Tài liệu Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây mần tưới (eupatorium fortunei turcz.) lên sinh trưởng của vi khuẩn lam độc microcystis aeruginosa kutzing trong các thủy vực nước ngọt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ********************** PHẠM THANH NGA NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ CỦA CAO CHIẾT CÂY MẦN TƯỚI (EUPATORIUM FORTUNEI TURCZ.) LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN LAM ĐỘC MICROCYSTIS AERUGINOSA KUTZING TRONG CÁC THỦY VỰC NƯỚC NGỌT Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường Mã số: 9.52.03.20 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hướng dẫn khoa học: Hướng dẫn 1. GS.TS. Đặng Đình Kim Hướng dẫn 2. TS. Lê Thị Phương Quỳnh Hà Nội – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi, Phạm Thanh Nga, tác giả luận án tiến sỹ xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, không trùng lặp và sao chép với bất kì công trình khoa học nào khác. Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào, chưa từng được công bố trong công trình nào khác. Hà Nội, tháng……..năm 2019 Tác giả luận án Phạm Thanh Nga MỤC LỤC MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.........................................3 1.1. Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt.......4 1.1.1. Vi khuẩn lam độc.............................................................................................4 1.1.2. Hiện tượng phú dưỡng và triển bùng nổ sinh khối VKL độc...........................6 1.1.3. Các biện pháp kiểm soát phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc...................10 1.1.4. Phương pháp triển khai áp dụng ngoài thực tế tại các ao, hồ Việt Nam.......17 1.2. Sử dụng cao chiết thực vật và hoạt chất thiên nhiên để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam độc......................................................................................................... 20 1.2.1. Hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất thiên nhiên.......................20 1.2.2. Nghiên cứu điển hình sử dụng cao chiết, dịch chiết thực vật kiểm soát bùng phát VKL độc........................................................................................................... 22 1.2.3. Một số nhóm hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên kiểm soát bùng nổ VKL....30 1.2.4. Cơ chế tác động của các cao chiết và các hợp chất thiên nhiên lên sinh trưởng của VKL độc M. aeruginosa........................................................................ 32 1.3. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei.................................................................. 34 1.3.1. Sơ lược về cây Mần tưới Eupatorium fortunei............................................... 34 1.3.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học.................................................... 34 1.3.3. Hoạt tính sinh học của cây Mần tưới............................................................. 42 1.3.4. Ứng dụng cao chiết cây Mần tưới để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc M. aeruginosa.......................................................................................................... 45 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................47 2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 47 2.1.1. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei................................................................ 47 2.1.2. Vi khuẩn lam độc nước ngọt Microcystis aeruginosa Kützing......................47 2.1.3. Loài tảo lục Chlorella vulgaris...................................................................... 48 2.1.4. Bèo tấm Lemna minor.................................................................................... 49 2.1.5. Giáp xác Daphnia magna.............................................................................. 49 2.1.6. Quần thể thực vật phù du hồ Hoàn Kiếm và hồ Láng.................................... 50 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất............................................................................ 50 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ........................................................................................ 50 2.2.2. Hóa chất........................................................................................................ 50 2.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 51 2.3.1. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập các hợp chất sạch ................................................................................................................................. 51 2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất sạch.......................................51 2.3.3. Phương pháp đánh giá sinh trưởng của VKL, tảo lục Chlorella vulgaris và thực vật phù du........................................................................................................ 51 2.3.4. Phương pháp quan sát hình thái tế bào VKL và Chlorella vulgaris [63].......53 2.3.5. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Daphnia magna [135].......53 2.3.6. Phương pháp đánh giá độc tố của cao chiết lên Lemna minor [22]..............54 2.3.7. Phương pháp phân tích chất lượng môi trường nước [17]............................54 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................. 55 2.4. Mô tả thực nghiệm............................................................................................ 55 2.4.1. Thực nghiệm xử lý mẫu thực vật, tạo cao chiết và phân lập chất sạch...........55 Quy trình phân lập các chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetate Mần tưới .. 59 2.4.2. Thực nghiệm nghiên cứu độc tính diệt VKL độc và tảo lục của các cao chiết ................................................................................................................................. 62 2.4.3. Thực nghiệm đánh giá tính an toàn của cao chiết.......................................... 64 2.4.4. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao chiết đối với mẫu nước hồ tự nhiên ................................................................................................................................. 66 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................67 3.1. Công thức cấu tạo các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới Eupatorium fortunei . 68 3.1.1. Hợp chất 7,8,9-trihydroxythymol (EfD4.7)................................................... 69 3.1.2. Hợp chất 8,10-didehydro-7,9-dihydroxythymol(EfD4.8)...............................75 3.1.3. Hợp chất 8,9,10- Trihydroxythymol (EfD5.1)................................................ 79 3.1.4. Hợp chất o-Coumaric acid (EfD1.8)............................................................. 80 3.1.5. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)benzaldehyde (EfD10.1)...................................81 3.1.6. Hợp chất kaempferol (EfD10.3)..................................................................... 82 3.1.7. Hợp chất 8,10-dihydroxy-9-acetoxythymol (EfD14.1)...................................83 3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng và diệt VKL độc, vi tảo của các cao chiết và chất sạch được phân lập....................................................................... 86 3.2.1. Đánh giá khả năng ức chế sinh trưởng VKL độc Microcystis aeruginosa TC3 của các cao chiết tổng Mần tưới.............................................................................. 86 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol Mần tưới lên sinh trưởng của Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris.......................................... 89 3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn lên sinh trưởng của Microcystis aeruginosa TC3 và Chlorella vulgaris................................................. 95 3.2.4. Đánh giá tiềm năng kiểm soát bùng nổ sinh khối Microcystis aeruginosa TC3 của cao chiết Mần tưới..........................................................................................101 3.2.5. Đánh giá hoạt tính diệt Microcystis aeruginosa TC3 của các chất sạch.....105 3.2.6. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc tế bào M. aeruginosa TC3 và C. vulgaris .......................................................................................................................................109 3.3. Kết quả đánh giá tính an toàn của cao chiết thực vật Mần tưới (ảnh hưởng lên một số sinh vật khác).............................................................................................115 3.3.1. Ảnh hưởng của cao chiết đến giáp xác Daphnia magna..............................115 3.3.2. Ảnh hưởng của cao chiết đến bèo tấm Lemna minor...................................121 3.4. Bước đầu thử nghiệm ảnh hưởng của cao chiết lên sinh trưởng VKL độc trong mẫu nước hồ tự nhiên............................................................................................127 3.