Tài liệu Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus Mutans

MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan 4 1.1.1. Bệnh sâu răng 4 1.1.2. Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam 4 1.1.3. Cơ chế gây bệnh sâu răng 6 1.1.4. Mảng bám răng và sự hình thành mảng bám răng 8 1.2. Vi khuẩn Streptococcus mutans và khả năng gây sâu răng 9 1.2.1. Một số đặc trưng hình thái và phân loại của Streptococcus mutans 10 1.2.2. Một số đặc trưng sinh lý sinh hoá của S. mutans 12 1.2.3. Cơ sở phân tử của đáp ứng stress ở vi khuẩn S. mutans 14 1.2.3.1 Đáp ứng stress axit ở vi khuẩn S. mutans 15 1.2.3.2 Đáp ứng stress oxy hóa ở vi khuẩn S. mutans 19 1.2.4. Các đặc trưng trong hệ gen của S. mutans đối với việc phân lập và 20 nhận dạng 1.3. Các biện pháp chống sâu răng 22 1.3.1 Sử dụng chất kháng khuẩn 22 1.3.2. Sử dụng các chất tổng hợp 25 1.3.3. Sử dụng các hợp chất tự nhiên 26 1.3.4. Sử dụng các biện pháp khác 28 1.3.4.1. Liệu pháp thay thế 28 1.3.4.2. Vaccine phòng chống sâu răng 28 1.3.5. Tình trạng nhiễm fluo trên răng 28 1.4. Các chất thứ cấp từ thực vật 29 1.4.1. Phân loại, cấu tạo hoá học và tính chất của chất thứ cấp từ thực vật 29 1.4.1.1. Nhóm các hợp chất terpene 30 1.4.1.2. Nhóm các hợp chất phenolic 30 1.4.1.3. Nhóm hợp chất chứa nitơ 33 1.4.2 34 Hoạt tính sinh học của các hợp chất thứ cấp từ thực vật 1.4.2.1. Tác dụng chống oxy hoá của các hợp chất thứ cấp từ thực vật 34 1.4.2.2. Tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn của các hợp chất thứ cấp từ thực vật 36 1.4.2.3. 38 Một số tác dụng khác của các chất thứ cấp từ thực vật CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1. Nguyên liệu 40 2.1.1. Chủng vi sinh vật 40 2.1.2. Mẫu thực vật 40 2.1.3. Hoá chất 40 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm 41 2.2. Phương pháp nghiên cứu 41 2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn và bảo quản tế bào vi khuẩn 41 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn gây sâu răng S. 41 mutans từ các bệnh phẩm mắc bệnh sâu răng 2.2.2.1. Phân lập trên môi trường Mitis salivarius 42 2.2.2.2. Phân lập trên môi trường TSA pH 5,0 42 2.2.3. 43 Phương pháp nhận dạng Streptococcus mutans phân lập từ người Việt Nam 2.2.3.1. Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn 43 2.2.3.2. Phương pháp nhuộm Gram cải tiến 43 2.2.3.3. Kiểm tra hoạt tính catalase 43 2.2.3.4. Kiểm tra các đặc tính hoá sinh (kit Api 20 Strep) 43 2.2.3.5 44 Phương pháp PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S và kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn giới hạn 2.2.3.6. Phương pháp PCR mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen mã hóa cho 45 dextranase của Streptococcus mutans 2.2.3.7. Phương pháp đọc trình tự đoạn gen mã hóa ARNr 16S 45 2.2.4. Phương pháp nuôi cấy biofilm 46 2.2.5. Phương pháp xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn 46 2.2.6. Phương pháp xác định mức độ gây chết tế bào 46 2.2.7. Phương pháp xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn 47 2.2.8. Phương pháp đo mức độ tiêu thụ oxy của tế bào 47 2.2.9. Xác định hoạt độ một số enzyme quan trọng của S. mutans 47 2.2.9.1. Chuẩn bị tế bào thấm 48 2.2.9.2. Phân tích hoạt độ ATPase 48 2.2.9.3. Phân tích hoạt độ phosphotransferase (PTS) 49 2.2.9.4. Phân tích hoạt độ NADH oxidase 49 2.2.9.5. Phân tích hoạt độ lactate dehydrogenase 50 2.2.9.6. Phân tích hoạt độ pyruvate kinase 50 2.2.10. 51 Phương pháp nghiên cứu định tính thành phần một số hợp chất thực vật thứ sinh trong dịch chiết thực vật 2.2.11. Phương pháp phân tách các hợp chất bằng sắc ký 52 2.2.12. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 53 2.2.13. Phương pháp xử lý số liệu 53 Ch­¬ng 3. KÕt qu¶ nghiªn cøu 54 3.1. Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn sâu răng 54 3.1.1. Khả năng ức chế sự sinh axit của một số dịch chiết thực vật 54 3.1.2. Khả năng diệt S. mutans GS-5 bởi dịch chiết một số thực vật 58 3.1.2.1. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 ở pH 4 58 3.1.2.2. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 ở pH 7 59 3.1.3. 60 Khả năng ức chế sự hình thành bioflim của S. mutans GS-5 bởi các dịch chiết thực vật 3.1.4. Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với fluo 62 3.1.5. Tác dụng của dịch chiết một số thực vật phối hợp với H2O2 64 3.1.6. Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên một số vi khuẩn đường miệng 65 3.2. Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp 67 có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ vỏ cây Sao đen 3.2.1. Tìm hiểu nhóm chất thứ cấp có trong vỏ cây Sao đen 67 3.2.2. Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ vỏ cây Sao đen 68 3.2.3. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của hopea phenol và 72 malibatiol A từ vỏ Sao đen 3.2.3.1. Tác dụng của hopea phenol và malibatiol A lên sự sinh axit của S. mutans 72 3.2.3.2. Tác dụng giết tế bào S. mutans GS-5 của hopea phenol và malibatol A 73 3.2.3.3. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ ATPase 74 3.2.3.4. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ 74 phosphotransferase của S. mutans GS-5 3.2.3.5. Tác dụng của hopea phenol, malibatol A lên hoạt độ lactate dehydrogenase 75 3.2.3.6. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ pyruvate kinase 76 3.2.3.7. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ NADH oxidase 77 3.3. Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn sâu răng từ lá cây Sắn thuyền 77 3.3.1. Tìm hiểu các nhóm chất thứ cấp có trong lá Sắn thuyền 78 3.3.2. Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ lá cây Sắn thuyền 79 3.3.3. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của axit asatic 83 3.3.3.1. Tác dụng của axit asiatic lên sự sinh axit của S. mutans GS-5 83 3.3.3.2. Tác dụng của axit asiatic lên sự diệt S. mutans GS-5 83 3.3.3.3. Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5 84 3.3.3.4. ảnh hưởng của axit asiatic lên hoạt độ phosphotransferase của S. mutans GS-5 84 3.3.3.5. Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ lactate dehydrogenase của S. 85 mutans GS-5 3.3.3.6. Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ pyruvate kinase của S. mutans GS-5 85 3.3.3.7. Tác dụng của axit asiatic lên NADH oxidase của S. mutans GS-5 86 3.4. Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người Việt Nam 87 3.4.1. Phân lập S. mutans trên môi trường Mitis Salivarius và môi trường TSA pH 5 87 3.4.2. Xác định một số đặc điểm hình thái, sinh lý, hoá sinh của tế bào vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam 89 3.4.2.1. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn và kiểm tra hoạt tính catalase 89 3.4.2.2. Nhận dạng sơ bộ Streptococcus mutans bằng kit API 20 Strep 91 3.4.3. 93 Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus bằng kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) và PCR 3.4.3.1. Tách ADN tổng số 93 3.4.3.2. Nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật RFLP đoạn gen mã hoá cho ARNr 16S 93 3.4.3.3. Nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen dextranse của Streptococcus mutans 95 3.4.4. Một số đặc điểm sinh lý của 3 chủng vi khuẩn Streptococcus mutans H1, H2 và H3 96 3.4.4.1. Khả năng sinh axit của S. mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans H3 96 3.4.4.2. Khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam 97 3.4.4.3 Giải trình tự gen mã hóa ARNr 16S của S. mutans H2 phân lập từ 98 người Việt Nam 3.4.5. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên S. mutans H2 phân lập từ người Việt Nam 100 3.4.5.1. Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên khả năng sinh 100 axit của S. mutans H2 3.4.5.2. Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền với việc diệt các tế bào S. mutans H2 100 3.4.5.3. Nghiên cứu tác dụng của axit asiatic, hopea phenol và malibatol A 101 lên hoạt độ một số enzyme của S. mutans H2 THẢO LUẬN 104 KẾT LUẬN 113 ĐỀ NGHỊ 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC 137 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate CTI Chàm tía (Strobilanthes cusia Bremek.) DMFT Chỉ số răng sâu, răng mất hay trám răng do sâu răng (Decayed Missing Filled Teeth) HNT Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L.) IC50 Nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzyme (Inhibitory concentration) KNG Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) kDA Kilo dalton Kb Kilo base LDH Lactate dehydrogenase MS Phổ khối (Mass spectrophotometry) NAD+ Nicotinamide adenine dinucleotide NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) NOX NADH oxidase NPK NADH peroxidase PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase chain reaction) PEP Phosphoenolpyruvate PTS Hệ thống enzyme chuyển phosphate (Phosphotransferase system) QCT Quỷ châm thảo (Bidens pilosa L.) ROS Dạng oxy hoạt động (Reactive oxygen species) RFLP Đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) SDA Sài đất (Verbesina calendulaceae L.) SDE Sao đen (Hopea odorata Roxb.) SOD Superoxide dismutase STH Sắn thuyền (Syzygium resinosum Gagnep.) TSA Môi trường thạch đậu tương phân giải (Tryptic Soy Agar) TY Tryptone cao nấm men (Tryptone yeast extract) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các loài thuộc nhóm mutans streptococcus 11 Bảng 3.1. Danh mục các mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu 54 Bảng 3.2. Tác dụng của một số dịch chiết thực vật bằng H2O và ethanol 56 lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans GS-5 Bảng 3.3. Tác dụng của dịch chiết lên sự hình thành biofilm ở S. mutans GS-5 61 Bảng 3.4. Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với NaF lên sự 63 sinh axit của S. mutans GS-5 Bảng 3.5. Tác dụng của dịch chiết các mẫu thực vật phối hợp với H2O2 lên sự sinh axit của S. mutans GS-5 64 Bảng 3.6. Thành phần một số hợp chất trong vỏ Sao đen chiết bằng các 67 dung môi Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của hợp chất SDE1 và SDE 2 tách từ vỏ Sao đen 71 Bảng 3.8. Thành phần hóa học dịch chiết lá Sắn thuyền trong các dung 78 môi Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) của hợp chất ST3A từ cây Sắn thuyền 81 Bảng 3.10. Một số đặc tính sinh lý, hoá sinh của các chủng Streptococcus phân lập từ bệnh phẩm sâu răng người Việt Nam 91 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Cấu tạo của răng 7 Hình 1.2. Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan 7 Hình 1.3. Vi khuẩn Streptococcus mutans 11 Hình 1.4. Mối quan hệ giữa chất trao đổi bậc nhất và các chất thứ cấp từ thực vật 32 Hình 3.1. Tác dụng của ethanol lên sự sinh axit của S. mutans GS-5 55 Hình 3.2. ảnh hưởng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên sự sinh axit của S. mutans GS-5 57 Hình 3.3. Tác dụng không thuận nghịch của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên khả năng sinh axit của S. mutans GS-5 57 Hình 3.4. ảnh hưởng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên sự tiêu thụ 58 oxy của S. mutans GS-5 Hình 3.5. Khả năng diệt S. mutans GS-5 từ các dịch chiết thực vật tại pH 4 59 Hình 3.6. Khả năng diệt S. mutans GS-5 từ các dịch chiết thực vật tại pH 60 7 Hình 3.7. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của S. mutans GS-5 từ dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền 61 Hình 3.8. Tác dụng của các dịch chiết lên sự sinh axit của S. mutans GS-5 trên biofilm 62 Hình 3.9. Khả năng diệt S. mutans GS-5 của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền khi phối hợp với NaF tại pH 4 64 Hình 3.10. Khả năng diệt S. mutans GS-5 của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền khi phối hợp với H2O2 tại pH 4 65 Hình 3.11. Tác dụng diệt một số vi khuẩn đường miệng của dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen 66 Hình 3.12. Các bước tách hopea phenol và malibatol A từ vỏ Sao đen 70 Hình 3.13. Cấu trúc hoá học của hopea phenol và malibatiol A 71 Hình 3.14. Một số tương tác H-C chủ yếu của hopea phenol 72 Hình 3.15. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên sự sinh axit của 73 S. mutans GS-5 Hình 3.16. Khả năng diệt S. mutans GS-5 tại pH 4 và pH 7 của hopea phenol và malibatol A 73 Hình 3.17. ảnh hưởng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5 74 Hình 3.18. Ảnh h­ëng cña opea phenol vµ malibatol A lªn ho¹t ®é phosphotransferase cña S. mutans GS-5 75 H×nh 3.19. ¶nh h­ëng cña hopea phenol vµ malibatol A lªn ho¹t ®é lactate dehydrogenase cña S. mutans GS-5 75 Hình 3.20. ảnh hưởng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ piruvate kinase của S. mutans GS-5 76 Hình 3.21. ảnh hưởng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ NADH oxidase của S. mutans GS-5 77 Hình 3.22. Các bước tách chiết axit asiatic từ lá Sắn thuyền 80 Hình 3.23. ảnh sắc ký trên bản mỏng mẫu ST3A tách từ Sắn thuyền 81 Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của ST3A tách chiết từ lá Sắn thuyền 81 Hình 3.25. Các tương tác H-C chủ yếu của axit asiatic 82 Hình 3.26. Tác dụng ức chế sự sinh axit của S. mutans GS-5 của axit asiatic 83 Hình 3.27. Tác dụng diệt S. mutans GS-5 của axit asiatic 84 Hình 3.28. ảnh hưởng của axit asiatic hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5 84 Hình 3.29. ảnh hưởng axit asiatic lên hoạt độ phosphotransferase của S. 85 mutans GS-5 Hình 3.30. Ảnh h­ëng cña asiatic axit lªn ho¹t ®é lactate dehydrogenase cña S. mutans GS-5 85 H×nh 3.31. 86 ¶nh h­ëng cña asiatic axit lªn ho¹t ®é pyruvate kinase cña vi khuÈn S. mutans GS-5 Hình 3.32. ảnh hưởng của axit asiatic lên hoạt độ NADH oxidase của S. 86 mutans GS-5 Hình 3.33. Hình thái khuẩn lạc một số chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam trên môi trường Mitis- salivarius 88 Hình 3.34. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA pH 5,0 89 Hình 3.35. ảnh chụp hiển vi điện tử của các chủng vi khuẩn chi Streptococcus 90 Hình 3.36. Điện di kiểm tra trên gel agarose sản phẩm ADN tổng số của 93 các chủng vi khuẩn Streptococcus Hình 3.37. Điện di trên gel agarose các sản phảm nhân bản đoạn gen ARNr 94 16S của các chủng vi khuẩn Streptococcus Hình 3.38. Điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR của đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S sau khi cắt bằng HpaII 95 Hình 3.39. Điện di trên gel agarose các sản phẩm PCR của đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S sau khi cắt bằng HaeIII 95 Hình 3.40. Điện di trên gel agarose sản phẩm nhân bản bằng PCR gen dextranase của S. mutans 96 Hình 3.41. Khả năng sinh axit của các chủng S. mutans từ người Việt Nam 97 Hình 3.42. Khả năng chịu axit của các chủng S. mutans từ người Việt Nam 98 Hình 3.43. Vị trí phân loại của chủng S. mutans H2 99 Hình 3.44. ảnh hưởng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên sự sinh axit của S. mutans H2 100 Hình 3.45. Tác dụng diệt S. mutans H2 phân lập từ người Việt Nam từ dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen ở pH 4 và pH 7 101 Hình 3.46. ảnh hưởng của axit asiatic, hopea phenol và malibatol lên hoạt độ ATPase của S. mutans H2 102 Hình 3.47. ảnh hưởng của axit asiatic, hopea phenol và malibatol lên hoạt độ phosphotransferasecủa S. mutans H2 102 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sâu răng là một trong số các bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Theo số liệu điều tra gần đây của Viện Răng Hàm Mặt Trung Ương, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về răng, miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng [38]. Bệnh sâu răng không chỉ gây ảnh hưởng tới tình trạng sức khoẻ của người bệnh mà còn gây ra nhiều chi phí tốn kém trong chữa trị. Tổ chức Y tế thế giới coi sâu răng là một trong những bệnh nguy hiểm của loài người. Nhiều chương trình nghiên cứu cũng