Tài liệu Nghiên cứu sự tồn tại và nảy mầm của bào tử bacillus aquimaris sh6 trong ruột tôm thẻ chân trắng và ảnh hưởng của bào tử lên một số chỉ tiêu miễn dịch của tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI Nhung TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------ Nguyễn Thị Hương NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ NẢY MẦM CỦA BÀO TỬ Bacillus aquimaris SH6 TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA BÀO TỬ LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH Ở TÔM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------------------------ Nguyễn Thị Hương NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ NẢY MẦM CỦA BÀO TỬ Bacillus aquimaris SH6 TRONG RUỘT TÔM THẺ CHÂN TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA BÀO TỬ LÊN MỘT SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH Ở TÔM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Phạm Thị Thu Hường PSG.TS. Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội - 2018 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình từ phía thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thu Hường và PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ, tập thể nhóm nghiên cứu và các bạn sinh viên tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, những người đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ; các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của Quỹ TWAS (Viện Hàn lâm Khoa học Thế giới), đề tài mã số 16-549 RG/BIO/AS_G - FR3240293311 do PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh làm chủ nhiệm. Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Hương Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. 1 DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. 3 DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT .................................................................. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 7 1.1. Tôm thẻ chân trắng .................................................................................................... 7 1.2. Probiotic và vai trò của chúng trong nuôi trồng thủy sản ......................................... 8 1.2.1. Giới thiệu chung về probiotic ................................................................................. 8 1.2.2. Các nghiên cứu về vai trò và ứng dụng của Bacillus probiotic trong nuôi tôm ..... 9 1.3. Nghiên cứu về carotenoid và vi khuẩn sinh carotenoid .......................................... 11 1.3.1. Carotenoid .......................................................................................................... 11 1.3.2. Vi khuẩn sinh carotenoid ...................................................................................... 12 1.3.3. Astaxanthin .......................................................................................................... 12 1.4. Hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ........................................................... 13 1.5. Bào tử B. aquimaris SH6 và tác dụng probiotic của chúng đối với tôm thẻ chân trắng ............................................................................................................. 15 1.5.1. Thực trạng nghiên cứu vai trò probiotic của bào từ B. aquimaris ....................... 15 1.5.2. Khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris ...................................................... 16 1.6. Đặt vấn đề nghiên cứu và thiét kế thí nghiệm ......................................................... 17 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................. 19 2.1. Nguyên liệu ............................................................................................................. 19 2.1.1. Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) ....................................................... 19 2.1.2. Bào tử B. aquimaris SH6 ..................................................................................... 19 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 2.1.3. Thức ăn cho tôm ................................................................................................... 20 2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................................................... 