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của cao chiết lên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm quy mô phòng thí nghiệm.............................................................................127 3.4.2. Kết quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô 5L tại phòng thí nghiệm .............................................................................................................................. 130 3.4.3. Kêt quả thử nghiệm trên mẫu nước hồ Láng quy mô ngoài trời..................134 3.4.4. Ảnh hưởng của cao chiết đến các thông số môi trường...............................137 KẾT LUẬN..........................................................................................................141 KIẾN NGHỊ.........................................................................................................142 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................142 PHỤ LỤC 1. Quyết định về việc công nhận trúng tuyển nghiên cứu sinh năm 2015 2. Quyết định về việc công nhận tên đề tài và người hướng dẫn 3. Danh mục các bài báo công bố của NCS 4. Danh mục các phổ của các chất sạch được phân lập từ cây Mần tưới DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT KÝ HIỆU 13 C NMR 1 H NMR DO EC50 EtOAc EtOH HMBC HR-ESIMS HSQC IE IR LC50 MeOH OD SEM TEM TN TP TVN VKL W DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Hiệu suất tạo cao chiết tổng trong các dung môi khác nhau...................68 Bảng 3.2. Hiệu suất tạo cao chiết phân đoạn từ cao chiết tổng ethanol Mần tưới .. 68 Bảng 3.3. Hiệu suất tách chiết các chất sạch từ Mần tưới......................................69 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hai chất EfD4.7 và EfD4.8:..................................74 1 Bảng 3.5. Số liệu phổ H NMR ( H và J) của EfD 10.1 và của hợp chất 8,9,10Trihydroxythymol đã được công bố trong tài liệu tham khảo [137] Bảng 3.6. Số liệu phổ 79 13 C NMR của hợp chất axit o- coumaric.............................. 80 1 Bảng 3.7. Số liệu phổ H NMR của hợp chất axit o- coumaric...............................81 1 Bảng 3.8. Số liệu phổ H NMR ( H và J) của EfD 10.3 và của kaempferol đã được công bố 83 1 Bảng 3.9. Giá trị H NMR spectra ( Hvà J) của EfD 14.1 với 8,9-didydroxy -9 axetoxythymol đã được công bố 84 Bảng.3.10. Hiệu qủa ức chế sinh trưởng của cao chiết etanol Mần tưới lên M. aeruginosa và Ch. vulgaris tại nồng độ 200 và 500 µg/mL 93 Bảng 3.11. Hiệu quả ức chế sinh trưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước lên M. aeruginosa và Ch. vulgaris tại nồng độ 200 và 500 µg/mL................................................................................................. 101 Bảng 3.12. Hiệu quả ức chế sinh sinh trưởng của chủng M. aeruginosa dưới ảnh hưởng của CuSO4 5 µg/L và các cao chiết Mần tưới sau 72 giờ.......104 Bảng 3.13. Giá trị LC50 của cao chiết tổng etanol Mần tưới tại 24 và 48 giờ.......117 Bảng 3.14. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết tổng etanol Mần tưới tại 0 và sau 48h.................................................................................. 119 Bảng 3.15. Giá trị DO và pH của mẫu phơi nhiễm cao chiết etyl axetat Mần tưới tại 0 và sau 48h....................................................................................... 119 Bảng.3.16A. Biến động thông số thủy lý mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới....137 Bảng.3.16B. Biến động của thông số thủy hóa mẫu nước Hồ Hoàn Kiếm quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới....137 Bảng.3.17.A Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới 138 Bảng.3.17 B. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 5L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol và etyl axetat Mần tưới 138 Bảng.3.18.A. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol Mần tưới 139 Bảng.3.18B. Biến động của thông số thủy lý mẫu nước Hồ Láng quy mô 300L bổ sung hoạt chất CuSO4 và cao chiết etanol Mần tưới 139 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của phân tử microcystin [7]...................................... 5 Hình.1.2. Bùng phát tảo nở hoa trên thế giới: A. Hồ Taihu, Trung Quốc. B. Hồ Atitlan, Guatamala. C. Lake Erie, Mỹ - Canada. D. Ichetucknee Springs, Florida, Mỹ. E and F. Hồ Taihu, Trung Quốc. G. Hồ Zaca, California, Mỹ. H. and I. Sông St. Johns, Florida. Hồ J. Liberty, Washington, Mỹ. K. Kênh Haarlem, Netherlands, L. Lagoon gần sông St. Lucie Florida. [21]9 Hình 1.3. Một số hồ tiêu biểu ở Việt Nam bùng phát tảo nở hoa [1, 29]...........11 Hình 2.1. Cây Mần tưới (Eupatorium fortunei) [115]........................................ 