Tài liệu Nghiên cứu sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng của vài giống gà Việt Nam

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT EDTA: Ethylen – diamin – tetra – acetic axit GRF: Growth hormone – releasing factor ( Nhân tố giải phóng hormon sinh trưởng ) PCR: Polymerase chain reaction ( Phản ứng nhân ADN đặc hiệu ) RFLP: Restriction fragments length polymorphism ( Đa hình độ dài các đoạn giới hạn ) TBE: Dung dịch đệm tris – boric có chứa EDTA TE: Dung dịch đệm tris.HCl có chứa EDTA TRH: Thyrotropin – releasing hormone ( Hormon giải phóng thyrotropin ) 3 MỤC LỤC Lời cam đoan 1 Lời cảm ơn 2 Bảng viết tắt 3 Mở đầu 7 1 Tính cấp thiết của đề tài 7 2 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 8 2.1 ý nghĩa khoa học 8 2.2 ý nghĩa thực tiễn 9 3 Mục đích nghiên cứu 9 4 Nội dung nghiên cứu của đề tài 9 Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu 10 1.1 Hormon sinh trưởng 10 1.2 Hormon sinh trưởng và sinh trưởng ở gà 13 1.3 Hormon sinh trưởng tái tổ hợp 22 1.4 Tình hình nghiên cứu gen hormon sinh trưởng vật nuôi ở trong và 25 ngoài nước 1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 25 1.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 26 1.5 Một số đặc điểm và tính năng sản xuất của một số giống gà nội 32 1.5.1 Gà Hồ 32 1.5.2 Gà ác 33 1.5.3 Gà Ri 34 4 1.5.4 Gà Mía 35 1.6 Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong luận án 36 1.6.1 Phương pháp xác định trình tự ADN 36 1.6.2 Enzym giới hạn 37 1.6.3 Đa hình độ dài các đoạn giới hạn (RFLP) 38 1.7 Dấu phân tử trong phân tích di truyền vật nuôi 39 1.8 Cấu trúc gen hormon sinh trưởng của gà 40 Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 43 2.1 Đối tượng nghiên cứu 43 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu máu 43 2.2.2 Phương pháp tách ADN 43 2.2.3 Phản ứng nhân ADN đặc hiệu (PCR) 44 2.2.4 Cắt sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn 45 2.2.5 Xác định độ lớn các đoạn ADN sau khi cắt bằng enzym giới hạn 46 2.2.6 Giải trình tự sản phẩm PCR 46 2.3 Theo dõi và xử lý các tính trạng số lượng 47 2.3.1 Đối với gà Ri 47 2.3.2 Đối với gà Mía 48 2.3.3 Đối với gà Hồ và gà ác 48 2.3.4 Xử lý các tính trạng số lượng 48 Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận 5 49 3.1 Cấu trúc đặc thù intron 1 của gen hormon sinh trưởng của một số 49 giống gà Việt Nam 3.1.1 Kết quả giải trình tự intron 1 của gen hormon sinh trưởng 49 3.1.2 Tính đa hình điểm cắt MspI trong intron 1 của gen hormon sinh 63 trưởng 3.1.3 Đặc điểm cấu trúc đoạn bổ sung trong gen hormon sinh trưởng 3.2 Phân tích đa hình trong intron 4 của gen hormon sinh trưởng của một 67 65 số giống gà Việt Nam 3.3 Mối liên quan giữa tính đa hình gen hormon sinh trưởng với các tính 72 trạng sản xuất của gà Ri 3.3.1 Các kiểu gen hormon sinh trưởng của gà Ri 72 3.3.2 Xác định mối liên quan của kiểu gen với các tính trạng sản xuất 74 3.3.3 ảnh hưởng của đột biến điểm đến tính trạng sản xuất của gà Ri 75 3.4 Mối liên quan giữa tính đa hình gen hormon sinh trưởng với các tính 77 trạng sản xuất của gà Mía 3.4.1 Các kiểu gen hormon sinh trưởng của gà Mía 77 3.4.2 Xác định mối liên quan của kiểu gen với các tính trạng sản xuất 79 3.4.3 ảnh hưởng của đột biến điểm đến tính trạng sản xuất của gà Mía 80 kết luận 82 tài liệu tham khảo 84 phụ lục 98 6 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Trục hormon sinh trưởng có ảnh hưởng lớn đến các quá trình sinh học, từ mức độ tế bào tới thay đổi kiểu hình cơ thể. Các gen của trục hormon sinh trưởng gây ảnh hưởng đến các chỉ số sinh lý, kiểm soát tính ngon miệng, tốc độ sinh trưởng, thành phần cấu trúc cơ thể, tuổi và khả năng sinh sản [36], [39], [22], [101] cũng như khả năng miễn dịch [76], [28], [65]. Các kết quả thu được từ các thực nghiệm chọn lọc đã chỉ ra rằng các gen của trục hormon sinh trưởng, chẳng hạn như gen hormon sinh trưởng có thể là các locut về tính trạng số lượng của vật nuôi [81]. Lợn được chọn lọc để tăng trọng nhanh và có độ dày mỡ lưng thấp thì có hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương cao [44], [24]. Bò được tiêm hormon sinh trưởng bò làm tăng sản lượng sữa [63], [61]. Schlee và cộng sự đã phát hiện ra giá trị giống về các tính trạng cho thịt khác nhau đáng kể trong các