Tài liệu Nghiên cứu sự phát triển của trứng dê trong ống nghiệm tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -------
 ------- GIANG HOÀNG HÀ NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA TRỨNG DÊ TRONG ỐNG NGHIỆM TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyªn ngµnh : Thó y M· sè : 60.62.50 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: ts. NguyÔn h÷u ®øc Khoa Công nghệ sinh học – Trường ðHNN Hà Nội Hµ Néi - 2011 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kì công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Giang Hoàng Hà Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hữu ðức, Phó Trưởng Khoa Công nghệ sinh học – Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tận tình hướng dẫn, góp ý và giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin chân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Văn Thanh, Trưởng Bộ môn Ngoại Sản – Khoa Thú y và toàn thể các Thầy, Cô giáo thuộc Bộ môn Ngoại Sản, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội nơi tôi ñăng ký sinh hoạt ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ, cung cấp thông tin cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu ñể hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô giáo và anh chị em kỹ thuật trong phòng thí nghiệp của Khoa Công nghệ sinh học ñã hướng dẫn và giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài trong phòng thí nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ nhiệt tình của ông Nguyễn Văn Võ, chủ lò mổ dê thuộc quận Long Biên, Hà Nội và toàn thể anh chị em công nhân của lò mổ trong việc lấy mẫu trứng dê phục vụ nghiên cứu. Tôi xin chân trọng cảm ơn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện ðào tạo Sau ñại học, các Thầy, Cô giáo Khoa Thú y ñã tạo ñiều kiện, ủng hộ và giúp ñỡ trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin trân thành cảm ơn sự hậu thuẫn, tạo ñiều kiện và giúp ñỡ, ñộng viên về mọi mặt của gia ñình và bạn bè trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Giang Hoàng Hà Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. ii Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT COCs Cumulus Oocyte Complexes cs cộng sự EGF Epidermal Growth Factor EGS Estrous Goat Serum FBS Fetal Bovine Serum FCS Fetal Calf Serum FF Follicular Fluid FSH Follicular Stimulating Hormon GH Gonadotropin Hormon HCG Human Chorionic Gonadotropin IVC In Vitro Culture IVF In Vitro Fertilization IVM In Vitro Maturation LH Luteinizing Hormon MI, MII Metaphase I, II PBS Phosphate Buffered Saline PRL Prolactin TCM199 Tissue Culture Medium 199 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. iv MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN ...............................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...............................................................iv MỤC LỤC..........................................................................................................v DANH MỤC BẢNG....................................................................................... vii DANH MỤC BIỂU ðỒ ................................................................................. viii PHẦN 1. MỞ ðẦU ...........................................................................................1 1.1. Mục tiêu và cách tiếp cận của ñề tài ...........................................................4 1.2. Tính cấp thiết của ñề tài ..............................................................................5 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................7 2.1. ðặc ñiểm và khả