47 Hình 2.2. Tập đoàn M. aeruginosa chụp dưới kính hiển vi điện tử Microscope BX51 48 Hinh 2.3. Các tế bào M. aeruginosa được phân lập trong phòng thí nghiệm chụp dưới kính hiển vi điện tử Microscope BX51 48 Hình 2.4. C. vulgaris sử dụng trong phòng thí nghiệm.....................................48 Hình 2.5. Lemna minor...................................................................................... 49 Hình 2.6. Daphnia magna.................................................................................. 49 Hình 2.7. Hồ Hoàn Kiếm................................................................................... 50 Hình 2.8. Hồ Láng............................................................................................. 50 Hình 2.9. Thành phần loài Microcystis trong hồ Hoàn Kiếm (a-e). dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 200 lần); (f). dưới kính hiển vi huỳnh quang (độ phóng đại 1000 lần); a. Microcystis botrys; b. Microcystis wessenbergii; c. Microcystis flos-aquae; d. Microcystis viridis; e và f. Microcystis aeruginosa. [134] Hình 2.10. 18 Các loài Microcystis ở hồ Láng (A-F). A - Microcystis aeruginosa Kützing, B - Microcystis flos-aquae (Wittrock) Kirchner, C Microcystis novacekii (Komárek) Compère, D - Microcystis smithii Komárek & Anagnostidis, E - Microcystis viridis (Braun) Lemmermann, F - Microcystis wesenbergii (Komárek) Komárek ex Komárek 19 Hình 2.11. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật tươi.............................. 55 Hình 2.11. Chiết phân đoạn hexan từ cao tổng.................................................... 56 Hình 2.12. Chiết phân đoạn ethyl-axetat từ cao tổng........................................... 56 Hình 2.13. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng....57 Hình 2.14. Quy trình tạo cao chiết tổng từ mẫu thực vật trong quy mô phòng....58 Hình 2.15. Quy trình phân lập các hợp chất sạch từ cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới Hình 2.16. Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các cao chiết từ cây Mần tưới lên sinh trưởng M.aeruginosa và Chlorella vulgaris Hình 2.17. 60 62 Thực nghiệm đánh giá hoạt tính diệt VKL độc của các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới 64 Hình 2.18. Thực nghiệm đánh giá độc tố của cao chiết Mần tưới lên giáp xác D. magna 64 Hình 2.19. Thực nghiệm nghiên cứu mẫu bèo Lemna minor dưới ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới 65 Hình 2.20. Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu nước hồ tự nhiên quy mô phòng thí nghiệm Hình 2.21. 67 Thực nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới lên mẫu nước hồ tự nhiên quy mô ngoài trời 67 Hình 3.1. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD4.7.....69 Hình 3.2. Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.7...................................................... 70 Hình 3.3. Phổ H NMR của chất EfD4.7........................................................... 70 Hình 3.4. Hình 3.5. Phổ C NMR của chất EfD4.7.......................................................... 71 Phổ HSQC của chất EfD4.7............................................................... 72 Hình 3.6. Phổ HMBC của chất EfD4.7.............................................................. 73 Hình 3.7. Cấu trúc hoá học và các tương tác HMBC chính của chất EfD 4.8....75 Hình.3.8. Phổ HR-ESI-MS của chất EfD4.8...................................................... 75 Hình.3.9. Phổ H NMR của chất EfD4.8........................................................... 76 Hình 3.10. Hình 3.11. Phổ C NMR của chất EfD4.8.......................................................... 76 Phổ HSQC của chất EfD4.8............................................................... 77 1 13 1 13 Hình 3.12. Phổ HMBC của chất EfD4.8.............................................................. 78 Hình 3.13. Cấu trúc hợp chất EfD5.1................................................................... 79 Hình 3.14. Cấu trúc hợp chất EfD1.8................................................................... 80 Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất EfD10.1................................................................. 81 Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất EfD10.3................................................................. 