kiểu gen hormon sinh trưởng của bò [93]. Hàm lượng hormon sinh trưởng ở gà có mối liên quan tới tốc độ sinh trưởng, khối lượng cơ thể trưởng thành, tỷ lệ mỡ và` năng suất trứng [21], [33], [84], [87] . Tuy nhiên sự khác biệt về hàm lượng hormon sinh trưởng là so sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng và các gen điều hoà khác của trục hormon sinh trưởng mà chưa được biết [49]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy phân tích đa hình ADN gen hormon sinh trưởng có mối liên quan với những tính trạng sản xuất khác nhau của vật nuôi [79]. Nghiên cứu gen hormon sinh trưởng của gà, Fotouhi và cộng sự (1993) đã phát hiện được 4 điểm cắt đa hình, một điểm bằng enzym SacI và 3 điểm bằng MspI, tất cả đều nằm trong các intron. Tần số của những đoạn đa hình ở gen hormon sinh trưởng gà không chỉ liên quan tới lượng mỡ bụng của gà hướng thịt mà còn liên quan với năng suất trứng, tuổi đẻ lứa đầu và khả năng kháng bệnh của 7 gà hướng trứng [50], [69]. Sử dụng các enzym MspI và SacI phân tích đa hình ADN của gen hormon sinh trưởng gà Leghorn trắng , Feng và cộng sự (1997) đã xác định được mối liên quan giữa kiểu gen với năng suất trứng và tuổi đẻ lứa đầu, nhưng không thấy sự liên quan với khối lượng cơ thể và khối lượng trứng. Kết quả nghiên cứu của Kuhnlein và cộng sự (1997) trên gà Leghorn trắng cũng cho kết quả tương tự [48], [68]. Các kết quả trên cho thấy rằng các intron của gen hormon sinh trưởng gà chứa các dấu chuẩn di truyền ở trong liên kết không cân bằng với các locut tính trạng số lượng, hoặc ảnh hưởng trực tiếp tới các tính trạng. Trong khi đó ở nước ta chưa có tác giả nào nghiên cứu về gen hormon sinh trưởng của gà, mà các giống gà nội của chúng ta rất đa dạng và phong phú và có sự khác biệt rõ nét về khối lượng cơ thể, kiểu hình và khả năng sản xuất. Để có cơ sở khoa học đánh giá sự sai khác về khả năng sản xuất của các giống gà ở mức độ phân tử và tìm những dấu chuẩn ADN có liên quan với những tính trạng sản xuất hữu ích chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng của một số giống gà Việt Nam”. 2. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2.1. ý nghĩa khoa học Hormon sinh trưởng không chỉ ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của vật nuôi, mà còn ảnh hưởng đến các tính trạng sản xuất khác như năng suất sữa của bò, năng suất trứng của gia cầm và chất lượng thịt của lợn. Tuy nhiên sự sai khác về hàm lượng hormon sinh trưởng là do sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng và một số gen điều hoà khác. Do vậy xác định sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng của các giống gà địa phương không chỉ là cơ sở để đánh giá sự khác biệt giữa các giống ở mức độ phân tử, mà còn phân biệt sự sai khác ở từng cá thể trong mỗi giống để tìm mối liên quan với các tính trạng hữu ích. 8 2.2. ý nghĩa thực tiễn Ngày nay nhờ những kỹ thuật mới trong sinh học phân tử, các nhà chọn giống đã định hướng phương pháp chọn lọc ở mức độ phân tử dựa vào các dấu chuẩn ADN có liên quan với các tính trạng sản xuất. Sử dụng các dấu chuẩn ADN để chọn lọc đặc biệt có ích khi các tính trạng mong muốn, khó định lượng và biểu hiện theo giới tính hay biểu hiện muộn trong quá trình sống, như khả năng kháng bệnh hay năng suất trứng ở gia cầm. Do đó nghiên cứu xác định sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng của gà để tìm các dấu chuẩn ADN liên quan với các tính trạng sản xuất sẽ mở ra hướng chọn lọc sớm, góp phần nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi. 3. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Xác định sự sai khác di truyền ở gen hormon sinh trưởng của các giống gà nội, để tìm ra những sai khác đặc trưng cho từng giống có thể sẽ liên quan với kiểu hình, khối lượng cơ thể và những khả năng sản xuất của các giống gà. - Xác định các kiểu gen hormon sinh trưởng của một số giống gà để tìm mối liên quan của các kiểu gen với các tính trạng sản xuất hữu ích, mở ra triển vọng chọn lọc ở mức độ phân tử, có độ chính xác cao và rút ngắn được thời gian chọn lọc, dẫn đến nâng cao hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Để thực hiện được các mục đích trên, cần phải thực hiện các nội dung nghiên cứu sau: - Nhân ADN trong intron 1 gen hormon sinh trưởng của 