20 2.1.5. Hóa chất ............................................................................................................. 21 2.1.6. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................... 23 2.2. Phương pháp ............................................................................................................ 23 2.2.1. Chuẩn bị bào tử B. aquimaris SH6 và tách chiết carotenoid ............................... 23 2.2.2. Chuẩn bị thức ăn cho tôm..................................................................................... 26 2.2.3. Bố trí các nhóm thi ghiệm và quy trình nuôi tôm ................................................ 26 2.2.4. Xác định số lượng B. aquimaris SH6 và tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm .......................................................................................................... 28 2.2.5. Đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm ........ 29 2.2.6. Đánh giá các chỉ số miễn dịch của tôm ................................................................ 34 2.2.7. Xác định tốc độ tăng trưởng, nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm .............. 38 2.2.8. Phân tích dữ liệu ................................................................................................... 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 40 3.1. Khả năng lưu trú của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng ...... 40 3.2. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho Real-time PCR gen BaqA-SH6 ...................... 43 3.3. Khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng .. 45 3.4. Vai trò của bào tử B. aquimaris SH6 trong tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ............................................................................................................. 48 3.5. Tăng trưởng về trọng lượng của tôm khi ăn bào tử B. aquimaris SH6. .................. 53 3.6. Nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm ............................................................... 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 58 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 Kết luận ............................................................................................................. 58 Kiến nghị ............................................................................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 60 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Bào tử B. aquimaris SH6. ............................................................................. 19 Hình 2.2: Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng. ................................................................... 20 Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ Astaxanthin............................................................... 25 Hình 2.4 : Mô hình bể nuôi tôm trong quy mô phòng thí nghiệm ................................ 27 Hình 2.5: Bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm. ............................................ 28 Hình 2.6: Trình tự tương đồng đoạn gen BaqA giữa chủng B. aquimaris MKSC 6.2 và một số chủng Anoxybacillus spp. ................................................................................... 31 Hình 2.7: Mô hình vector biến nạp pTOP TA V2 (3807 bp) [80] ................................ 32 Hình 3.1: Số lượng B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng sau 28 ngày (CFU × 105/g ruột tôm). ........................................................................................................... 40 Hình 3.2: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm thẻ chân trắng sau 28 ngày (CFU × 106/g ruột tôm). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 ................................................... 41 Hình 3.3: Thành phần loài trong quần xã vi sinh vật ruột tôm ở ngày 28 ở các nhóm thí nghiệm ............................................................................................................................ 43 Hình 3.4: Điện di gel biến tính sản phẩm PCR mồi M13 để sàng lọc khuẩn lạc mang gen tái tổ hợp. ................................................................................................................. 