanh của các lô chuột tiêm
STZ 150 mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử
Mẫu thử
Lô
Lô 1 (Chứng
sinh lý)
Lô 2 (Chứng
bệnh,)
Lô 3 (Chứng
dương)
Lô 4 (Chứng
dương)
Lô 5 (Thử)
Insulin
(ng/mL)
1,440,13**
IR
%β
18,984,02
617,3724,35
0,41±0,06
13,523,55
29,813,64
0,84±0,08*
13,373,20
198,3818.11
Metformin
0,45±0,07
7,372,62
101,176,38
Cắn TP
0,43±0,07
706,252,59
96,307,57
DM pha HD
thử
DM pha HD
thử
Gliclazid
Trong đó %β là chức năng tế bào β, IR là chỉ số kháng insulin
Nhận xét: hai lô chuột uống metformin và cắn toàn phần có
nồng độ insulin huyết thanh, chức năng tế bào β không khác biệt so
với lô chứng bệnh. Lô chuột uống gliclazid có nồng độ insulin và
chức năng tế bào β cao khác biệt với lô chứng bệnh (p<0,05)
- Trên chuột đái tháo đường typ 2: Sau 15 ngày uống mẫu
thử, định lượng insulin huyết thanh, chỉ số kháng insulin và chức
năng tế bào beta của chuột, kết quả được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống đái tháo
đường typ 2 sau 15 ngày uống hỗn dịch cắn toàn phần
Lô
Lô 1
(sinh lý)
Lô 2
(bệnh)
Lô 3
(dương)
Lô 4
(thử)
Mẫu
thử
DM pha
HD thử
DM HD
pha thử
Metform
in
Cắn toàn
phần
Insulin HT
(ng/ml)
Ngày
Ngày
1
16
0,73±
0,78±
0,20
0,10*
1,39±
1,42±
0,23
0,17
1,41±
1,38±
0,29
0,19
1,32± 1,35±0,
0,14
14
11
%β
IR
Ngày
1
9,64±
2,50
59,03±
6,91
56,8±
7,43
60,78±
7,22
Ngày
16
10,03
±3,01
49,46
±6,51
28,15
±3,07
43,00
±6,53
Ngày
1
269,52
±15,15
74,12±
9,41
68,13±
9,08
73,1±
7,68
Ngày
16
278,13
±15,54
75,64±
9,62
204,15
±13,23
103,42
±9,36
Nhận xét: sau 15 ngày uống metformin và hỗn dịch cắn toàn phần
có sự khác biệt về chức năng tế bào β và chỉ số kháng insulin so với
lô chứng bệnh (p<0,01 và p<0,05) .
3.3.1.2. Tình trạng mô tụy nội tiết và tế bào β của chuột đái tháo
đƣờng typ 2
Ảnh hưởng của mẫu thử đến tình trạng mô tụy của chuột đái
tháo đường typ 2, kết quả được thể hiện ở hình 3.13
2. Chứng bệnh
1.Chứng sinh lý
T
B
B
4. Thử
3.Chứng dương (metformin)
B
B
Hình 3.13. Mô bệnh học tụy của các lô chuột đái tháo đường typ 2
sau 15 ngày uống mẫu thử (nhuộm HE x 400 lần)
B: tế bào beta; T: dấu hiệu thoái hóa
Nhận xét: kết quả cho thấy ở lô chứng bệnh (lô 2), mật độ tiểu đảo
tụy giảm, đảo tụy biến dạng, teo lại và giảm về kích thước, tế bào
tiểu đảo tụy giảm về số lượng, có dấu hiệu thoái hóa hốc.
3.3.1.3. Kết quả nồng độ lipid huyết thanh
Mức hạ nồng độ Cho TP và TG của các lô chuột sau 15 ngày
uống mẫu thử được thể hiện trong hình 3.14
12
Hình 3.14. Phần trăm hạ lipid máu của các lô chuột thí nghiệm
*
: p<0,01 so với lô chứng bệnh
Nhận xét: ở lô chuột uống cắn toàn phần thân cây chuối tiêu và lô
chuột uống metformin có mức hạ Cho TP và TG khác biệt so với lô
chứng bệnh (p<0,01).
3.3.1.4. Kết quả trên hoạt độ enzym G6Pase gan
- Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột tăng glucose máu
bằng STZ liều 150mg/kg
Để đánh giá tác dụng của cắn toàn phần thân cây chuối tiêu
trên sự tổng hợp glucose nội sinh, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của
mẫu thử trên hoạt độ enzym G6Pase ở gan chuột của các lô thí
nghiệm, kết quả được trình bày ở bảng 3.17.