82 Hình 3.17. Cấu trúc hợp chất EfD14.1................................................................. 83 Hình 3.18. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M. aeruginosa TC3 tính theo mật độ quang (tại bước sóng 680 nm)..................................................................................... 87 Hình 3.19. Ảnh hưởng của cao chiết Mần tưới nồng độ 200 (A) và 500 µg/mL (B) lên sinh trưởng của M. aeruginosa TC3 tính theo hàm lượng chlorophyll a...................................................................................... 88 Hinh 3.20. Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần tướitính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorop hyll a (B) và mật độ tế bào (C)...................................................................................... 91 Hinh 3.21. Sinh trưởng của C. vulgaris dưới tác dụng của cao chiết tổng etanol Mần tưới tính theo mật độ quang (A), hàm lượng chlorophyll a (B) và mật độ tế bào (C)........................................................................................... 93 Hình 3.22. Sinh trưởng của M. aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang 95 Hình 3.23. Sinh trưởng của M.aeruginosa TC3 dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo hàm lượng chlorophyll a............................................................................ 96 Hình 3.24. Sinh trưởng của M.aeruginosa dưới tác dụng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) theo mật độ tế bào .. 97 Hình 3.25. Sinh trưởng của C.vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ quang. 98 Hình 3.26. Sinh trưởng của C.vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) Mần tưới theo hàm lượng chlorophyll a 99 Hình 3.27. Sinh trưởng của C. vulgaris dưới ảnh hưởng của cao chiết phân đoạn etyl axetat (A) và cao chiết phân đoạn nước (B) tính theo mật độ tế bào................................................................................................... 100 Hình 3.28. Sinh trưởng của chủng M. aeruginosa trong vòng 72 giờ tác dụng của các cao chiết Mần tưới Tính theo mật độ quang 98 Hình 3.29. Sinh trưởng của chủng M.aeruginosa dưới tác dụng của các chất sạch sau 72 giờ tính theo mật độ quang bước sóng 680 nm (A) và theo mật độ tế bào (B).................................................................................... 106 Hình 3.30. Cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M.aeruginosa TC3 (A) và C.vulgaris (B) dưới kính hiển vi điện tử truyền qua.......................................... 110 Hình 3.31. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào M. aeruginosa TC3 dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B- cao chiết phân đoạn etyl axetat, C- cao chiết phân đoạn nước,................................................................................................ 111 Hình 3.32. Ảnh hưởng của cao chiết lên cấu trúc siêu hiển vi của tế bào C.vulgaris dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (A- cao chiết etanol, B- cao chiết ethyl axetat, C- cao chiết nước, 3- sau 3 ngày, 6-sau 6 ngày, 10- sau 10 ngày)..................................................................... 113 Hình 3.33. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ (A) và 48 giờ (B) phơi nhiễm với cao chiết tổng etanol Mần tưới........................................ 116 Hình 3.34. Tỷ lệ cá thể sống/chết của D.magna sau 24 giờ và 48 giờ phơi nhiễm với cao chiết etyl axetat Mần tưới.................................................... 116 Hình 3.35. Ảnh hưởng của cao chiết tổng etanol (A) và phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) lên tổng số cánh bèo L.minor.....................................122 Hình 3.36. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao chiết tổng ethanol Mần tưới............................................................. 123 Hình 3.37. Hình thái ngoài của cánh bèo L.minor sau 5 ngày phơi nhiễm cao chiết tổng phân đoạn etyl axetat Mần tưới....................................... 123 Hình 3.38. Sinh khối tươi của bèo L.minor dưới tác động của cao chiết etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 5 ngày (T5)........................................................................... 124 Hình 3.39. Hàm lượng sắc tố quang hợp của bèo L.minor dưới tác động của cao chiết etanol (A) và cao chiết phân đoạn etyl axetat Mần tưới (B) tại thời điểm bắt đầu (T0) và sau 5 ngày (T5).............................................. 125 Hình 3.40. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của mẫu đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong mẫu nước hồ Hoàn Kiếm................................................................................................ 127 Hình 3.41. Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước hồ Hoàn Kiếm ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới.......................................................................................... 128 Hình 3.42. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của mẫu đối chứng, mẫu CuSO4 và mẫu bổ sung cao chiết trong nước Hồ Láng................................................................................................. 130 Hình 3.43. Biến động mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước Hồ Láng ngày T0 (A) và T10 (B) dưới ảnh hưởng của các cao chiết Mần tưới.......................................................................................... 131 Hình 3.44. Sự biến đổi sinh khối thực vật nổi (theo hàm lượng chlorophyll a) của mẫu etanol Mần tưới trong nước Hồ Hoàn Láng quy mô ngoài trời 135 Hình 3.45. Mật độ tế bào thực vật phù du nghiên cứu trên mẫu nước Hồ Láng quy mô ngoài trời ngày T0 (A) và ngày T10 (B).................................... 136 1 MỞ ĐẦU Ô nhiễm môi trường không khí, nước và đất đã trở thành vấn đề hàng đầu, gióng hồi chuông cảnh báo về sự suy giảm chất lượng cuộc sống và sức khỏe con người không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nơi trên thế giới. Ô nhiễm nguồn nước mặt là đặc biệt nghiêm trọng khi nhiều nơi trên thế giới người dân không có nước sạch để sử dụng cho ăn uống và sinh hoạt kéo theo tỉ lệ tử vong và bệnh tật gia tăng vì sử dụng nguồn nước không đạt yêu cầu. Nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến ô nhiễm nguồn nước mặt như xả trực tiếp các nguồn nước thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt mà không qua xử lý hoặc lạm dụng quá mức phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp để nâng cao sản lượng lương thực đáp ứng sự gia tăng dân số thế giới trong những thập kỉ gần đây. Hậu quả dẫn đến gia tăng nguồn dinh dưỡng (chủ yếu là nitơ và photpho) trong các thủy vực gây nên hiện tượng phú dưỡng mà kéo theo là “tảo nở hoa” hoặc “nở hoa của nước”. Sự nở hoa của nước bản chất là sự phát triển ồ ạt của Vi khuẩn lam (VKL) và vi tảo, có khả năng sản sinh độc tố kéo theo sự nhiễm độc và cái chết của thủy hải sản, động vật nuôi, động vật hoang dã và con người [1]. Sự nở hoa của nước thường gây ra những tác động xấu lên môi trường như làm đục nước, tăng giá trị pH, giảm hàm lượng oxy hòa tan, tăng độc tố đặc biệt là độc tố microcystin. Kết quả điều tra ở các thủy vực nước ngọt cho thấy trong các loài VKL độc gây hiện tượng nở hoa nước thì Microcystis aeruginosa chiếm đến 90% và sản sinh ba loại độc tố nguy hiểm là độc tố gan (hepatotoxins), độc tố thần kinh (neurotoxins) và độc tố gây dị ứng da. Điều nghiêm trọng là tần suất xuất hiện các loài VKL độc ngày càng tăng làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và động vật nuôi, động vật hoang dã do sử dụng nguồn nước có VKL độc. Do đó ngăn ngừa và giảm thiểu sự phát triển bùng nổ của VKL độc là vấn đề quan trọng cần phải được quan tâm. Các phương pháp xử lý ô nhiễm môi trường nước gây ra bởi VKL độc đã được nghiên cứu và áp dụng từ những phương pháp cơ học đơn giản như hớt váng, che sáng hay pha loãng nước hồ đến các phương pháp lý - hóa như dùng sóng siêu âm, sử dụng ánh sáng cực tím, hoặc sử dụng các hợp chất hóa học diệt tảo, các hợp chất 2 có tính oxi hóa cao, các kim loại và nano kim loại. Những phương pháp này bên cạnh những ưu điểm dễ thấy như hiệu quả tác động nhanh, rõ rệt trong thời gian ngắn nhưng còn tồn tại những hạn chế như tốn kém kinh phí triển khai hoặc gây ra sự ô nhiễm môi trường thứ cấp, tác động không chọn lọc lên các loài sinh vật do đó gây suy giảm đa dạng sinh học đặc biệt sử dụng hóa chất sau một thời gian quan sát thấy hiện tượng nhờn thuốc và vì thế chúng bị hạn chế triển khai ở quy mô thực tế. Do đó phương pháp sinh học dùng các cao chiết có nguồn gốc thực vật để ức chế sinh trưởng VKL đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu vì tính hiệu quả và thân thiện với môi trường. Cây Mần tưới Eupatorium fortunei Turcz., thuộc họ Cúc (Asteraceae) là loài cây cỏ lâu năm, được sử dụng trong dân gian như một loại thuốc chữa bệnh và được chứng minh hoạt tính kháng khuẩn trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Năm 2013, Nguyễn Tiến Đạt và cộng sự đã tiến hành khảo sát và so sánh hoạt tính diệt VKL độc