44 Hình 3.5: Trình tự BaqA-SH6, mồi và probe đặc hiệu.................................................. 44 Hình 3.6: Điện di gel electrophoresis sản phẩm PCR nhân đoạn gen BaqA-SH6........ 45 Hình 3.7: Đánh giá sự nảy mầm trong ruột tôm. Đường tín hiệu huỳnh quang FAM của phản ứng Real-time PCR nhân đoạn gen đặc hiệu BaqA-SH6 trên một số mẫu đại diện: 0 h, 4 h, 24 h, 7 d và các điểm chuẩn 100%, 20%. ........................................................ 47 Hình 3.8: Tỷ lệ nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng (%). ................................................................................................................................. 48 Hình 3.9: Số phận của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng .......... 48 Hình 3.10: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28. A - Mức độ biểu hiện mRNA Rho. B - Mức độ biểu hiện mRNA Ran. *P<0,05, **P<0,01. ....................................... 49 1 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 Hình 3.11: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28. A - Hoạt tính enzyme PO. B - Hoạt tính enzyme SOD. *P<0,05; **P<0,01. ............................................................. 52 Hình 3.12: Tốc độ tăng trưởng (%/ngày) của tôm thẻ chân trắng ở các nhóm thí nghiệm khác nhau. Giá trị trung bình với cỡ mẫu n = 20 **P < 0,01 ................................54 Hình 3.13: Nồng độ astaxanthin của tôm tại thời điểm 28 D. *P<0,05 ....................... 55 Hình 3.14: Màu sắc của tôm sau khi luộc tại thời điểm 28 D ....................................... 56 2 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Điều kiện của PCR nhân đoạn gen BaqA ...................................................... 31 Bảng 2.2: Chu trình phản ứng Real-time PCR, TaqMan probe .................................... 33 Bảng 2.3: Trình tự các cặp mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu ............................ 35 3 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT CFU Colony forming unit – Số lượng khuẩn lạc cDNA Complement DNA D Day (ngày) DNA Deoxyribonucleic acid DSM Difco sporulation medium DW Distiled water (Nước vô trùng) ĐC Đối chứng âm Fw Forward (Mồi xuôi) g Gram ha Hecta h Hour (giờ) l Lit LB Luria Bertani L-DOPA L-3-4-dyhydroxyphenylalanine ml Mililit PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp polymere) PO Phenoloxidase RNA Ribonucleic acid Rv Reverve (Mồi ngược) RT Reverse Transcriptase SOD Superoxidase dimutase V Thể tích 4 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 MỞ ĐẦU Với đặc thù là một quốc gia có bờ biển dài, thủy sản đã và đang được chú trọng đẩy mạnh phát triển và được xem là một trong các thành phần kinh tế mũi nhọn của Việt Nam. Trong đó, tôm thẻ chân trắng là một đối tượng được quan tâm hàng đầu bởi giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế phục vụ xuất khẩu của nó. Theo Báo cáo thực hiện kế hoạch năm 2017, nhiệm vụ, giải pháp chủ yếu thực hiện kế hoạch năm 2018 của Tổng cục Thủy sản - Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, sản lượng nuôi trồng thủy hải sản của nước ta trong năm 2017 đạt con số 3.858 nghìn tấn, trong đó, tôm thẻ chân trắng đạt tới 427 nghìn tấn, chiếm 11.1% tổng sản lượng, tăng 108.5% so với cùng kỳ năm 2016. Tương ứng với kim ngạch xuất khẩu đạt 2.535 triệu USD, tăng 129.5% so với cùng kỳ năm 2016 và chiếm 30.4% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy hải sản của Việt Nam năm 2017. Năm 2018 ghi nhận báo cáo về tổng sản lượng nuôi trồng tôm nước lợ 6 tháng đầu năm đạt 494 nghìn tấn, tăng 10,6% so với cùng kỳ nàm 2017 [1]. Những con số kể trên phần nào cho thấy giá trị thương phẩm to lớn và vai trò quan trọng của tôm thẻ chân trắng trong tổng thể nền kinh tế - nông nghiệp nuôi trồng thủy hải sản của Việt Nam. Đây cũng chính là lý do khiến tôm thẻ chân trắng đang ngày càng trở thành mối quan tâm hàng đầu trong chiến lược phát triển kinh tế của Nhà nước cũng như từ các nhà khoa học trong những nghiên cứu những biện pháp giúp cải thiện năng suất và chất lượng cũng như hạn chế các tác nhân gây bệnh ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng tôm thẻ chân trắng. Trong đó, có hai hướng nghiên cứu liên quan tới sức khoẻ của tôm được nhiều nhà khoa học quan tâm là: (i) tìm ra các vắc xin và các phương pháp phòng bệnh cho tôm thẻ chân trắng như bệnh đốm trắng, gan tuỵ, phân trắng… (ii) phát triển các chế phẩm sinh học, ví dụ như probiotic, để tăng cường sức khoẻ cho tôm thông qua các chỉ số về cân nặng, miễn dịch, dinh dưỡng….. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò của một số chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus plantarum, ... đối với tôm thẻ chân trắng, liên quan đến tác dụng tăng trọng lượng, tăng khả năng sống sót và tăng 5 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 cường miễn dịch [16, 28]. Tuy nhiên, những năm gần đây, khi nhắc đến tôm thẻ chân trắng thì cả nông dân lẫn doanh nghiệp và người tiêu dùng không chỉ quan tâm đến cân nặng và sản lượng mà còn về giá trị dinh dưỡng của tôm. Giá trị dinh dưỡng và chất lượng đó của tôm thẻ chân trắng phụ thuộc chủ yếu vào màu sắc và nồng độ các chất chống oxy hóa có trong mô cơ tôm, như: astaxanthin, cantaxanthin, β-carotene, ... Trong đó, astaxanthin được biết đến là một trong những chỉ thị quan trọng để đánh giá giá trị và chất lượng của tôm [76], astaxanthin cũng giúp tích lũy lượng lớn carotenoid và phòng ngừa “Hội chứng màu xanh” ở tôm. Vì thế, sự tăng trưởng về nồng độ astaxanthin của tôm đang trở thành mối quan tâm rất lớn của các nhà khoa học. Trong các công bố gần đây của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein (PTNTĐCNEP), Bacillus aquimaris SH6 được biết đến có khả năng tăng hàm lượng astaxanthin, cân nặng và hoạt tính enzyme PO [48]. Do vậy, SH6 hứa hẹn là chủng probiotic đem lại hiệu quả cao khi sử dụng làm thức ăn cho tôm thẻ chân trắng. Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa đề cập tới số phận và cơ chế tác dụng của bào tử SH6 trong ruột tôm để phần nào giải thích được các tác dụng có lợi mà SH6 mạng lại cho tôm. Ngoài ra, các số lượng chỉ tiêu miễn dịch của tôm trong nghiên cứu này còn hạn chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu khả năng tồn tại và nảy mầm của bào tử Bacillus aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng và ảnh hưởng của bào tử lên một số chỉ tiêu miễn dịch của tôm” với các mục tiêu sau:  Chứng minh khả năng lưu trú và nẩy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng, và ảnh hưởng của nó tới sự đa dạng quần xã vi sinh vật trong ruột tôm.  Đánh giá mức độ tăng trưởng của các chỉ số miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng khi cho ăn bào tử B. aquimaris SH6, kèm theo các chỉ số tăng trọng và tăng hàm lượng astaxanthin ở tôm. 6 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tôm thẻ chân trắng Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là loài bản địa ở phía đông Thái Bình Dương, được khai thác chủ yếu làm thực phẩm. Nhiều năm gần gây, nuôi tôm thẻ chân trắng trong điều kiện nước lợ phát triển rất mạnh mẽ ở một số quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan, Việt Nam,… không chỉ phục vụ nhu cầu thực phẩm trong nước mà còn nhằm phát triển xuất khẩu ra một số nước Châu Âu, Châu Mỹ, … đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người nuôi trồng thủy sản và đóng góp một phần đáng kể cho kinh tế quốc gia. Trên thế giới, trong giai đoạn năm 1980, các nước như Trung Quốc, Equado là các nước nuôi trồng và sản xuất tôm lớn nhất trên thế giới. Tuy nhiên, đến nay thì vị trí đó đã thuộc về bốn nước Đông Á là Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan và Indonesia, chiếm 75% sản lượng tôm toàn cầu. Trong đó, đối tượng nuôi chủ lực là tôm thẻ chân trắng. Tại Việt Nam, tôm thẻ chân trắng bắt đầu phát triển mạnh mẽ từ sau năm 2000, do trước đó nông dân lo ngại việc du nhập tôm thẻ chân trắng sẽ làm lây lan mầm bệnh ảnh hưởng đến đối tượng chủ lực ở giai đoạn đó là tôm sú. Các đơn vị đầu tiên nhập tôm thẻ vào nuôi thử nghiệm ở Việt Nam là 3 công ty: Công ty Duyên Hải (Bạc Liêu), Công ty Việt Mỹ (Quảng Ninh) và Công ty Asia Hawai (Phú Yên). Đến nay, tôm thẻ chân trắng đã phát triển nuôi khắp cả nước trong đó chủ yếu là vùng Đồng bằng sông Cửu Long hướng tới mục tiêu đạt diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng là 150.000 ha, sản lượng đạt trên 750.000 tấn và tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu tôm nước lợ là 12 tỷ USD ở năm 2030. Tuy nhiên, sự phát triển nuôi trồng tôm thẻ chân trắng một cách mạnh mẽ như vậy gây ra áp lực lớn đối với môi trường, cung ứng con giống, dịch