4 giống gà nội: gà Ri, gà Mía, gà ác và gà Hồ và giải trình tự đoạn gen này. - Sử dụng enzym MspI phân tích đa hình ADN trong intron 1 của gen hormon sinh trưởng hai giống gà Ri và gà Mía được theo dõi khả năng sản xuất theo từng cá thể và tìm mối liên quan của các kiểu gen với các tính trạng sản xuất. 9 - Nhân ADN trong intron 4 của gen hormon sinh trưởng của 4 giống gà nội và phân tích đa hình bằng enzym SacI. CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HORMON SINH TRƢỞNG Hormon sinh trưởng là somatotropin, do thuỳ trước tuyến yên tiết ra Somatotropin kích thích sinh trưởng và tăng khối lượng cơ thể. [105, 1690]. Somatotropin có bản chất cấu tạo là protein [8,74]. 1.1.1. Sự tiết hormon sinh trƣởng Một số hormon vùng dưới đồi ảnh hưởng đến tốc độ tiết hormon sinh trưởng. Một trong số đó là TRH (thyrotropin-releasing hormone) kích thích giải phóng hormon sinh trưởng. Tốc độ tiết hormon sinh trưởng của tuyến yên còn được điều hoà bởi hai hormon vùng dưới đồi, một trong hai loại đó có tác dụng kích thích, còn loại kia thì ức chế [105, 1690]. Hormon kích thích giải phóng hormon sinh trưởng là GRF (growth hormone-releasing factor) [87], đã thu nhận được dưới dạng tương đối sạch từ vùng dưới đồi của một số loài động vật có vú, tuy nhiên nó chưa được miêu tả một cách đầy đủ. Hormon vùng dưới đồi ức chế giải phóng ra hormon sinh trưởng là somatostatin. Khi tiêm cho chuột 10 g somatostatin thì sau 15 phút giảm đáng kể hormon sinh trưởng ở trong máu. Nhưng tiêm somatostatin cho người làm giảm insulin và glucagon. Hoạt tính của somatostatin được tìm thấy ở trong tuỷ sống, dịch nhầy dạ dày, tá tràng và tuyến tụy. Trong quá trình tiết hormon sinh trưởng, AMPv thực hiện chức năng như là chất trung gian. Mô tuyến yên của chuột nuôi cấy in vitro sẽ tăng quá trình tổng hợp và giải phóng hormon sinh trưởng, khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10 những chất khác nhau để làm tăng hàm lượng AMPv trong tế bào, là do nó kích thích adenilatxiclas hoặc ức chế photphodiesteras. Ngoài ra estrogen và một trong những loại peptid truyền xung thần kinh ở não là  -endorfin cũng làm tăng giải phóng hormon sinh trưởng [105, 1691]. 1.1.2. Cấu tạo hormon sinh trƣởng Trình tự axit amin của hormon sinh trưởng ở một số loài đã được xác định. Hormon sinh trưởng của người chứa 191 axit amin [105, 1691], còn của bò chứa 217 axit amin [104, 127]. Trong khi đó hormon sinh trưởng của gà chứa 216 axit amin [98], của lợn chứa 216 axit amin 102]. Hormon sinh trưởng có thể hợp lại trong môi trường kiềm tạo thành dimer. Hoạt tính sinh học của hormon sinh trưởng có đặc điểm là đặc trưng cho loài cao. Mặc dù hormon sinh trưởng của một số loài vẫn có tác dụng khi thử nghiệm trên nhiều loài khác, nhưng chỉ có hormon sinh trưởng của loài linh trưởng có tác dụng đối với con người. Đây chính là cơ sở cho nhiều thử nghiệm phân huỷ từng phần hormon sinh trưởng của người để tách ra “nhân” không lớn mang hoạt tính sinh học, mà từ đó có thể tổng hợp được bằng hoá học. Khi thủy phân bằng plasmin thì trong phân tử hormon sinh trưởng của người phá vỡ mối liên kết giữa axit amin 134 với 135 và ngay cả giữa axit amin 140 với 141, để tạo thành phân tử chứa axit amin đầu N (đoạn 1-134) và axit amin đầu C (đoạn 141-191) được nối với nhau bởi liên kết disunfua giữa axit amin 53 với 165. Phân tử này vẫn giữ được hầu hết các hoạt tính của hormon sinh trưởng trong các thử nghiệm sinh học. Sau khi tách làm hai đoạn và thử nghiệm hoạt tính của chúng đã cho thấy nhiều hiệu ứng trao đổi chất của hormon sinh trưởng người đều xuất hiện ở cả in vitro và in vivo, ngay cả ở đoạn chứa 1-134 axit amin của hormon. Tái tổ hợp hai đoạn nhờ tác dụng tương hỗ không cộng hoá trị dẫn tới phục hồi hoàn toàn hoạt tính hormon sinh trưởng. Đoạn mang hoạt tính là peptid có phân tử lượng ít hơn 10000 [105, 1691-1692]. 