như khuyến cáo nhằm mục đích ngăn ngừa và phòng chống bệnh này đã được WHO thực hiện trong những năm qua. Mặc dù tỷ lệ sâu răng trong cộng đồng dân cư đã giảm đi đáng kể nhưng vẫn còn ở mức cao và đòi hỏi phải có những biện pháp dự phòng tốt hơn nữa để đạt mục tiêu mà Tổ chức Y tế thế giới đưa ra. Cách tốt nhất để hạn chế bệnh sâu răng là vệ sinh răng miệng thường xuyên và đúng cách cùng với việc hạn chế sử dụng các thức ăn, đồ uống có nhiều đường. Tuy vậy, phương pháp vệ sinh răng miệng, thói quen ăn uống không phải lúc nào cũng thực hiện được, do vậy việc sử dụng các chất có khả năng kháng khuẩn như fluo, axit yếu, muối kim loại v.v... là một biện pháp để phòng chống sâu răng. Trong số các chất kháng khuẩn được sử dụng fluo là chất có tiềm năng hơn cả. Tuy nhiên, việc sử dụng fluo lâu dài hay với nồng độ cao có thể làm xuất hiện hiện tượng nhiễm fluo (fluorosis) làm men răng ố vàng và trở nên sần sùi [68, 89]. Chính vì những lý do đó mà xu hướng hiện nay là tìm kiếm các hợp chất mới, có thể thay thế một phần fluo hay kết hợp với fluo nhưng ở nồng độ thấp hơn mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao. Hiện nay, việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có tác dụng bảo vệ răng miệng đang là xu hướng được quan tâm nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn. Việt Nam có hệ thực vật nhiệt đới vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó gồm rất nhiều loài chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Từ ngàn xưa, cộng đồng các dân tộc trên đất nước ta cũng có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ sức khỏe chống lại bệnh tật trong đó có bệnh sâu răng [2, 16, 17]. Tuy 2 nhiên cho đến nay việc tìm kiếm các hợp chất mới cũng chưa mang lại nhiều kết quả như mong muốn. Hơn nữa, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của các hợp chất tự nhiên lên vi khuẩn sâu răng. Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans” của chúng tôi nằm trong xu thế nghiên cứu chung của thế giới và Việt Nam. Việc tiến hành đề tài này là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các bệnh về răng đặc biệt là bệnh sâu răng. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là điều tra tác dụng chống sâu răng của dịch chiết một số loài thực vật ở Việt Nam thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của chúng lên các quá trình sinh lý, hoá sinh, một số enzyme và hệ enzyme có liên quan của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans, từ đó nghiên cứu cách tách chiết, tinh sạch một vài chất thứ cấp và đi sâu tìm hiểu tác dụng chống sâu răng của chúng. 3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu Chủng vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans GS-5, một số vi khuẩn thuộc chi Streptoccocus từ bộ sưu tập giống tại Phòng thí nghiệm của GS. Robert E. Marquis, Đại học Rochester, Mỹ. Một số chủng vi khuẩn được phân lập từ người Việt Nam. Các thực vật được lựa chọn bao gồm: Chàm tía, Hương nhu trắng, Kim ngân, Quỷ trâm thảo, Sài đất và Sao đen là những loài được dùng trong các bài thuốc dân gian Việt Nam để chữa bệnh sâu răng và có tính kháng khuẩn, chống viêm. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu điều tra ảnh hưởng một số dịch chiết thực vật lên quá trình sinh axit gây sâu răng Streptococcus mutans và tác dụng giết chết vi khuẩn này của các dịch chiết. 3 2. Tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc và nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ các loài thực vật được điều tra lên các quá trình sinh lý, hoá sinh của vi khuẩn S. mutans cũng như một số enzyme và phức hệ enzyme đích, liên quan đến tính chất gây sâu răng của vi khuẩn này. 3. Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ bệnh phẩm của người Việt Nam bị sâu răng và bước đầu nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp thu được lên một số quá trình sinh lý, hoá sinh cũng như một số enzyme và phức hệ enzyme liên quan của chủng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập được. 4. Địa điểm thực hiện đề tài Các nghiên cứu của luận án được thực hiện chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội. Một số thí nghiệm để tinh sạch và xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thực vật thứ cấp được thực hiện tại các phòng thí nghiệm của Viện Hoá học các hợp chất tự nhiên-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 5. Đóng góp mới của đề tài 1. Đây là công trình nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có tác dụng chống sâu răng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý phát triển của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans. 2. Đây là công trình nghiên cứu có tính hệ thống về tác dụng của dịch chiết vỏ cây Sao đen và lá cây Sắn thuyền lên vi khuẩn gây sâu răng S. mutans. 3. Đây là công trình đầu tiên công bố về việc tách chiết, xác định công thức hoá học và tác dụng chống sâu răng của hợp chất hopea phenol, malibatol A từ vỏ Sao đen và axit asiatic từ lá Sắn thuyền thông qua việc đánh giá tác dụng của chúng lên sự sinh axit, khả năng giết vi khuẩn và tác dụng của chúng lên hoạt độ một số enzyme đích trong việc sinh và chịu axit của vi khuẩn S. mutans. 4. Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu phân lập và nhận dạng đến loài một số chủng vi khuẩn S. mutans từ người Việt Nam. 4 6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp các dẫn liệu về khả năng kháng khuẩn sâu răng của một số dịch chiết thực vật, hợp chất tinh sạch từ lá Sắn thuyền và vỏ Sao đen có ở Việt Nam góp phần ứng dụng hiệu quả hơn trong việc bảo vệ răng, miệng. 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. BỆNH SÂU RĂNG VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN 1.1.1. Bệnh sâu răng Bệnh sâu răng là bệnh gây ra bởi vi khuẩn trên mảng bám răng, điển hình là vi khuẩn Streptococcus mutans. Những vi khuẩn trên mảng bám răng sử dụng các carbohydrate chủ yếu là đường glucose lên men tạo axit lactic. Môi trường axit phá vỡ sự cân bằng của các vi khuẩn đường miệng, tạo điều kiện thích hợp với vi khuẩn gây sâu răng. Những vi khuẩn này có khả năng chịu được pH thấp và do đó có thể duy trì hoạt động trao đổi chất và tiếp tục tạo axit [12, 69, 80]. Khi lượng axit hình thành đủ lớn sẽ hòa tan các khoáng chất có trong men răng vốn được cấu tạo bởi hydroxylapatide liên kết với ion canxi tích điện dương và ion phosphate tích điện âm, dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng [11, 12, 80]. 1.1.2 Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam Bệnh sâu răng là một trong 3 bệnh được tổ chức Y tế thế giới cảnh cáo về mức độ nguy hiểm chỉ sau các bệnh tim mạch và ung thư [29]. Trong các thập niên trước, tỷ lệ số người mắc bệnh sâu răng cao ở cả người lớn và trẻ em. Trung bình mỗi trẻ em 12 tuổi có từ 8 đến 10 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu. Chỉ số DMFT được sử dụng để phản ánh số răng sâu, số răng mất hay trám răng do sâu. Năm 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi trung niên (từ 35 đến 44 tuổi) tại các nước công nghiệp phát triển như Canada, Nhật Bản, Úc và các nước Bắc Âu là 13,9 tương đương một người có trung bình 13,9 răng bị sâu, trám hay mất, chỉ số này ở Mỹ cao hơn 9 [29]. Những năm gần đây, tỷ lệ sâu răng đã giảm tuy nhiên còn ở mức cao một phần do điều kiện sống được cải thiện, hàm lượng đường tăng trong chế độ ăn và việc sử dụng nhiều loại bánh kẹo và sản phẩm có đường và hiệu quả công tác tuyên truyền phòng chống bệnh chưa cao [130, 131, 139]. Tại các nước đang phát triển như Thái Lan, Uganda v.v... chỉ số DMFT ở lứa tuổi 12 cuối những năm 1960 chỉ từ 1 đến 3 nhưng đã tăng lên mức từ 3 tới 5 và 5 thậm chí cao hơn vào những năm 1970-1980 [29, 119]. Chỉ số DMFT ở tuổi 12 ở mức cao trên 4,4 còn gặp ở Ba Lan, Philipin và một vài nước ở Trung Mỹ như Nicaragoa, Honduras, Guatemala và hầu hết các nước Nam Mỹ như Braxin, Colombia, Chilê, Bolivia và Paragoay. Bên cạnh đó một số nước Đông Nam Á như Malaysia và Singapore tình trạng sâu răng đặc biệt ở trẻ em có xu hướng giảm trong những năm gần đây do đã làm tốt công tác phòng bệnh [130, 131]. Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Nguyễn Dương Hồng năm 1977 [13] tại Hà Nội có tới 77% trẻ em 6 tuổi có sâu răng, tỷ lệ này đối với thanh niên là 48%. Theo Võ Thế Quang và tập thể [30], từ năm 1983 đến 1991 số người mắc bệnh sâu răng ở các tỉnh phía Nam cao hơn các tỉnh phía Bắc nhưng mức độ gia tăng bệnh ở các tỉnh phía Bắc lại cao hơn các tỉnh phía Nam. Nhìn chung trong thời gian 19801990 số bệnh nhân bị sâu răng ở Việt Nam có chiều hướng gia tăng. Đến năm 1990, tỷ lệ sâu răng ở lứa tuổi 12 là 57% với tỷ lệ viêm lợi và viêm quanh răng là 95% và đối với lứa tuổi từ 35 đến 44 thì tỷ lệ này cao tới 99,26% [30]. Theo kết quả điều tra của Trần Văn Trường và tập thể [38] về tỷ lệ mắc bệnh sâu răng trong một số tỉnh thành trong cả nước, hai thành phố lớn là Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh có tỷ lệ sâu răng trong khoảng từ 36 đến 92% tuỳ theo từng độ tuổi. Theo số liệu điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc lần thứ 2 năm 2001 với nhóm tuổi 18 đến 34 chỉ số DMFT là 3,64 và tăng dần theo độ tuổi từ 34 đến 44 là 5,06 và trên 45 là 8,26. Tỷ lệ sâu răng vĩnh viễn là 54,89%, 75,2% và 89,7% đối với các độ tuổi dưới 12, từ 18 đến 34 và trên 45 tuổi. Tỷ lệ viêm quanh răng cũng rất cao ở cả trẻ em và người lớn. Tỷ lệ người Việt Nam có răng khoẻ mạnh chỉ đạt mức dưới 10% [9, 38]. Đáng chú ý trong điều tra gần đây của Trịnh Đình Hải [9] tỷ lệ sâu răng ở người Việt Nam trưởng thành cao tới 87,5%. Nhìn chung ở tất cả các nhóm tuổi đều có bệnh nhân sâu răng và chỉ số DMFT gia tăng theo tuổi. Với người 45 tuổi trở lên có 89,7% người bị sâu răng và trung bình mỗi người có 8,93 răng bị sâu. Trong số 8,93 răng sâu có 6,64 răng bị mất, chiếm tỷ lệ 74,36%. Tỷ lệ này cho thấy việc chăm sóc điều trị để bảo tồn được răng ở nước ta còn yếu kém. Cũng theo nghiên cứu của tác giả tỷ lệ sâu răng ở nam và nữ người Việt Nam trưởng thành không khác nhau, nhưng lại rất khác nhau về tỷ lệ sâu răng giữa hai vùng thành thị và nông thôn. Người sống ở thành thị có tỷ lệ sâu răng và chỉ số DMFT cao hơn so với 6 người sống ở nông thôn. Trong cả 7 vùng địa lý của Việt Nam, tỷ lệ sâu răng đều ở mức cao, trong đó 3 vùng địa lý là vùng Duyên hải Nam Trung bộ, vùng Đông Bắc Nam Bộ và vùng Đồng bằng sông Cửu Long có chỉ số DMFT ở nhóm tuổi trên 45 ở mức trên 10, tức là mỗi người có trung bình trên 10 răng bị sâu hoặc bị mất do sâu. Tỷ lệ các răng đã bị mất do không được điều trị bảo tồn gia tăng theo tuổi từ 18,31% ở tuổi 18 lên đến 74,36% ở người từ 45 tuổi trở lên. Tổ chức Y tế thế giới, Liên đoàn Nha khoa Quốc tế đã quan tâm đến vấn đề dự phòng sâu răng và tuyên bố ủng hộ nguyên tắc phòng bệnh hơn chữa bệnh và từ đó liên tục nghiên cứu, tìm kiếm các biện pháp phòng bệnh sâu răng. Tổ chức Y tế thế giới đưa ra mục tiêu cho toàn cầu, phấn đấu đến năm 2010 chỉ số DMFT dưới 1,0 [158]. Tại Việt Nam với chương trình nha học đường, chúng ta hy vọng mục tiêu đến năm 2010 đạt được các chỉ tiêu: ở lứa tuổi 5-6 có 50% không bị sâu răng, ở độ tuổi 18 có 85% người giữ được toàn bộ răng, từ 35-44 tuổi giảm 50% số người không còn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số người không còn răng với số lượng răng trên 20 chiếc tương đương là 75 và 50% [37, 38]. 