năng sinh sản của con dê.................................................7 2.2.Các yếu tố trong việc nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm ................11 2.2.1. ðiều kiện nuôi ........................................................................................11 2.2.2. Môi trường nuôi .....................................................................................12 2.2.3. Các chất bổ sung vào môi trường nuôi ..................................................13 2.3. Một số phương pháp sử dụng ñể nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm.... 18 2.3.1. Các phương pháp khai thác trứng ..........................................................18 2.3.2. Phân loại chất lượng trứng .....................................................................20 2.3.3. Phương pháp nuôi trứng in vitro và ñánh giá sự thành thục..................22 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước...............................................24 2.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ..........................................................24 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước...........................................................30 PHẦN 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..32 3.1. ðối tượng và nội dung, ñịa ñiểm nghiên cứu............................................32 3.1.1. ðối tượng và phạm vi nghiên cứu..........................................................32 3.1.2. Nội dung nghiên cứu..............................................................................32 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. v 3.1.3. ðịa ñiểm nghiên cứu ..............................................................................32 3.2. Phương pháp nghiên cứu...........................................................................33 3.2.1. Tiêu chí lựa chọn phương pháp..............................................................33 3.2.2. Thu và bảo quản buồng trứng dê Cỏ......................................................33 3.2.3. Thu trứng từ buồng trứng.......................................................................33 3.2.4. Nuôi thành thục trứng in vitro................................................................34 3.2.5. Phân tách lớp tế bào cumulus.................................................................36 3.2.6. ðánh giá sự thành thục của trứng dê......................................................37 3.2.7. Xử lý số liệu ...........................................................................................37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................38 4.1. Nghiên cứu các ñiều kiện thích hợp ñể thu và bảo quản buồng trứng..38 4.2. Nghiên cứu khả năng khai thác trứng dê từ buồng trứng .........................40 4.3. Nghiên cứu phân loại, ñánh giá và nâng cao chất lượng trứng dê trước và sau nuôi in vitro................................................................................................41 4.3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ enzym Hyaluronidaza.....................................43 4.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường......................................................45 4.3.3. Ảnh hưởng của tác ñộng cơ học ñến thời gian xử lý với enzym Hyaluronidaza ..................................................................................................46 4.3.4. Biến ñộng của thời gian làm sạch các lớp tế bào cumulus ....................48 4.4. Nghiên cứu sự ảnh hưởng của FSH và nồng ñộ khí CO2, O2 trong tủ nuôi ñến trứng dê nuôi trong ñiều kiện in vitro. ......................................................50 4.4.