bệnh, … Thêm vào đó, khi nuôi trồng tôm thẻ chân trắng hướng chới xuất khẩu đến các thị trường khó tính 7 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 như Châu Âu, Châu Mỹ, đòi hỏi sản lượng và chất lượng tôm rất cao. Do vậy, đã có nhiều nghiên cứu, sách báo của các nhà khoa học trong nước về việc phát triển kỹ thuật - công nghệ nuôi tôm thương phẩm, nghiên cứu nâng cao chất lượng tôm giống, sản xuất tôm thẻ chân trắng bố mẹ sạch bệnh,… [3, 5]. Do vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic) trong nuôi tôm là điều thiết yếu, hướng tới giải pháp nuôi trồng tôm thẻ chân trắng theo hướng hạn chế sử dụng kháng sinh, an toàn cho môi trường và con người, đồng thời vẫn đảm bảo tốc độ tăng trưởng, khả năng chống chịu bệnh tật, sản lượng và chất lượng tôm. 1.2. Probiotic và vai trò của chúng trong nuôi trồng thủy sản 1.2.1. Giới thiệu chung về probiotic Nghiên cứu về probiotic từ lâu đã và đang nhận được rất nhiều sự quan tâm từ các nhà khoa học trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, với mục đích ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: tăng cường sức khỏe, hỗ trợ quá trình hấp thụ dinh dưỡng ở con người và chăn nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản... Probiotic là lựa chọn thay thế cho thuốc kháng sinh để hạn chế tối đa các tác dụng phụ và đem lại nhiều tác dụng có lợi cho vật chủ. Ngày nay, probiotic không chỉ dừng lại ở phạm vi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà còn được thương mại hóa và phát triển mạnh mẽ dưới nhiều hình thức khác nhau, trong đó, các sản phẩm được phát triển nhiều nhất là thực phẩm chức năng cho người và thức ăn chăn nuôi cho gia súc, gia cầm và thủy sản. Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mang lại tác dụng có lợi cho vật chủ bởi khả năng cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật có lợi phát triển và ức chế các chủng vi sinh vật có hại cho vật chủ [26]. Probiotic là các chủng vi khuẩn sống, điển hình bởi những tác dụng sau đây : - Ngăn ngừa nhiễm trùng đường tiêu hóa, ngăn ngừa sự xâm lấn và gây hại của các chủng vi sinh vật gây bệnh [74, 79]. 8 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 - Tăng cường miễn dịch cho vật chủ [33]. - Tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, tăng trọng lượng, tăng khả năng sống sót của vật chủ [52]. Đặc điểm nổi bật khi sử dụng probiotic là thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử dụng. Do đó, probiotic ngày càng được các nhà khoa học quan tâm, với mục đích nghiên cứu sâu hơn về vai trò, công dụng và cơ chế tương tác của chúng với vật chủ. Dựa vào đó để đưa ra những kết luận mang tính khoa học, làm cơ sở cho các doanh nghiệp phát triển và thương mại hóa các sản phẩm thức ăn chăn nuôi chứa probiotic. 1.2.2. Các nghiên cứu về vai trò và ứng dụng của Bacillus probiotic trong nuôi tôm Probiotic dùng trong lĩnh vực thuỷ sản thường được biết đến hầu hết là các chủng thuộc chi Lactobacillus và Bacillus [18, 31] (ngoại trừ B. cereus và B. anthracis là một số loài Bacillus gây bệnh [9, 22]). Một trong những lý do khiến Bacillus sp gần đây được ứng dụng phổ biến làm probiotic là vì chúng có khả năng hình thành nội bào tử, nhờ đó probiotic chứa Bacillus sp. tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất (sấy khô ở nhiệt độ cao), có thể bảo quản và sử dụng trong thời gian dài mà không ảnh hưởng đến chất lượng và mật độ vi sinh vật trong sản phẩm, đồng thời chúng có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường khắc nghiệt. Khi được cung cấp đủ chất dinh dưỡng và môi trường sống thuận lợi, chúng có thể nảy mầm và trở thành dạng tế bào sinh dưỡng [49]. Bên cạnh đó, Bacillus sp. còn đáp ứng được các tiêu chí của probiotic như: có khả năng tồn tại và nảy mầm trong ruột, hình thành màng sinh học và khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh [32], Bacillus sp. có khả năng sản sinh một số enzyme tiêu hóa, kích thích tiêu hóa thức ăn trong ruột dẫn đến kích thích tăng trọng lượng của vật chủ, ví dụ cụ thể đối với đối tượng là tôm thẻ chân trắng [28, 79], ... 