11 1.1.3. Tác dụng của hormon sinh trƣởng Hormon sinh trưởng tác động cùng với nhiều hormon khác và ảnh hưởng hầu hết đến các cơ quan của cơ thể, kích thích sinh trưởng và dẫn tới cùng một thời điểm thay đổi tất cả các con đường trao đổi chất [104, 127]. Do vậy có thể tóm lược các tác dụng chủ yếu của hormon sinh trưởng như sau: * Hormon sinh trưởng có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của cơ thể bằng cách tăng tổng hợp protein ở ribosom, tăng hấp thụ Ca, P và canxi hoá xụn làm cho bộ xương phát triển, kích thích tuyến ức phát triển và tăng tiết sữa. * Hormon sinh trưởng làm giảm tổng hợp lipid, ngược lại tăng huy động mỡ dự trữ để oxy hoá tạo năng lượng, mà năng lượng này cần cho sự tổng hợp, đặc biệt là tổng hợp protein, đối với gia súc non thì tỷ lệ protein cao, lipid thấp. * Hormon sinh trưởng làm tăng đường huyết, do ức chế hoạt tính của enzym hexokinaza, mà enzym này xúc tác quá trình chuyển hoá glucoza thành glucogen dự trữ làm giảm đường huyết. * Hormon sinh trưởng kích thích gan tổng hợp chất somatomedin, chất này có nhiều chức năng sinh lý khác nhau, quan trọng nhất là tăng lắng đọng muối sulfat ở xương. * Hormon sinh trưởng kích thích tạo huyết tương và tạo hồng cầu non. Tuy nhiên trong trường hợp ưu năng và nhược năng cũng khác nhau. Khi tiết ra quá nhiều hormon sinh trưởng ở súc vật non thì gây chứng khổng lồ. Đối với vật nuôi đã trưởng thành nếu bị ưu năng sẽ dẫn đến bệnh to đầu ngón (tứ chi) và xương mặt phát triển bạnh ra, có dáng vẻ thô kệch mất cân đối. Ngược với ưu năng, nếu thiếu hormon sinh trưởng ở gia súc non sẽ bị ức chế sinh trưởng, gây lùn tí hon. Trong trường hợp này thường trí tuệ vẫn phát triển bình thường. Trường hợp lùn tí hon bẩm sinh là do gen lặn gây thiếu hormon sinh trưởng [8,74]. 12 1.1.4. Cơ chế tác dụng của hormon sinh trƣởng Hormon sinh trưởng tác dụng lên các mô cả trực tiếp và gián tiếp [105,1694]. Cơ chế tác động của hormon sinh trưởng liên quan với chất liên kết của nó, là chất nhận của tế bào chất, kết quả là dẫn đến ảnh hưởng lên quá trình phiên mã ARN [77, 316]. ở in vivo hormon sinh trưởng thúc đẩy phát triển khung xương và tổng hợp protein ở mô xương, nhưng ở in vitro hormon sinh trưởng không gây tác động ảnh hưởng lên mô xương. Tuy nhiên huyết thanh động vật bình thường hoặc đã được được tiêm hormon sinh trưởng, có hoạt tính cao thì ở in vitro nó tác động lên mô xương tương tự như hormon sinh trưởng tác động lên mô xương ở in vivo. Phân tích hiện tượng này đã khẳng định rằng tiêm hormon sinh trưởng dẫn tới làm tăng hàm lượng nhân tố kích thích sinh trưởng thứ hai được gọi là somatomedin. Hormon sinh trưởng có các tính chất miễn dịch và sinh học đặc trưng cho loài cao, nhưng chưa có kết quả về tính đặc thù cho loài của somatomedin. Gan là nguồn chính sản xuất ra somatomedin nhưng các dịch chiết suất từ mô gan, cơ, thận đều có hoạt tính somatomedin. Từ huyết tương máu người đã tách được ít nhất 6 polypeptid có hoạt tính somatomedin, tất cả chúng đều có phân tử lượng 7000. Somatomedin A1 là polypeptid trung tính (PI7), ở in vitro nó kích thích hấp thụ sulfat bằng tế bào sụn của gà. Somatomedin A2 có cùng điểm đẳng điện như A1 nhưng khác về trình tự axit amin, hoạt tính sinh học của somatomedin A1 và A2 là giống nhau. Snomatomedin B là một nhóm gồm 4 polypeptid có tính axit, kích thích sự khởi đầu tổng hợp ADN trong tế bào. Somatomedin C là polypeptid có tính kiềm (PI7,5), kích thích gắn sulfat vào proteoglican và tổng hợp ADN trong sụn chuột. Ngoài ra somatomedin C tác động lên các mô cơ, mô mỡ và cả mô sụn tương tự như insulin. Như vậy hormon sinh trưởng tác động trực tiếp lên tế bào đích cũng như gián tiếp thông qua tác động của somatomedin [105, 1694-1695]. 13 1.2. HORMON SINH TRƢỞNG VÀ SINH TRƢỞNG Ở GÀ Hormon sinh trưởng có vai trò trong điều khiển sinh trưởng và ngay cả ở các khía cạnh khác của quá trình trao đổi chất ở gà. Vai trò chính xác của hormon sinh trưởng trong điều khiển sinh trưởng chưa được thiết lập, mặc dù sự có mặt của hormon sinh trưởng trong lưu thông là cần thiết cho sự phát triển bình thường của gà nuôi cũng như các loài gia cầm khác. Hàm lượng hormon sinh trưởng của huyết tương thay đổi trong thời gian sinh trưởng và phát triển. Nó đạt mức cao ngay trong giai đoạn đầu sau khi nở, ở giai đoạn sinh trưởng nhanh và giảm đi ở giai đoạn muộn hơn của quá trình sinh trưởng và lúc trưởng thành. Hàm lượng hormon sinh trưởng của huyết tương lúc sơ sinh ở dòng gà thịt broiler sinh trưởng nhanh, cao hơn so với dòng gà trứng sinh trưởng chậm. Hơn nữa hàm lượng hormon sinh trưởng giảm dần theo lứa tuổi ở gà thịt sớm hơn so với gà hướng trứng. Tuy nhiên nâng cao hàm lượng