Bảng 3.17. Hoạt độ G6Pase gan của các lô chuột tiêm STZ 150
mg/kg sau 15 ngày uống mẫu thử
Lô
Mẫu thử
Lô 1 (Sinh lý)
Lô 2 (Bệnh )
Lô 3 (Dương)
Lô 4 (Dương)
Lô 5 (Thử)
DM pha HD
DM pha HD
Gliclazid
Metformin
Cắn TP
Hoạt độ riêng
(µgPi/phút/mg
protein)
0,54±0,14*
0,81±0,17
0,56±0,15*
0,55±0,16*
0,57±0,16*
% hoạt
độ enzym
% ức
chế
100%
150,00%
103,70 %
101,85%
105,56%
46,30
48,15
44,44
Nhận xét: các lô uống mẫu thử và chứng dương, làm giảm hoạt độ
G6Pase có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p < 0,05).
- Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột đái tháo đường typ 2
13
Chuột đái tháo đường typ 2 sau khi uống mẫu thử trong 15
ngày, xác định hoạt độ G6Pase gan, kết qủa được thể hiện trong
bảng 3.18.
Bảng 3.18. Hoạt độ enzym G6Pase gan của chuột đái tháo đường
typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử
Hoạt độ riêng
enzym G6Pase
(µgPi/phút/mg
protein)
Lô
Mẫu thử
Lô 1 (sinh lý,
Lô 2 (chứng bệnh)
Lô 3 (chứng dương)
Lô 4 (Thử, )
DM pha HD thử
DM pha HD thử
Metformin
Cắn toàn TP
% hoạt
độ
enzym
%
ức
chế
1,98±0,59*
3,01±0,87
2,03±0,77*
2,20±0,73*
100%
152,02%
103%
111,11%
49,02
40,91
*: p < 0,05 so với lô chứng bệnh
Nhận xét: hoạt độ enzym G6Pase gan ở lô uống hỗn dịch cắn toàn
phần và metformin giảm có ý nghĩa so với lô chứng bệnh (p < 0,05).
3.2.2. Kết quả trên các mô hình thực nghiệm in vitro
3.2.2.1.Tác dụng ức chế enzym α-amylase của cắn toàn phần và
các chất phân lập
Khả năng ức chế hoạt tính của enzym α-amylase của cắn
toàn phần và các chất phân lập, được trình bày trong bảng 3.20
Bảng 3.20. Khả năng ức chế enzym α-amylasecủa cắn toàn phần
và các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu
Tên chất
Cắn TP (5,10,30µg/ml) (-)
Cycloeucalenon
Acid myristic
Bis(2-ethylhexyl) hexanoat
β-sitosterol
Acid protocatechuic
Daucosterol
Acarbose*
Chất phân lập
Khả năng ức chế (%)
5µM
10µM
25µM
16,34±1,47
29,77±4,45
(-): không có tác dụng ;
14
23,38±0,9
37,64± 2,17
51,95±0,85
55,22±1,5
*: chứng dương
Nhận xét: Chỉ có β-sitosterol có tác dụng ức chế enzym α-amylase
với các mức liều khác nhau với IC50 là 20,37µM.
3.2.2.2.Tác dụng ức chế enzym α-glucosidase của cắn toàn phần
và các chất phân lập
Khả năng ức chế hoạt tính của enzym α-glucosidase của cắn
toàn phần và các chất phân lập, được trình bày trong bảng 3.23
Bảng 3.23. Khả năng ức chế enzym α-glucosidase của cắn toàn
phần và các chất phân lập từ thân cây chuối tiêu
Cắn toàn phần
Khả năng ức chế
(%)
5µg/ml
14,03±
3,03
10µg/ml 25,07±
0,4
30µg/ml 75,09±
3,53
Chất phân lập
Tên chất
Khả năng ức chế (%)
5µM
Cycloeucalenon
Acid myristic
Bis(2-ethylhexyl)
hexanoat
β-sitosterol
Acid
protocatechuic
Daucosterol
Acarbose*
10µM
25µM
-
-
-
-
-
-
24,56±
2,67
33,73±
1,14
52,19±
1,40
19,14±
2,39
34,68±
1,83
28,25±
0,83
39,07±
1,38
70,38±
2,41
53,2±
0,46
(-): không có tác dụng ;
*: chứng dương
Nhận xét: cắn toàn phần thân cây chuối tiêu thể hiện khả năng ức
chế enzym α-glucosidase ở nồng độ 10 và 30µg/ml là 25,07 và
75,09%. Trong 6 chất phân lập, chỉ có daucosterol và β-sitosterol có
tác dụng ức chế enzym α-amylase với IC50 là 17,43 và 22,6µM.