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ FSH.................................................................50 4.4.2. Ảnh hưởng của nồng ñộ Oxy .................................................................54 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ............................................................57 5.1. Kết luận .....................................................................................................57 5.2. ðề nghị ......................................................................................................57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................58 PHỤ LỤC ........................................................................................................65 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ bảo quản ñến tỉ lệ trứng dê thành thục in vitro...............................................................................................38 Bảng 2 : Mức ñộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong môi trường TCM199-Hepes có nồng ñộ enzym Hyaluronidaza khác nhau........44 Bảng 3: Mức ñộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong TCM199-Hepes có bổ sung enzym Hyaluronidaza tại các nhiệt ñộ khác nhau..........45 Bảng 4: Kết quả tách lớp tế bào cumulus bằng cách kết hợp sử dụng enzym Hyaluronidaza và tách cơ học ở các khoảng thời gian khác nhau ..........................................................................................47 Bảng 5. Thời gian xử lý enzym ñể tách các lớp tế bào cumulus ...................49 Bảng 6. Tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong môi trường TCM199 với các nồng ñộ FSH khác nhau .......................................................52 Bảng 7. Tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong hai môi trường có nồng ñộ oxy khác nhau.....................................................................54 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. vii DANH MỤC BIỂU ðỒ Biểu ñồ 1: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ bảo quản ñến tỉ lệ trứng dê thành thục in vitro..................................................................................39 Biểu ñồ 2. Mức ñộ phân rã trung bình của lớp tế bào cumulus trong môi trường TCM199-Hepes có nồng ñộ enzym Hyaluronidaza khác nhau.....................................................................................44 Biểu ñồ 3. Mức ñộ phân rã của lớp tế bào cumulus trong TCM199Hepes có bổ sung enzym Hyaluronidaza tại các nhiệt ñộ khác nhau.....................................................................................46 Biểu ñồ 4: Kết quả tách lớp tế bào cumulus bằng cách kết hợp sử dụng enzym Hyaluronidaza và tách cơ học ở các khoảng thời gian khác nhau.....................................................................................47 Biểu ñồ 5: Thời gian xử lý enzym ñể tách các lớp tế bào cumulus ..............49 Biểu ñồ 6. Tương quan tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong môi trường TCM199 với các nồng ñộ FSH khác nhau ......................53 Biểu ñồ 7. Tương quan tỷ lệ thành thục của trứng dê nuôi trong hai ñiều kiện oxy khác nhau......................................................................55 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. viii PHẦN 1. MỞ ðẦU Chăn nuôi dê ñã ñược chú trọng phát triển từ rất lâu trên thế giới. Từ khoảng 2000 – 6000 năm trước công nguyên ở vùng núi Tây Á, dê ñã ñược con người thuần hóa từ dê rừng (Nguyễn ðình Rao và cs, 1979) nhằm mục ñích cung cấp thịt, lông, da…Con dê ñã gắn bó với người nông dân từ rất lâu ñó cho ñến nay vẫn ñược coi là con vật của người nghèo bởi lẽ chúng là loài “ ăn lá cây, uống nước lã và hít khí trời” (Nguyễn Văn Thanh). Chăn nuôi dê không những ít vốn mà còn dễ chăm sóc bởi lẽ chúng rất ít bị bệnh, dễ thích nghi mà sản phẩm bán ra lại khá ñược giá. Theo thống kê năm 2004 của FAO cho biết: sản lượng thịt các loại của toàn Thế giới ñạt 249.851.017 tấn, sản lượng thịt dê ñạt 4.0910190 tấn (chiếm 1,64 % tổng sản lượng). Khu vực các nước ñang phát triển là nơi sản xuất nhiều thịt dê nhất (3.903.357 tấn - chiếm 95,4% tổng sản lượng), tập trung chủ yếu ở Châu Á (3.003.742 tấn - chiếm 73,42%). Nước cung cấp nhiều thịt dê nhất là Trung Quốc (1.518.081 tấn), Ấn ðộ (473.000 tấn), Pakistan (373.000 tấn). Sản lượng sữa các loại trên toàn Thế giới ñạt 600.978.420 tấn, trong ñó sữa dê là 11.816.315 tấn (chiếm 1,97%), tập trung ở các nước ñang phát triển (9.277.942 tấn - 78,52%), ñứng ñầu là Ấn ðộ (2.610.000 tấn), Bangladesh (1.312.000 tấn), Pakistan (1.312.000 tấn). Thế giới còn cung cấp 824.654 tấn da (trong ñó Châu Á, Nam Thái Bình Dương ñóng góp 421.673 tấn - chiếm 51,13%), 103.210 tấn lông. Hiện nay, Ủy ban thịt và gia súc Anh cho biết, sức tiêu thụ thịt trên thế giới sẽ tăng 35% từ năm 2000 ñến năm 2010 do số người tiêu thụ thịt tăng lên 2,7 tỷ vào năm 2010, tập trung ở các nước ñang phát triển. Tiêu thụ thịt dê, cừu dự ñoán sẽ tăng lên trong các nước E.U trong khi tiêu thụ thịt bò, gia cầm và thịt lợn lại giảm xuống[16]. Trong khi ñó ở Việt Nam, mặc dù ñiều kiện thời tiết, khí hậu và môi trường ở ñây rất thuận lợi cho việc chăn nuôi dê và tuy dê cũng ñã ñược nuôi Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 1 từ rất lâu nhưng ñều mang tính chất nhỏ lẻ, manh mún và tự phát. Giống dê chỉ ñơn ñiệu có 2 loài là dê ñịa phương (dê Cỏ) và dê Bách thảo. Mãi ñến năm 1991 mới ñược quan tâm nghiên cứu. Những năm gần ñây ngành chăn nuôi dê nước ta ñã tăng cả về mặt số lượng và chất lượng, thịt dê ñược xem là loại thức ăn có giá trị dinh dưỡng cao, hàm lượng cholesterol thấp (dê cỏ: 167,66±1,45 mg/100g thịt, dê lai Cỏ x Bách thảo: 125±2,88 mg/100g, dê Boer x F1 (Bách thảo x Cỏ): 115±2,88 mg/100g (Nguyễn Bá Mùi, 2011) rất tốt cho sức khỏe của con người. Sự tăng giá thịt dê hơi trên thị trường do nhu cầu, thị hiếu người tiêu dùng trong nước ñang ngày càng tăng, năm 1996 giá thịt hơi chỉ 8000 ñ/kg, ñến năm 2003 ñã tăng lên 23.000ñ/kg (cao hơn gần gấp ñôi so với thịt lợn (11.000 - 12.000 ñ/kg thịt hơi) và ñến năm 2005 giá thịt dê lên ñến 35.000 ñ/kg. Năm 2010, Nguyễn Bá Mùi ñiều tra tại Yên Bái cho thấy, giá thịt dê hơi tăng từ 45000 ñ/kg tới 60000 ñ/kg. ðến năm 2011 tăng lên 70000 ñ/kg, trong khi ñó giá lợn hơi năm 2010 nằm trong khoảng 30000 – 35000 ñ/kg, năm 2011 nằm trong khoảng 40000 – 50000 ñ/kg (Nguyễn Bá Mùi, 2011). Tại Ninh Bình năm 2011, giá dê hơi ñã tăng lên 100000 ñ/kg. Tập quán sử dụng sản phẩm từ chăn nuôi dê (thịt, sữa) ñã ñược hình thành. Nhu cầu tiêu thụ về sữa tươi cũng ñược tăng lên vì sữa dê ñã ñược khoa học và người tiêu dùng công nhận giá trị cao về dinh dưỡng, giá của sữa dê năm 2001 là 7000 ñồng/lít (cao hơn sữa bò 3000 ñồng/lít).. Hiện tại giá sữa dê là 16.000 ñồng/lít (Hà Nội) và 20.000 ñ/lít (TP. Hồ Chí Minh) (cao hơn sữa bò 9.000 – 13.000ñ/lít). ðây là ñộng lực mới, mạnh ñể thúc ñẩy mạnh tiến trình cải tạo ñàn, tăng qui mô ñàn, số lượng ñàn và công nghệ chế biến sản phẩm[16]. Tuy vậy, ngành chăn nuôi dê ở nước ta vẫn còn nhỏ lẻ, chưa thực sự xứng tầm với tiềm năng của nó. Về vấn ñề