hormon sinh trưởng không phải luôn kích thích sinh trưởng nhanh. Chẳng hạn như ở gà giảm năng tuyến giáp mà đặc trưng là sinh trưởng chậm có nghịch lý là tăng hormon sinh trưởng. ở gà hormon sinh trưởng ảnh hưởng lên trao đổi lipid, carbohydrate, protein và các tuyến nội tiết khác bao gồm tuyến tụy, tuyến giáp, tuyến thượng thận và ngay cả một số chức năng miễn dịch khác. Giải phóng hormon sinh trưởng từ tuyến yên của gà nuôi và các loài gia cầm khác cũng như ở động vật có vú, được điều khiển bằng các hormon của vùng dưới đồi là TRH, GRF và somatostatin [87] Somatomedin Môi trường HTK TƯ VD§ Somatostatin GRF Tuyến yên TRH HTKTƯ: Hệ thần kinh trung ương VDĐ: Vùng dưới đồi;HST: Hormon sinh trưởng 14 HST Sinh t r-ëng m« Hình 1.1: Giới thiệu điều hoà tiết hormon sinh trưởng và vai trò của hormon sinh trưởng trong điều khiển sinh trưởng gà (theo Scanes và cộng sự, 1984) 1.2.1. Vai trò các hormon vùng dƣới đồi trong điều tiết hormon sinh trƣởng của gà Do hormon sinh trưởng có vai trò là hormon trung tâm của trục hormon sinh trưởng [29] nên đã có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của TRH, GRF, somatostatin và kháng somatostatin đến việc tiết ra hormon sinh trưởng từ tuyến yên của gà. Burke và cộng sự (1984) đã nhận thấy sau khi cho gà uống dung dịch muối có chứa từ 10 đến 20g TRH thì lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương tăng lên trong 30 phút. Lượng hormon sinh trưởng vẫn tăng trong 120 phút khi dung dịch TRH được đưa thẳng vào diều gà nuôi với khẩu phần không hạn chế, nhưng trong một thời gian ngắn gà phải nhịn đói. Lặp lại việc đưa 200g TRH với khoảng cách 30 phút, không kéo dài được sự tăng hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương. Đưa 50 hoặc 200g TRH vào thẳng diều cùng với ngô làm tăng đột ngột lượng hormon sinh trưởng của huyết thanh trong 30 phút. Lượng hormon sinh trưởng vẫn tăng trong 90 phút sau khi đưa liều cao hơn vào, nhưng sau 120 phút thì lượng hormon sinh trưởng không có sự sai khác đáng kể với lô đối chứng [35]. Nhưng trong nghiên cứu của Burke năm 1987 cho thấy khi cho TRH vào nước uống của gà trống broiler từ 2 đến 21 ngày tuổi thì lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương ở gà 2; 7 và 14 ngày tuổi tăng lên trong 30 phút sau khi cho gà uống TRH, còn ở gà 21 ngày tuổi thì không tăng. Tiếp tục cho gà uống TRH thì không thấy ảnh hưởng đến lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương ở bất kỳ lứa tuổi nào. Mặc dù cho uống TRH không liên tục đã làm tăng đáng kể lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương ít nhất là trong 14 ngày thí nghiệm, nhưng không có ảnh hưởng gì về khối lượng cơ thể và khả năng ăn vào của gà [32]. 15 TRH có ảnh hưởng đến hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương của gà, tuy nhiên khi ta bổ sung TRH vào nước uống cho gà thì mức độ ảnh hưởng của nó không như ta tiêm. Scanes và cộng sự (1988) cho biết ở gà trưởng thành ban đầu cho uống TRH với liều 10g/kg khối lượng cơ thể làm tăng hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương, nhưng uống lần 2 và những lần tiếp theo tới lần thứ 6 thì TRH không có ảnh hưởng đến sự giải phóng hormon sinh trưởng. Nhưng khi tiêm TRH với liều 1,0g/kg khối lượng cơ thể thì hàm lượng hormon sinh trưởng vẫn tăng lên sau nhiều lần tiêm lặp lại. Tuy nhiên ở lần tiêm thứ 2 -3 thì có giảm đi, nhưng ở lần tiêm 5 - 6 tăng trở lại. Nhưng khi tiêm với liều lượng thấp 0,01g/kg khối lượng cơ thể thì ngay từ ban đầu cũng không ảnh hưởng đến hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương [89]. Tuy nhiên khi ta tiêm kết hợp cả TRH và GRF thì hiệu quả giải phóng ra hormon sinh trưởng từ tuyến yên của gà cũng khác nhau. Buonomo và cộng sự (1986) thực hiện thí nghiệm ở 3 lô gà trống 4 tuần tuổi, hàng ngày được tiêm với liều lượng như sau: 10g GRF/kg khối lượng cơ thể; 1g TRH/kg và kết hợp cả 10g GRF/kg với 1g TRH/kg, còn 2 lô đối chứng là không tiêm hoặc tiêm dung dịch muối. Sau 21 ngày thí nghiệm cả lô thí nghiệm và lô đối chứng đều được tiêm GRF, TRH hoặc GRF+TRH thì hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương tăng lên sau khi tiêm 10-90 phút ở lô đối chứng và lô thí nghiệm đã tiêm trước đó là như nhau. Tiêm kết hợp cả GRF+TRH có ảnh hưởng cộng gộp đến