3.2.2.3.Tác dụng ức chế PTP1B của cắn toàn phần và các chất
phân lập
Khả năng ức chế PTP1B của cắn toàn phần và các chất phân
lập, được trình bày trong bảng 3.25
15
Bảng 3.25. Khả năng ức PTP1B của cắn toàn phần các
chất phân lập từ thân cây chuối tiêu
Cắn toàn phần
Khả năng ức chế
(%)
5µg/ml
17±77
0,23
10µg/ml 34,61±
0,81
30µg/ml 46,53±
1,09
Chất phân lập
Tên chất
Khả năng ức chế (%)
5µM
Cycloeucalenon
Acid myristic
Bis(2-ethylhexyl)
hexanoat
β-sitosterol
Acid
protocatechuic
Daucosterol
Suramin*
10µM
25µM
61,16±
1,24
34,20±
1,08
72,39±
0,78
47,6±
0,35
83,97±
0,83
69,86±
1,13
-
-
-
-
51,83±
0,31
78,62±
0,58
28,18±0,43
(-): không có tác dụng ;
*: chứng dương
Nhận xét: cắn toàn phần thân cây chuối tiêu thể hiện khả năng ức
chế enzym α-glucosidase ở nồng độ 10 và 30µg/ml là 34,46 và
46,53%. Trong 6 chất phân lập, có cycloeucalenon và acid myristic
có tác dụng ức chế PTP1B với IC50 là 3,11và 10,75µM.
3.3.2.4. Tác dụng ức chế sự phosphoryl hóa IRS1(Ser307) trên tế
bào cơ vân chuột nhắt C2C12
- Tác dụng của cắn toàn phần
Tiến hành thử với 3 nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ lặp lại
thí nghiệm 3 lần, kết quả được thể hiện trong hình 3.17
Cắn toàn phần (µg/ml)
Chứng
12,5
25
50
p-IRS-1
(Ser307)
β-actin
Hình 3.17. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau
trên lượng IRS-1 phosphoryl hóa ở Ser307
16
Mật độ ánh sáng của các dải protein được phân tích bằng
phần mềm ImageJ, kết quả được trình bày tại hình 3.18.
Hình 3.18. So sánh lượng p-IRS-1(Ser307) giữa các lô ủ với cắn
toàn phần ở các nồng độ khác nhau
Nhận xét: Mức độ biểu hiện của β-actin không thay đổi cả 3 nồng
độ thử (12,5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml) đều không làm giảm lượng
p-IRS-1(Ser307) có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p > 0,05).
- Tác dụng của hai chất phân lập là cycloeucalenon và
daucosterol
Tế bào C2C12 đã được biệt hóa, sau khi ủ với các mẫu thử
trong 1 giờ, được thu protein, chạy điện di và phân tích Western
Blot theo quy trình mô tả ở phần 2.3.7, kết quả được trình bày tại
hình 3.19
Chứng
H125
H150
H225
H250
p-IRS-1
(Ser307)
β-actin
Hình 3.19. Ảnh hưởng của cycloeucalenon (H1) và daucosterol
(H2) ở các nồng độ khác nhau trên lượng IRS-1 phosphoryl
hóa ở Ser307
17
Mật độ ánh sáng của các dải protein được phân tích bằng
phần mềm Image J. Kết quả được trình bày tại hình 3.20.
Hình 3.20. So sánh lượng p-IRS-1(Ser307) giữa các lô ủ với
cycloeucalenon (H1) và daucosterol (H2) ở các nồng độ khác nhau
Nhận xét: chỉ có nồng độ 50 µg/ml làm giảm lượng p-IRS1(Ser307) có ý nghĩa thống kê so với lô chứng âm (p<0,01).
3.3.2.5. Tác dụng hoạt hoá AMPK trên tế bào cơ vân chuột nhắt
C2C12
- Tác dụng của cắn toàn phần
+ Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của mẫu thử trên sự
phosphoryl hóa AMPK
Để đánh giá tác dụng phosphoryl hóa AMPKα (Thr172) của
cắn toàn phần thân cây chuối tiêu, tiến hành thử với 3 nồng độ khác
nhau, mỗi nồng độ lặp lại thí nghiệm 3 lần.Kết quả được thể hiện ở
hình 3.21.
Chứng
Chứng
Cắn toàn phần (µg/ml)
bệnh
dƣơng
12,5
25,0
50,0
p-AMPK
β actin
Hình 3.21. Tác dụng của cắn toàn phần ở các nồng độ khác nhau
trên lượng AMPKα phosphoryl hóa ở Thr172
18
- Xem thêm -