9 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 Nghiên cứu về vai trò probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng có thể kể đến một số lĩnh vực, bao gồm: (1) Thức ăn chứa probiotic giúp tăng cường miễn dịch, tăng sức khỏe, khả năng tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng,... ở tôm thẻ chân trắng, giúp tăng năng suất và sản lượng nuôi tôm; (2) Thức ăn nuôi tôm chứa probiotic giúp tôm chống chịu một số tác nhân gây bệnh, nghiêm trọng như vi rút đốm trắng. (3) Một hướng nghiên cứu mới là thức ăn chứa probiotic là các chủng có khả năng sinh carotenoid, giúp làm tăng hàm lượng astaxanthin ở tôm thẻ chân trắng, qua đó cải thiện chất lượng tôm nuôi. Đã có nhiều công bố về vai trò probiotic của một số chủng Bacillus sp., cụ thể: B. amyloliquefaciens [2, 4] B. subtilis và B. indicus [32, 52], B. licheniformis, B. megaterium [19, 33, 35]. Cụ thể như nghiên cứu phân lập các chủng có hoạt tính probiotic của tác giả Khuất Hữu Thanh và cộng sự (2009) [3], nghiên cứu về chủng B. amyloliquefaciens không chỉ làm thức ăn mà có tác dụng tích cực trong việc cải thiện chất lượng nước hồ nuôi tôm của các tác giả thuộc trường Đại học Cần Thơ [2, 4] nghiên cứu về các chủng B. subtilis, B. megaterium liên quan đến sự tăng khả năng sản sinh enzyme tiêu hóa cho tôm [54], nghiên cứu về B. licheniformis có tác dụng tăng cường miễn dịch và cân bằng hệ vi sinh ruột tôm trước các tác nhân gây bệnh [16, 35, 40]. Có thể thấy rằng các nghiên cứu đánh giá tác dụng của probiotic dạng vi khuẩn thuộc chi Bacillus rất phổ biến và đa dạng cả ở trong nước và trên phạm vi quốc tế. Bên cạnh đó, tôm thẻ chân trắng là loài động vật có tốc độ tăng trưởng khá nhanh trong điều kiện môi trường và dinh dưỡng thuận lợi. Song chúng lại rất nhạy cảm với sự thay đổi các yếu tố môi trường như nhiệt độ và độ mặn của nước. Không chỉ vậy, các tác nhân như vi rút như vi rút gây bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot Syndrome Virus) và các chủng vi sinh vật gây bệnh (Vibrio sp., ...) [3], đây luôn là những mối lo ngại đáng kể đối với người nuôi tôm thẻ chân trắng vì những thiệt hại to lớn mà chúng gây ra. Để khắc phục phần nào tình trạng vi rút hoặc vi khuẩn gây bệnh cho tôm, sử dụng kháng sinh bằng cách cho tôm ăn hoặc bổ sung vào nước nuôi tôm là biện pháp đã được sử dụng rất phổ biến. Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh để phòng ngừa 10 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 bệnh trong nuôi tôm để lại vấn đề tồn đọng chưa thể giải quyết đó là: vi khuẩn, vi rút có khả năng tích lũy đột biến kháng thuốc, khiến thuốc kháng sinh không thể sử dụng lâu dài [0, 74]. Hơn thế nữa, việc sử dụng kháng sinh còn dẫn đến ảnh hưởng xấu cho sức khỏe con người khi sử dụng tôm và tác động tiêu cực đến môi trường do dư lượng lớn kháng sinh tích lũy trong tôm và môi trường nước [71]. Những năm gần đây, probiotic được cho là có tiềm năng và được sử dụng khá phổ biến nhằm mục đích khắc phục những mặt hạn chế kể trên của việc sử dụng kháng sinh. Một số nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước đã chứng minh vai trò của các chủng Bacillus sp. trong việc hỗ trợ tăng cường miễn dịch giúp tôm phòng ngừa các tác nhân gây bệnh như vi rút đốm trắng [61]. 1.3. Nghiên cứu về carotenoid và vi khuẩn sinh carotenoid 1.3.1. Carotenoid Carotenoid là các phân tử hữu cơ tự nhiên có trong một số thực vật và sinh vật quang hợp như tảo, nấm và một số vi khuẩn, điển hình là Bacillus sp. [34]. Carotenoid là tên chung của một nhóm các hợp chất có công thức phân tử và chức năng tương tự nhau, mỗi loại carotenoid đặc trưng cho một loại sắc tố khác nhau như vàng, vàng cam, đỏ, đỏ cam,... Một số carotenoid quen thuộc với con người như: β-carotene (tiền chất của vitamin A), lycopene, lutein, zeaxanthin và astaxanthin. Carotenoid được biết đến với tác dụng quan trọng nhất là khả năng chống oxy hóa, giúp tế bào chống lại sự phá hủy bởi tia UV. Chúng hoạt động như các oxy phân tử độc lập hoặc tương tác hiệp đồng với các chất chống oxy hóa khác để bảo vệ tế bào [70]. Đối với vi khuẩn, carotenoid giúp bảo vệ vi khuẩn tồn tại trong môi trường nội bào [34]. Đối với sức khỏe con người, carotenoid đã được chứng minh có khả năng phòng ngừa và ức chế tế bào ung thư ở mô hình in-vivo [44]. Carotenoid còn được biết đến với vai trò là chất dinh dưỡng quan trọng tác động đến khả năng sinh sản của tôm [41], đồng thời, carotenoid phổ biến trong tôm là astaxanthin - là sắc tố tạo nên màu đỏ cam của tôm khi luộc [76]. 