ứng dụng công nghệ sinh học trong chăn nuôi, trên thế giới cũng như ở Việt Nam ñang tập chung sức lực lớn vào vấn ñề này và ñã gặt hái Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 2 ñược rất nhiều thành công. ðã có nhiều sản phẩm ñộng vật ñược tạo ra, mở màn là sự ra ñời của chú thỏ năm 1959 bằng phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm. Sau ñó là việc ra ñời của cô bé người Anh: Louise Brown, sinh ngày 25/7/1978 do Robert Edward thực hiện thụ tinh ống nghiệm. Công nghệ sinh học cũng ñã mang lại những thành công lớn trong lĩnh vực y học (y sinh học), nhờ công nghệ sinh học mà con người ñã có thể sử dụng ñộng vật như các nhà máy sản xuất protein dược phẩm phục vụ cho ngành y (có thể sản xuất hàng loạt các loại kháng thể ñặc hiệu chống lại một số bệnh nguy hiểm như bệnh dại, bệnh uốn ván…), có thể giúp ñỡ những người không có khả năng có con có thể có con. Hơn nữa, con người cũng có thể tạo ra các mô bào có khả năng thay thế từ chính cơ thể vật chủ ñó dựa vào việc biệt hóa các mô tế bào gốc lấy từ máu, dây rốn…ñể sử dụng khi cần thiết ñảm bảo sự an toàn cao. Cũng nhờ công nghệ này mà con người có thể bảo tồn và nhân nhanh các nguồn gen quý phục vụ công tác bảo tồn (ñộng vật sắp bị tuyệt chủng) và sản xuất (các cá thể ñộng vật có năng suất cao), cho ra các sản phẩm có chất lượng cao (sữa có hàm lượng ñạm cao…), số lượng nhiều và giá thành hạ. ðộng vật chuyển gen ñược tạo ra với các mục ñích khác nhau là nguồn nguyên liệu không thể thiếu ñể cung cấp cho ngành y dược phẩm phục vụ con người. Vì những lý do trên mà việc tạo ra các trang trại y sinh học (Biomedical farm) trên thế giới cũng như ở Việt Nam là rất cần thiết. Ở Việt Nam những năm gần ñây, công nghệ sinh học mà ñặc biệt là công nghệ phôi cũng ñã ñược chú trọng nghiên cứu và cũng ñã cho ra ñời ñược rất nhiều thành tựu như việc tạo ra ñược 6 bê thụ tinh ống nghiệm từ công nghệ nuôi cấy phôi năm 2005 (Nguyễn Hữu ðức, 2005), tạo ra thỏ chuyển phôi năm 1979, chuột bạch chuyển phôi năm 2004[17]. Công nghệ phôi trên con dê ở Việt Nam chỉ có rất ít tác giả ñề cập tới, Nguyễn Hữu ðức và cs ñã thành công trong quá trình sử dụng enzym Hyaluronidaza kết hợp với dùng phương pháp cơ học ñể Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 3 tách các lớp tế bào cumulus ra khỏi trứng dê ñã ñược nuôi thành thục (Nguyễn Hữu ðức và cs, 2011). Chính vì vậy, vấn ñề nghiên cứu công nghệ phôi trên dê vẫn ñang rất sơ khai. Dê là ñộng vật ña thai (thường ñẻ sinh ñôi), bình quân 1,48 (dê cỏ) và 1,66 (dê lai) (Nguyễn Bá Mùi, 2011). Khả năng sinh sản nhanh (150,42 – 151,24) (Nguyễn Bá Mùi, 2011), dễ chăm sóc, nuôi dưỡng, chi phí ñầu tư thấp, ít bệnh tật (Hồ Quảng ðồ), nên ñây là một con vật rất có tiềm năng trong việc nghiên cứu công nghệ sinh sản ở Việt Nam. Việc nghiên cứu công nghệ sinh sản trên dê bao gồm: Gây ñộng dục ñồng pha, thu trứng dê, trưởng thành trong ống nghiệm, thụ tinh ống nghiệm, nuôi phôi, cấy truyền phôi vào tử cung con nhận phôi. Thực tế ở Việt Nam có rất ít nghiên cứu về công nghệ sinh sản trên con dê nên bước ñầu tiên là việc trưởng thành trứng dê trong ống nghiệm, ñây là bước cần thiết ñể phục vụ các bước tiếp theo trong quy trình ñầy ñủ vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu sự phát triển của trứng dê trong ống nghiệm tại Việt Nam”. Trong phạp vi nghiên cứu của ñề tài, tác giả chỉ tập chung vào nghiên cứu, xây dựng và chuẩn hóa quy trình và những kỹ thuật liên quan ñể nuôi thành thục ñược trứng dê trong ống nghiệm. 