nồng độ hormon sinh trưởng trong huyết tương. Mặc dù làm tăng một lượng lớn hormon sinh trưởng khi hàng ngày tiêm GRF, TRH hoặc GRF+TRH trong 21 ngày nhưng không nâng cao được tốc độ tăng trọng, khă năng ăn vào và hiệu quả sử dụng thức ăn [30]. Trong khi đó Leung và cộng sự (1985) khi tiêm cho gà trống 4 tuần tuổi có khối lượng khoảng 1kg với 0,1g nhân tố giải phóng hormon sinh trưởng tuỵ người (human pancreatic growth hormone releasing factor-hp GRF); 0,1g TRH hoặc kết hợp cả hai 1g hp GRF với 0,1g TRH đã nhận thấy, so với lô đối chứng 16 không được tiêm thì hp GRF và TRH kích thích giải phóng hormon sinh trưởng lên 5-6 lần tương ứng, còn tiêm cả 2 loại hp GRF và TRH làm tăng sự giải phóng hormon sinh trưởng lên 20 lần. Kết quả này chỉ ra rằng hp GRF tác dụng trực tiếp lên tuyến yên, còn TRH tác động lên vùng dưới đồi cũng như truyến yên để kích thích giải phóng hormon sinh trưởng gà [72]. Vai trò ức chế giải phóng hormon sinh trưởng của somatostatin ở gà đã được chứng minh qua các công trình nghiên cứu của Spencer và cộng sự (1986), Scanes và cộng sự (1989) và Bunomo và cộng sự (1987). Tiêm huyết thanh kháng somatostatin cho gà trống 4 và 8 tuần tuổi làm tăng đámg kể lượng hormon sinh trưởng của máu trong 10 phút. ở gà 8 tuần tuổi lượng hormon sinh trưởng tăng nhiều hơn gà 4 tuần tuổi và vẫn tăng đáng kể sau 30 phút tiêm, nhưng ở gà 4 tuần tuổi sau 30 phút tăng không đáng kể [97]. Kết quả nghiên cứu của Scanes và Harvey (1989) cho thấy ở gà con và gà trưởng thành tiết hormon sinh trưởng đã giảm khi tiêm somatostatin với liều 3g/kg/phút. ở gà trưởng thành, sự đáp ứng của hormon sinh trưởng với TRH liều 10g/kg cũng bị ức chế tới 93% khi tiêm somatostatin với liều 3g/kg/phút và có xu hướng bị ức chế giảm 29% khi tiêm liều lượng somatostatin thấp hơn (0,3g/kg/phút). Ngược lại ở gà con thì sự giải phóng hormon sinh trưởng sau khi tiêm TRH với liều lượng 1 hoặc 10g/kg chỉ bị ức chế một phần khi tiêm somatostatin với liều 3g/kg/phút. Như vậy có thể kết luận rằng somatostatin ức chế cả GRF và TRH kích thích giải phóng hormon sinh trưởng ở gà con và gà trưởng thành [90]. Buonomo và cộng sự (1987) tiêm kháng somatostatin của dê vào tĩnh mạch cho gà trống 4 tuần và 6 tuần, kích thích tăng đáng kể hàm lượng hormon sinh trưởng trong 1 giờ sau khi tiêm [31]. 1.2.2. ảnh hƣởng của somatomedin đến sinh trƣởng ở gà 17 Trong giai đoạn phát triển phôi gà, hoạt tính somatomedin được phát hiện ở ngày ấp 13 đến 17. ở giai đoạn phát triển sau khi sinh, giai đoạn gà có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất thì hoạt tính somatomedin là cao nhất. Đây cũng là giai đoạn hàm lượng hormon sinh trưởng của huyết tương là cao nhất. Hormon sinh trưởng là chất kích thích chính để tiết somatomedin. Theo Scanes và cộng sự (1984), somatomedin có thể vận chuyển vào huyết tương khi nó được liên kết với protein, mà sự tổng hợp của protein này phụ thuộc vào hormon sinh trưởng [87]. Tuy nhiên có một số kết quả nghiên cứu cho thấy somatomedin không chỉ đơn thuần phụ thuộc vào hormon sinh trưởng mà bản thân nó cũng kích thích sinh trưởng ở gà. Hàm lượng somatomedin C của gà tăng dần theo lứa tuổi và ổn định ở 28 ngày tuổi. Tuy nhiên ở ngày tuổi 49 thì hàm lượng somatomedin C giảm dần [60]. Theo Goddard và cộng sự thì hàm lượng somatomedin C trong huyết thanh không có sự khác biệt giữa các dòng gà có tốc độ sinh trưởng khác nhau, mặc dù trong từng dòng một thì hàm lượng somatomedin C liên quan với khối lượng cơ thể [53]. Lazarus và cộng sự (1988) cho biết khi loại bỏ nguồn sản xuất hormon sinh trưởng bằng cách phẫu thuật cắt bỏ tuyến yên, sẽ giảm hàm lượng hormon sinh trưởng của huyết tương đi 95,7% trong 1 giờ, còn hàm lượng somatomedin C giảm đi 53% so với trước khi cắt bỏ tuyến yên. Điều này có thể giả thiết rằng sự giải phóng somatomedin C vào trong máu có mối liên quan mật thiết với sự có mặt của hormon tuyến yên, có thể bao hàm cả hormon sinh trưởng. Phẫu thuật tuyến yên giả, không cắt bỏ tuyến cũng làm giảm hàm lượng hormon sinh trưởng, nhưng không ảnh hưởng tới hàm lượng của somatomedin C. Tiêm thyroxin hoặc triiodothyroxin giảm hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương, nhưng không ảnh hưởng tới hàm lượng somatomedin C. Tuy nhiên tiêm glucagon hoặc insulin thì giảm cả hàm lượng hormon sinh trưởng và hàm lượng somatomedin C trong huyết tương. Kết quả này giả thiết rằng hàm lượng somatomedin C trong huyết tương không phản ánh đơn thuần tình trạng hormon sinh trưởng ở gà con [71]. 