1.1.3. Cơ chế gây sâu răng Răng có cấu tạo dọc gồm 3 lớp: men răng, ngà răng và tuỷ răng [12]. Men răng là lớp ngoài cùng rắn chắc nhất. Men răng bao gồm chủ yếu các tinh thể canxi phosphate dài và mảnh, xếp sát cạnh nhau theo một trật tự nhất định. Men răng rất bền vững, không bị vỡ, không bị cọ xát nhưng có thể bị bào mòn do tác động của axit trong miệng. Ngà răng là lớp bên trong, là phần chính của răng. Tuỷ răng nằm ở chính giữa của răng, gồm mô liên kết có chứa tận cùng thần kinh và các mao mạch làm cho răng có cảm giác và để nuôi răng (hình 1.1). Men răng Ngà răng Tuỷ Lợi Lợi 7 Hình 1.1. Cấu tạo của răng [12] Răng bị sâu khi lớp men răng không được bảo vệ tốt và bị axit ăn mòn. Axit hoà tan các tinh thể hydroxyapatite chứa canxi phosphate trên bề mặt răng, tạo ra các hố nhỏ trên răng. Các hố này lớn dần, ăn sâu vào các tổ chức bên trong của răng (ngà răng, tuỷ răng). Vi khuẩn theo các hố sâu xâm nhập vào bên trong, gây viêm tuỷ răng, tạo ra cảm giác đau đớn cho người bệnh. Vào giai đoạn cuối, các mạch máu, mô thần kinh bị chết, hình thành áp xe ở chân răng gây viêm, sưng và cuối cùng phải nhổ răng [12, 39, 80]. N- í c bät § - êng Vi khuÈn § - êng Vi khuÈn R¨ng R¨ng pH, dßng ch¶y n- í c bät A B Hình 1.2. Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan  Sâu răng A: theo Keyes [112] ; B: theo White và tập thể [197] Trước năm 1970, để giải thích căn bệnh sâu răng, người ta chú ý nhiều đến vai trò của đường và vi khuẩn S. mutans và đưa ra ra sơ đồ của Keyes [112]. Theo sơ đồ này, việc phòng tránh bệnh sâu răng chỉ tập trung vào việc ăn hạn chế chất đường, tiến hành vệ sinh kỹ răng miệng (hình 1.2A). Năm 1976, White và tập thể [197] giải thích cơ chế bệnh học của sâu răng bằng việc thay vòng tròn chất đường trong sơ đồ của Keyes bằng vòng tròn chất nền, đề cao vai trò bảo vệ của nước bọt và vai trò của fluo. Trong sơ đồ của White và tập thể (hình 1.2B) cho thấy có nhiều yếu tố tác động, hạn chế quá trình phân huỷ khoáng, tăng cường quá trình tái khoáng và có tác dụng bảo vệ răng không bị sâu như nước bọt, các ion F-, Ca2+ v.v... 8 Năm 1995, Hội Nha khoa Mỹ khẳng định bệnh sâu răng là bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây nên và giải thích nguyên nhân sâu răng theo sơ đồ như của Keyes tuy nhiên có một số thay đổi trong sơ đồ như đường được thay thế bằng môi trường, vi khuẩn được thay bằng tác nhân gây sâu răng và răng được coi là vật chủ. Trong đó tác nhân gây sâu răng là các vi khuẩn gây sâu răng S. mutans, Lactobacillus và Actinomyces; vật chủ là răng gồm men răng, ngà răng và xương răng; môi trường là các loại thức ăn chứa carbohydrate có khả năng lên men [42]. Bệnh sâu răng chỉ hình thành và phát triển khi ba yếu tố chính gây ra bệnh sâu răng là vi khuẩn, đường (trong thức ăn) và thời gian đường cùng vi khuẩn tồn tại trong khoang miệng. Vi khuẩn gây bệnh sâu răng cùng với các vi khuẩn khác trong khoang miệng tồn tại, bám trên bề mặt răng và sử dụng đường trong thức ăn, đồ uống để tạo và phát triển các mảng bám răng đồng thời chúng tiêu hoá đường để tạo axit, ăn mòn dần các chất vô cơ ở men răng và ngà răng, làm thành lỗ sâu [51, 60, 80]. Nói chung vi khuẩn luôn tồn tại trong miệng còn đường thường tồn tại từ 20 phút đến 1 giờ trong miệng sau khi ăn, tuỳ thuộc hình thức chế biến thức ăn. Do vậy, khoảng 20 phút sau khi ăn, axit được hình thành với lượng đủ lớn và bắt đầu tấn công ăn mòn men răng. Bệnh sâu răng chỉ diễn ra khi cả ba yếu tố trên cùng tồn tại. Vì thế cơ sở của việc phòng chống bệnh sâu răng là ngăn chặn một hoặc cả ba yếu tố xuất hiện cùng một lúc [80, 141]. Ngoài ra một yếu tố thứ tư không kém phần quan trọng là bản thân người bệnh. Các yếu tố chủ quan như tuổi tác, hoạt động không bình thường của tuyến nước bọt, dị tật bẩm sinh của răng có thể khiến cho khả năng mắc bệnh sâu răng tăng cao và tốc độ bệnh tiến triển nhanh [12, 13, 88]. 1.1.4. Mảng bám răng và sự hình thành mảng bám răng Miệng là môi trường của nhiều loài vi khuẩn. Vi khuẩn đường miệng có mặt ở mọi nơi trong miệng: răng, lưỡi, niêm mạc miệng, lợi. Những vi khuẩn này có thể là có hình cầu (cầu khuẩn), hình que (trực khuẩn) hay hình xoắn (xoắn khuẩn). Trên răng, các vi khuẩn và sản phẩm của chúng cùng với những mảnh vụn thức ăn tạo thành mảng bám răng. Sự hình thành mảng bám răng gồm 3 giai đoạn chính: giai đoạn đầu vi khuẩn được vận chuyển đến bề mặt của răng và bám vào