M. aeruginosa của nhiều loại cao chiết từ các loài thực vật khác nhau tại Việt Nam cho thấy cao chiết cây Mần tưới có hiệu quả nhất để kiểm soát bùng nổ VKL độc [2]. Kết luận này được khẳng định bởi các công bố của Phạm Thanh Nga trong những năm tiếp theo [3]. Tuy nhiên đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu khảo sát hoạt tính diệt VKL độc của cao chiết cây Mần tưới. Từ những lý do trên đề tài luận án tiến sỹ : “Nghiên cứu tác dụng ức chế của cao chiết cây Mần tưới (Eupatorium fortunei Turcz.) lên sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa Kutzing trong các thủy vực nước ngọt” đã được lựa chọn để thực hiện. Luận án đã đặt ra mục tiêu như sau: Tạo được cao chiết thực vật ức chế hiệu quả sinh trưởng của Vi khuẩn lam độc Microcystis aeruginosa. Luận án có tính chất kế thừa kết quả của những nghiên cứu trước và sẽ giải quyết nhiều vấn đề còn tồn tại. Luận án đã đặt ra những nội dung như sau: 1. Xây dựng quy trình tạo cao chiết tổng, cao chiết phân đoạn, các chất sạch phân lập từ cây Mần tưới. 2. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết tổng Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái. 3 3. Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng ức chế của cao chiết phân đoạn etyl axetat và cao chiết phân đoạn nước Mần tưới lên sinh trưởng của M. aeruginosa và đánh giá an toàn sinh thái. 4. Nghiên cứu phân lập và đánh giá hoạt tính diệt VKL độc M.aeruginosa của 07 hợp chất hóa học được phân lập từ cây Mần tưới. 5. Nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng cao chiết để kiểm soát bùng nổ Vi khuẩn lam trong các mẫu nước hồ tự nhiên. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án Ô nhiễm môi trường nước, đặc biệt hiện tượng phú dưỡng kéo theo sự bùng phát sinh khối VKL với việc giải phóng độc tố microcystin đã nhận được nhiều sự quan tâm, nghiên cứu trong thời gian gần đây. Sử dụng cao chiết từ thực vật để kiểm soát bùng nổ sinh khối VKL thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội so với các phương pháp truyền thống được áp dụng trước đây. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở khoa học, chứng minh tính ưu việt khi áp dụng cao chiết thực vật như một hoạt chất ức chế và diệt chọn lọc VKL độc để kiểm soát bùng phát sinh khối VKL độc. Tính mới của luận án - Tách chiết được 02 chất mới (7,8,9 - trihydroxythymol và 8,10-didehydro7,9-trihydroxythymol) và đánh giá tác động của 02 chất này lên M. aeruginosa trong dải nồng độ từ 1,0 µg/mL đến 50,0 µg/mL với hiệu quả ức chế sinh trưởng ghi nhận từ 39,1÷41,2 % và 20,0 – 25,0 %, tương ứng sau 72 giờ. - Bước đầu ghi nhận khả năng ức chế sinh trưởng M. aeruginosa ≥ 90 % tại nồng độ 500 µg/mL ở quy mô phòng thí nghiệm và hiệu quả trên 60 % ở quy mô ngoài trời với mẫu nước hồ tự nhiên. Độc tính của cao chiết tổng etanol Mần tưới đối với Daphnia magna và Lemna minor ghi nhận là thấp hơn so với M. aeruginosa. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4 1.1. Vi khuẩn lam độc và hiện tượng phú dưỡng trong các thủy vực nước ngọt 1.1.1. Vi khuẩn lam độc (VKL) Vi khuẩn lam (Cyanobacteria, Cyanoprokaryota, Cyanophyta, Blue-green microalgae) là một trong những sinh vật xuất hiện trên Trái Đất cách đây hàng tỷ năm và mang nhiều tên gọi khác nhau trong quá trình nghiên cứu. Từ năm 1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh. Theo những đặc điểm hình thái khác nhau, VKL được chia làm 4 bộ, Chlorococcales, Oscillatoriales, Nostocales và Stigonematales. Theo các tài liệu công bố, hiện nay có khoảng 100 loài VKL độc nước ngọt thuộc 40 chi trong đó Microcystis đặc biệt là Microcystis aeruginosa, một trong những chi thường gặp nhất phổ biến nhất với tỉ lệ trên 75 % [1, 4]. Microcystis aeruginosa có dạng tập đoàn, dạng hình cầu hoặc mắt lưới với các khoảng trống giữa các tế bào, tế bào phân bố trong tập đoàn có dạng hình cầu, màu xanh nhạt, xếp chồng lên nhau. Cấu trúc cơ thể, hình dạng và kích thước: Trong phân loại hiện đại, VKL và vi khuẩn có nhiều những nét chung như sinh vật chưa có nhân điển hình, chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể. Màng tế bào cấu tạo từ murein một loại gluco aminopeptid trong tế bào chất có nhiều riboxom, có khả năng đồng hóa được N 2 tự do và có khả năng quang hợp. Tế bào chứa sắc tố quang hợp và hấp thụ bước sóng từ 430-440 nm và từ 660-680 nm [5]. Ngược lại với vi tảo nhân thật, VKL không có màng nhân mà chỉ có lớp màng peptidoglycan và chứa ribosom loại 70 S [1]. Chi Microcystis thường tồn tại dưới dạng tập đoàn gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ có kích thước từ 3-10 µm dao động phụ thuộc vào từng loài. Dinh dưỡng và sinh sản: Phần lớn VKL là những cơ thể quang tự dưỡng hiếu khí. VKL có khả năng dự trữ các chất dinh dưỡng thiết yếu và đồng hóa bên trong tế bào chất, có thể quan sát dưới kính hiển vi các hạt glycogen, giọt lipip, các hạt cyanophycin, các thể polyphosphate hay carboxysome. VKL chỉ sinh sản vô tính. Các loài dạng sợi thường sinh sản bằng cách phân đoạn các trichome hoặc hình thành các đoạn tảo (hormogonia). Đoạn tảo là những đoạn sợi sinh sản phân biệt. Chúng được tạo thành nhờ chuyển động trượt và dần dần phát triển thành những trichome mới, các loài dạng sợi thường sinh sản bằng cách phân đoạn. 5 Phân bố VKL: Sự phân bố của VKL phụ thuộc vào nhiều yếu tố thủy văn và khí hậu của từng vùng đặc biệt là điều kiện dinh dưỡng của môi trường sống. Đa số các loài VKL trong tế bào đều chứa không bào khí. Đó là các thể nội bào dạng túi chứa khí giúp điều khiển sự nổi của tế bào giúp cho chúng có ưu thế trong cạnh tranh ánh sáng và dinh dưỡng. VKL phân bố rộng, chúng có trong nước, đất, ở các nơi khô hạn, trên cây, băng tuyết. Độc tố VKL: Neurotoxin là nhóm các chất độc thần kinh, hợp chất độc hại nhất do VKL sản sinh ra và chúng can thiệp vào hệ thần kinh, gây tê liệt các cơ quan hô hấp, gây tử vong chỉ sau vài phút tác động. Độc tố LD 50-24 h (Lethal dose, 50%) của các nhóm là khác nhau nhưng nhìn chung là rất độc dao động từ 10 đến 200 μg/kg, độc nhất phải kể đến Saxitoxin với LD 50-24 h là 10 μg/kg, LD50 của nhóm Microcystin-LR là 50 μg/kg [6]. Microcystin là phân tử peptit có cấu trúc vòng, hiện nay ghi nhận hơn 80 loại biến thể cấu trúc, trong đó ba loại phổ biến nhất được trình bày tại hình 1.1 [7]. Microcystin có thể được tạo ra từ các loài thuộc chi Microcystis, Anabaena, Nostoc, Oscillatoria và Hapalosphon. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của phân tử microcystin [7] VKL và độc tố của nó ảnh hưởng đến tất cả các loài trong hệ sinh thái bao gồm vi khuẩn, tảo, động thực vật phù du, nhóm động vật không xương sống ở nước đặc biệt nhóm loài Daphnia bao gồm gây độc cấp tính (trong vòng 48h) và mãn tính (sau 21 ngày). Tại nồng độ thấp microcystin hòa tan trong nước không gây ảnh hưởng độc 6 hại đến D. magna nhưng phơi nhiễm lâu hơn tại nồng độ cao có thể dẫn đến chết vì microcystin đã được tích tụ trong D. magna ức chế sự hoạt động của enzyme photphatase [8, 9]. Độc tố VKL còn ảnh hưởng tới các loài cá như Misguruns mizolepis, Leuciscus cephalus, Danio rerio, Oryzias latipes, Oncorhynchus mykiss. Nồng độ gây độc dao động từ 0,5 đến 50 μg MC-LR làm giảm 50% khả năng sống sót, 25% khối lượng, gây tử vong bất thường, quái thai ở cá con, giảm khả năng nở của trứng [10]. Đối với con người, gan là bộ phận bị ảnh hưởng nặng nề nhất, sau đó đến thận và đại tràng, thời gian tích tụ lâu dài có thể dẫn đến ung thư gan và ung thư trực tràng [11]. Khả năng gây hại cho người đối với nguồn nước phục vụ các hoạt động giải trí từ 20.000 tế bào VKL/mL (tức hơn 10 µg/L nồng độ chlorophyll a). Khi tăng mật độ lên đến 20.000 – 50.000 tế bào/mL (10 - 50 µg/L nồng độ chlorophyll a) VKL tác động rõ rệt và trên 100.000 tế bào/mL gây nguy hiểm cho con người, động vật nuôi và động vật hoang dã [6]. 1.1.2. Hiện tượng phú dưỡng và phát triển bùng nổ sinh khối VKL độc 1.1.2.1. Hiện tượng phú dưỡng Hiện tượng phú dưỡng (Eutrophication) là một thuật ngữ sinh thái được sử dụng cho quá trình làm giàu nước bởi các chất dinh dưỡng, đặc biệt là nitơ và photpho dẫn đến sự phát triển bùng nổ các loại VKL và vi tảo [12, 13]. Năm 1931, Naumann lần đầu tiên đưa ra phân loại các hồ theo các cấp độ dinh dưỡng khác nhau như nhóm nghèo dinh dưỡng (oligotrophic), dinh dưỡng trung bình (mesotrophic), phú dưỡng (eutrophic) và phì dưỡng (hypertrophic) [1]. Hakanson đã giới thiệu hệ thống phân loại các mức độ dinh dưỡng khác nhau dựa trên các chỉ tiêu như độ trong, hàm lượng chlorophyll a, nitơ tổng, photpho tổng và VKL trong các môi trường nước ngọt (độ muối: từ 0 đến 5% o), nước lợ (độ muối từ 5 đến 20 %o) và nước mặn (độ muối: > 20 % o) thành các nhóm nghèo dinh dưỡng, nhóm trung dưỡng, nhóm phú dưỡng và nhóm phì dưỡng [13, 14]. Nguyên nhân ban đầu của hiện tượng phú dưỡng được xác định là do mất cân bằng nguồn dinh dưỡng đầu vào, chủ yếu là các nguồn nước thải chưa qua xử lý của hệ sinh thái, từ đó tạo ra ưu thế cạnh tranh của một số loài. Bên cạnh yếu tố dinh dưỡng, hiện tượng phú dưỡng trong môi trường nước cũng chịu ảnh hưởng mạnh mẽ