18 Năm 1987 khi nghiên cứu về hàm lượng hormon sinh trưởng và somatomedin C trong huyết thanh của gà bình thường và gà còi cọc, Huybrechts và cộng sự chỉ ra rằng ở ngày ấp nở 18 và 20 không có sự khác biệt về hàm lượng hormon sinh trưởng và hàm lượng somatomedin C trong huyết tương giữa hai loại gà trên. Sau khi nở hàm lượng somatomedin C ở gà bình thường còn ở mức như ở bào thai trong một tuần, nhưng ở gà còi (dwarf) đã giảm đi. Sau khi nở 3 tuần hàm lượng somatomedin C ở gà bình thường tăng lên đáng kể, trong khi đó thì ở gà còi nó giảm đi rất nhiều tới 18 tuần tuổi. Hàm lượng hormon sinh trưởng thấp trong khi ấp, nhưng tăng nhanh sau khi nở ở gà bình thường và gà còi. Giữa tuần 3 và tuần 18 sau khi nở hàm lượng hormon sinh trưởng trong huyết tương của gà còi cao hơn của gà bình thường, ngoại trừ ở tuần 12 thì như nhau [57]. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của Decuypere và cộng sự (1987). Các tác giả cho biết khi bổ sung 0,1% mercapto-5-methylimidazol vào thức ăn cho gà trống có khối lượng ban đầu 53  4g tới 7 tuần tuổi, làm giảm tốc độ sinh trưởng nhưng tăng mỡ. Giảm sinh trưởng của lô thí nghiệm liên quan tới giảm tuyến giáp và giảm somatomedin C, mặc dù hàm lượng hormon sinh trưởng còn cao [42]. Các kết quả trên cho thấy không chỉ có hormon sinh trưởng kích thích tiết somatomedin C, mà cả prolactin và thyroxin, triiodothyroxin cũng kích thích sản xuất somatomedin [87]. 1.2.3. ảnh hƣởng của hormon sinh trƣởng đến sinh trƣởng của gà Hormon sinh trưởng là một trong những hormon chủ yếu điều khiển sinh trưởng và thành phần cơ thể [64], do vậy nhiều nhà nghiên cứu đã thử nghiệm đưa hormon sinh trưởng từ bên ngoài vào vật nuôi để xác định mức độ ảnh hưởng của hormon sinh trưởng đến sinh trưởng của gà. Tuy nhiên kết quả không phải luôn như mong muốn. Scanes và cộng sự (1986) phẫu thuật cắt bỏ tuyến yên ở gà đang lớn, nhận thấy giảm, khối lượng cơ thể và sự phát triển của khung xương, khối lượng và 19 chiều dài xương chày, hàm lượng axit béo trong huyết tương, khối lượng tim, gan, ngực, tuyến ức. Nhưng tiêm hormon sinh trưởng gà với liều 100g/kg khối lượng cơ thể cho gà đã cắt bỏ tuyến yên thì kích thích sinh trưởng cùng với tăng chiều dài xương chày, khối lượng tuyến ức và hàm lượng axit béo trong huyết tương. Gà trống vẫn giữ nguyên tuyến yên chỉ cần tiêm hormon sinh trưởng gà với liều 10g giữa 1 và 14 ngày tuổi thì ở các ngày tuổi 31;38 và 44 khối lượng cơ thể đều tăng, nhưng không đáng kể [88]. Kết quả của Leung và cộng sự (1986) cho thấy hormon sinh trưởng gà đã được tinh khiết, hàng ngày tiêm vào tĩnh mạch gà trống 4 tuần tuổi với các liều lượng 5, 10 và 50g trong 14 ngày thì khối lượng cơ thể của gà được tiêm 5 và 10g hormon sinh trưởng gà tăng lên đáng kể ở ngày thứ 6 và tương ứng là 13,5% và 11,2% so với đối chứng. ở ngày 14 thì khối lượng cơ thể tăng lên 8,1% và 7,7% so với đối chứng, nhưng không có ý nghĩa sai khác. Gà được tiêm hormon sinh trưởng với liều 50g có sự kích thích sinh trưởng nhưng không nhiều. Nói chung tiêm hormon sinh trưởng gà kích thích tạm thời tốc độ sinh trưởng ở gà [73]. Điều này cũng được khẳng định trong nghiên cứu của Cravener và cộng sự (1989). Theo Cravener tiêm hormon sinh trưởng gà dưới da cho gà mái 2 tuần tuổi không có ảnh hưởng đáng kể đến các thông số sinh trưởng so với đối chứng. Sự sai khác về khă năng ăn vào, tăng khối lượng cơ thể thực, hiệu quả sử dụng thức ăn và thành phần thân thịt là không có ý nghĩa ở lô thí nghiệm. Sau khi tiêm, hàm lượng hormon sinh trưởng của huyết tương tăng lên 3 - 4 lần. Điều này chỉ ra rằng tăng hàm lượng hormon sinh trưởng trong 24 giờ là sự đáp ứng với liều lượng sinh lý của hormon sinh trưởng gà từ bên ngoài, không gây ảnh hưởng tới sinh trưởng của gà con và sự phát triển nhanh của gà thịt [40]. Tuy nhiên trong cơ thể thì hormon sinh trưởng được tiết ra từ thuỳ trước của tuyến yên theo “nhịp” (pulsatile). Do vậy các nghiên cứu cũng đã thử nghiệm phương thức tiêm hormon sinh trưởng gà khác nhau. Vasilatos-Younken cho biết gà mái 