11 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 1.3.2. Vi khuẩn sinh carotenoid Carotenoid có rất nhiều tác dụng hữu ích đối với các sinh vật sống. Tuy nhiên, con người hay các động vật khác, bao gồm cả tôm đều không có khả năng tự tổng hợp carotenoid mà chỉ có các loài vi khuẩn, một số thực vật và tảo [64] mới có khả năng này. Trong nhiều năm gần đây, có nhiều công bố về sàng lọc các chủng vi khuẩn sản sinh carotenoid từ đất, nước hay phân người, như: B. marisflavi, B. aquimaris sinh carotenoid sắc tố đỏ-cam [77], B. firmus sinh carotenoid sắc tố hồng [55], B. indicus, B. cibi, B. jeogadi sinh sắc tố vàng [34]. Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ có nghiên cứu của Ngo và cộng sự năm 2016, tiến hành sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh sắc tố trong ruột tôm thẻ chân trắng [48]. Trong nghiên cứu này, Ngo và cộng sự đã phân lập được một số chủng như B. aquimaris, B. marisflavi, B. firmus đều là các chủng vi khuẩn có lợi, có khả năng sinh sắc tố carotenoid màu vàng cam, trong đó, B. aquimaris SH6 là chủng được xác định có khả năng sinh sắc tố tốt nhất và khả năng tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân trắng thông qua tăng cường hoạt tính enzyme PO ở tôm, cũng như tiềm năng phát triển thành chế phẩm sinh học trong thức ăn nuôi tôm nói riêng và nuôi trồng thủy sản nói chung. 1.3.3. Astaxanthin Astaxanthin là một loại carotenoid có công thức hóa học là 3,3-dihydroxy-4,4diketo-β-carotene, là sắc tố chính được tìm thấy trong hầu hết các loại giáp xác như tôm, cua,... và một số loài cá, chiếm tới 90% tổng số carotenoid trong các loài này. Astaxanthin được biết đến là một loại chất chống oxy hóa tuyệt vời nhờ các gốc tự do trong cấu trúc phân tử và tác dụng chống ung thư, tốt cho da, tốt cho tim mạch, bảo vệ não bộ và giảm đau khớp,... Đối với tôm, astaxanthin là sắc tố quyết định màu sắc đỏ cam của tôm khi luộc – là chỉ số cảm quan đánh giá giá trị dinh dưỡng và giá trị thương phẩm của tôm, tăng cường đáp ứng miễn dịch và sức chịu đựng của tôm trong điều kiện môi trường thiếu hụt oxy, đồng thời nồng độ astaxanthin cũng là chỉ số đánh giá giá trị kinh tế của tôm. Từ năm 1990, Yamada và cộng sự đã chỉ ra rằng, tôm được cho 12 Luận văn thạc sĩ khoa học 2018 ăn với thức ăn bổ sung astaxanthin cho thấy tỷ lệ tử vong giảm đáng kể so với tôm không được ăn với thức ăn bổ sung astaxanthin [76]. Với những công dụng quan trọng như thế, astaxanthin đang dần trở thành một chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng và giá trị của tôm nuôi. Trên thị trường hiện nay cũng có nhiều sản phẩm đã được thương mại hóa có tác dụng cung cấp astaxanthin tổng hợp phục vụ nuôi trồng thủy sản, tiêu biểu là Carophyll Pink® 10% CWS (hãng DSM, Thụy Sỹ) chứa 10% astaxanthin. Bên cạnh đó, cũng có nhiều loại thực phẩm chức năng bổ sung astaxanthin cho người. Tuy nhiên, những sản phẩm như Carophyll Pink® là những chất tổng hợp hoá học nên khả năng hấp thu và chuyển hoá ở tôm sẽ không hiệu quả bằng những hợp chất carotenoid có nguồn gốc tự nhiên. Bên cạnh đó, dư lượng khi sử dụng trong nuôi trồng thủy sản có thể để lại ảnh hưởng tiêu cực cho người sử dụng và môi trường nuôi. Do đó, những nghiên cứu phát triển probiotic dạng vi khuẩn sống có khả năng sinh tổng hợp carotenoid tự nhiên đem lại ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn to lớn trong nuôi trồng tôm. 1.4. Hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng Tôm là loài động vật giáp xác không có khả năng sản sinh immunoglobulins mà cơ chế bảo vệ phụ thuộc chính vào hệ miễn dịch tự nhiên hay còn gọi là hệ miễn dịch không đặc hiệu [23]. Hệ thống miễn dịch này bao gồm các phản ứng trực tiếp của tế bào máu với tác nhân gây bệnh như cơ chế thực bào, các yếu tố hoạt hóa huyết tương từ hệ thống prophenoloxidase (proPO), hoạt độ enzyme superoxidase (SOD), chúng cũng tạo ra các yếu tố kết dính, hệ thống đông máu (hemolymph coagulation system), melanin hóa, peptide kháng khuẩn - AMP (Anti-Microbial Peptide) [27, 42, 75]. Hệ thống miễn dịch của tôm khởi động bằng việc nhận diện tác nhân xâm nhập thông qua sự gắn kết protein bề mặt, các lipopolysaccharide trên thành tế bào vi khuẩn hoặc các β-1,3-glucan trên thành tế bào nấm, kích hoạt các yếu tố zymogen, dẫn đến các quá trình bao gói, thực bào, melanin hóa, encapsunin hóa nhằm tấn công và tiêu 13