8 tuần tuổi được tiêm hormon sinh trưởng gà theo “nhịp” nâng cao hiệu quả 20 sử dụng thức ăn, tăng khối lượng và phát triển chiều dài xương, giảm lượng mỡ bụng và lipid toàn cơ thể, làm to gan, tăng somatomedin C và triiodothyroxin nhưng giảm thyroxin trong huyết tương. Ngược lại tiêm hormon sinh trưởng gà liên tục (continuous) vào tĩnh mạch làm giảm sút đáng kể hiệu quả sử dụng thức ăn và không có ảnh hưởng đáng kể đến mỡ bụng, kích thước của gan và lipid của toàn cơ thể nhưng tăng khối lượng xương so với đối chứng. Kiểu tiêm hormon sinh trưởng từ ngoài rõ ràng là nhân tố ảnh hưởng đến bản chất của sự đáp ứng với hormon [100]. Tiêm hormon sinh trưởng gà theo nhịp cho gà mái 11 tuần tuổi Cravener và cộng sự (1990) nhận thấy: giảm tỷ lệ ADN của gan với khối lượng tươi, ADN với protein và ADN với ARN so với đối chứng. Toàn bộ tỷ lệ ARN với gan và khối lượng gan cao hơn đáng kể so với đối chứng. Tiêm hormon sinh trưởng gà theo kiểu liên tục làm giảm tỷ lệ ADN với protein, tăng khối lượng protein của gan so với đối chứng cơ thể là do phì đại tế bào. Khối lượng và thành phần của gan không bị ảnh hưởng khi tiêm hormon sinh trưởng theo kiểu liên tục [41]. Theo Vasilatos-Younken (1992) thì hormon sinh trưởng không có tác dụng rộng, lâu dài và ổn định để kích thích sinh trưởng hay biến đổi quá trình trao đổi chất ở giai đoạn sớm sau khi nở. Mặc dù ở giai đoạn này gà con có tốc độ sinh trưởng nhanh nhưng không xuất hiện sự đáp ứng với tăng hormon sinh trưởng. Hàm lượng hormon sinh trưởng cao trong huyết tương có thể được điều chỉnh xuống bởi chất nhận hormon của mô đích ở gà con, khiến cho hormon sinh trưởng của con vật không nhạy. Có giả thiết cho rằng khi hàm lượng hormon sinh trưởng thấp thì một phân tử hormon sinh trưởng sẽ bao bọc 2 đơn vị hormon sinh trưởng - chất nhận, tạo thành dimer hormon sinh trưởng - chất nhận có hoạt tính. Còn khi hormon sinh trưởng có hàm lượng cao thì sự tạo dimer bị ngăn cản bởi vì sự chiếm giữ tất cả các vị trí bao bọc bằng các phân tử hormon sinh trưởng riêng biệt, mỗi một phân tử sẽ chiếm lấy một vị trí, có nghĩa là 2 phân tử hormon sinh trưởng sẽ bao bọc 2 đơn vị hormon sinh trưởng -chất nhận và kết quả là tạo ra hormon sinh 21 trưởng - chất nhận bất hoạt. Giai đoạn muộn hơn sau khi nở thì hormon có tác dụng dương tính đáng kể đến quá trình sinh trưởng, như tăng tốc độ sinh trưởng ở dòng gà trống broiler được tiêm hormon sinh trưởng gà ở tuần tuổi 12-16. Gà trống từ 8 - 12 tuần tuổi và 12 - 16 tuần tuổi được tiêm hormon sinh trưởng gà thì tăng khối lượng cơ ngực. Tiêm hormon sinh trưởng gà cho gà mái ở tuần tuổi 8 11 thì tăng tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và thành phần thân thịt [101]. Để tìm hiểu về sự sai khác di truyền của hormon sinh trưởng và mối liên kết di truyền của chúng với sinh trưởng ở gà con, Scott và Washburn đã tiến hành theo dõi tốc độ sinh trưởng ở năm dòng gà giao phối ngẫu nhiên từ lúc nở tới 7 ngày tuổi cho thấy mối tương quan di truyền của hàm lượng hormon sinh trưởng với khối lượng cơ thể và tăng trọng hàng ngày là không đáng kể [94]. 1.3. HORMON SINH TRƢỞNG TÁI TỔ HỢP Do vai trò chính của hormon sinh trưởng là kích thích sinh trưởng, nên nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành sử dụng hormon sinh trưởng tách từ tuyến yên của động vật để tiêm cho vật nuôi, nhằm kích thích sinh trưởng và khả năng sản xuất của chúng. Tuy nhiên tách hormon sinh trưởng từ tuyến yên giá thành quá cao, nên người ta đã ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp để sản xuất hormon sinh trưởng của động vật qua vi khuẩn bằng cách dùng plasmid làm vector, chuyển gen hormon sinh trưởng của động vật vào vật chủ là vi khuẩn, biến vi khuẩn thành nhà máy sản xuất khối lượng lớn hormon sinh trưởng động vật 9,175. Kết quả thực nghiệm cho thấy ở mỗi đối tượng vật nuôi khác nhau, thì mức độ ảnh hưởng của hormon sinh trưởng tái tổ hợp tới khả năng sản xuất cũng rất khác nhau. Tiêm hormon sinh trưởng lợn tái tổ hợp cho lợn thịt có khối lượng từ 60 100kg, tăng tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ nạc trong thân thịt. Nhưng lợn thịt có khối lượng 100 - 140 kg được tiêm hormon sinh trưởng lợn tái tổ hợp, tăng khả năng ăn vào, tăng khối lượng cơ quan nội tạng và giảm chất 22