1.1. Mục tiêu và cách tiếp cận của ñề tài 1.1.1. Mục tiêu chung Nghiên cứu công nghệ sinh học sinh sản với ñối tượng là trứng dê làm cơ sở cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của công nghệ thụ tinh ống nghiệm, tạo phôi nhân bản tại Việt Nam. 1.1.2. Mục tiêu cụ thể • Xây dựng phương pháp thu, bảo quản và vận chuyển an toàn buồng trứng dê với yêu cầu ñảm bảo sức sống của trứng và tránh nhiễm khuẩn. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 4 • Xây dựng phương pháp khai thác trứng ổn ñịnh từ buồng trứng, nuôi in vitro trứng dê từ giai ñoạn bóng mầm (Germinal Vesicle) phát triển ñến giai ñoạn thành thục (Metaphase II) với tỷ lệ ñạt từ 50 ñến 60%. 1.1.3. Cách tiếp cận Lý thuyết và phương pháp tiếp cận theo chuẩn của các phòng thí nghiệm chuyên sâu về công nghệ sinh học ñộng vật của thế giới như Viện Nông học Quốc gia (Cộng Hoà Pháp), ðại học Wisconsin Madison (Mỹ), ðại học Connecticut (Mỹ). 1.2. Tính cấp thiết của ñề tài Trong khi các nước phát triển (Mỹ, Pháp, ðức, Nhật Bản…), ñang phát triển (Trung Quốc, Hàn Quốc…), thậm chí những nước xung quanh ta như Thailand, Indonesia, Malaysia… ñều ñang ñầu tư mạnh mẽ nhằm phát triển công nghệ sinh học ñộng vật, thì tình hình này ở nước ta ñang còn ở dạng ñầu tư nhỏ giọt, không có ñịnh hướng lâu dài hoặc ñầu tư phân tán. Chính vì vậy, có thể nói, công nghệ sinh học ñộng vật nước ta còn ở “ vùng trũng gần ñáy” của thế giới. Trong hai thập kỷ qua, công nghệ sinh học ñộng vật nước ta với sự trợ giúp của quốc tế, cũng có một số thành tựu về cấy chuyển phôi bò, thụ tinh ống nghiệm….nhưng kết quả ñều khu trú ở các phòng thí nghiệm hoặc các ñề tài nhỏ lẻ. Gần ñây, khi Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì Chương trình trọng ñiểm về phát triển công nghệ sinh học (tầm nhìn ñến năm 2020), thì mới có 02 ñề tài liên quan công nghệ sinh học sinh sản ở bò và lợn ñược tiến hành (bắt ñầu từ năm 2007). Tuy nhiên, lực lượng và kết quả mong ñợi cũng còn khiêm tốn. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 5 Trong xu thế ñào tạo và phát triển nghiên cứu tại các trường ñại học, Bộ Giáo dục và ðào tạo ñã ưu tiên ñầu tư cho Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội một dự án về phát triển và ñào tạo nhân lực, khả năng nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học (dự án bắt ñầu từ năm 2007). Mới ñây, Khoa Công nghệ sinh học của Trường cũng ñã ñược thành lập, quy tập ñược ñội ngũ các giảng viên và nghiên cứu viên có khả năng nghiên cứu chuyên sâu từ các ñơn vị trong và ngoài trường. Lực lượng này ñủ khả năng tiếp cận và triển khai các nghiên cứu ở trình ñộ cao trong công nghệ sinh học ñộng vật như thụ tinh ống nghiệm và nhân bản, chuyển gen, tế bào gốc… Với những ưu thế về nhân lực, về ñầu tư cho Chương trình công nghệ sinh học của Bộ Giáo dục thời gian qua và ñịnh hướng khoa học công nghệ của Nhà trường, Tôi ñã ñăng ký thực hiện ñề tài này dưới sự hướng dẫn và chỉ bảo của các thầy cô Khoa Thú y kết hợp với các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và tin tưởng các nghiên cứu triển khai không những có giá trị về mặt khoa học công nghệ mà còn góp phần thiết thực cho việc ñào tạo ñội ngũ cán bộ nghiên cứu có trình ñộ khu vực trong lĩnh vực công nghệ sinh học ñộng vật, góp phần thực hiện tốt mục tiêu và kế hoạch của ñề án 322 mà Bộ Giáo dục ñang triển khai. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 6 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ðặc ñiểm và khả năng sinh sản của con dê ðể ñánh giá khả năng sinh sản của dê cái, người ta thường dựa vào một số chỉ tiêu sau: Tuổi ñẻ lứa ñầu Tuổi ñẻ lứa ñầu là một chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật quan trọng, phản ánh thời gian ñưa con vật vào khai thác sớm hay muộn. Nó ñược tính từ khi con vật sinh ra ñến ngày ñẻ lứa ñầu tiên. Tuổi ñẻ lứa ñầu chủ yếu phụ thuộc vào tuổi thành thục (cả về tính và về thể vóc), ñồng thời còn phụ thuộc vào việc phát hiện ñộng dục và kỹ thuật phối giống. Ngoài ra, nó còn liên quan ñến ñiều kiện ngoại cảnh, di truyền, chế ñộ chăm sóc... Tuổi ñẻ lứa ñầu của dê Ấn ñộ là: dê Barbari: 398,6 ngày; dê Jumnapari: 581,3 ngày; dê Beetal: 556,4 ngày. Trong khi ñó dê Ấn ðộ nuôi ở Sông Bé lần lượt là: 415,6 ngày; 535,4 ngày; 547,1 ngày. Theo (S.N Sing và P.S Sengar, 1985) cho biết, ở dê Beetal có tuổi ñẻ lứa ñầu là 675 ngày, dê Jumnapari là 735ngày, dê Black Bengan là 483 ngày. (ðặng Xuân Biên, 1979) thông báo tuổi ñẻ lứa ñầu của dê Cỏ Việt Nam là 300 ngày, (Lê Văn Thông, 2005) cho là 336,4 ngày. Tuổi ñộng dục lần ñầu Tuổi ñộng dục lần ñầu là khi dê cái ñã thành thục chức năng sinh dục và xuất hiện sự ham muốn giao phối lần ñầu. Tuổi ñộng dục lần ñầu ñược tính bằng ngày hoặc tháng tuổi. Theo (ðinh Văn Bình, 1998) công bố, tuổi ñộng dục lần ñầu trên dê Ấn ðộ lần lượt là: dê Barbari là 313,1 ngày; dê Jumnapari là 406,5 ngày và dê Beetal là 372,7 ngày. (Lê Văn Thông, 2005) theo dõi ở Thanh Hóa cho biết, dê Cỏ có tuổi ñộng dục lần ñầu là 176,81 ngày, theo (Mai Hữu Yên, 1998) ở Thái Nguyên là 198,3 ngày. Trong chăn nuôi, khi dê cái ñộng dục nên bỏ qua chu kì ñộng dục ñầu tiên, tốt nhất cho dê cái phối ở 2 - 3 chu kì ñộng dục sau ñể ñảm bảo sức khỏe cho dê cái và ñời con của chúng. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 7 Tuổi phối giống lần ñầu Chỉ tiêu này chủ yếu do người chăn nuôi quyết ñịnh. Mặc dù dê hậu bị có tuổi ñộng dục lần ñầu sớm là 5 - 7 tháng nhưng ñến 7 - 8 tháng tuổi mới cho phối giống, khi ñó dê ñạt khoảng 70% khối lượng trưởng thành. Theo tác giả (ðinh Văn Bình, 1998) cho biết, tuổi phối giống lần ñầu trên dê Ấn ðộ như sau: dê Barbari là 246,5 ngày; dê Jumnapari là 415,3 ngày và dê Beeltal là 401,3 ngày. Còn ở dê Bách Thảo là 202,81 ngày (từ 165-255 ngày): vào khoảng 7 - 8 tháng tuổi, (ðinh Văn Bình, 1994) và (Lê Văn Thông, 2005) theo dõi trên dê Cỏ thông báo: dê Cỏ có tuổi phối giống lần ñầu là 186,26 ngày, (ðinh Văn Bình và Nguyễn Duy Lý, 2003) cho biết, dê Cỏ có tuổi phối giống lần ñầu là 140 - 200 ngày. Chu kì ñộng dục Chu kì ñộng dục là thời gian hoạt ñộng sinh dục xuất hiện một cách ñều ñặn và có tính chu kì. Chu kì ñộng dục của dê khoảng 19 - 21 ngày, ñộng dục kéo dài 1 - 3 ngày. Những biểu hiện khi ñộng dục: âm hộ hơi sưng ñỏ hồng, chảy dịch nhờn, kêu la, bỏ ăn, nhảy lên lưng con khác, nếu dê ñang tiết sữa thì giảm ñột ngột. Thời gian cho dê giao phối sau 16 - 38 giờ phát hiện ñộng dục là tốt nhất. Trong thực tế chăn nuôi, nếu phát hiện ñộng dục ngày hôm nay thì ngày hôm sau cho phối 2 lần sáng, chiều là phù hợp. Các tác giả theo dõi trên dê Ấn ðộ thấy chu kì ñộng dục như sau: dê Barbari: 26,2 ngày; dê Jumnapari 27,29 ngày; dê Beeltal là 18,03 ngày. Dê Cỏ có chu kì ñộng dục là 22,35 ngày (Lê Văn Thông, 2005), 20,35 ngày (Mai Hữu Yên, 1998), 17-19 ngày (ðặng Xuân Biên, 1979). Tại Ấn ðộ, theo (Singh.N.S và Sengar.O.P.S, 1985) cho biết dê Barbari có chu kỳ ñộng dục là 17,1 - 49,2 ngày; dê Beetal là 16,9- 41,2 ngày, dê Jumnapari là 19,0 49,7 ngày, dê Black bengan là 17,8 - 46,2 ngày. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 8 Khoảng cách lứa ñẻ Khoảng cách lứa ñẻ là khoảng thời gian giữa lần ñẻ trước và lần ñẻ tiếp sau, ñây cũng là một trong những chỉ tiêu quan trọng ñể ñánh giá khả năng sinh sản của dê cái. Khoảng cách lứa ñẻ phụ thuộc vào các yếu tố như: giống, thức ăn, dinh dưỡng, chế ñộ chăm sóc… Khoảng cách lứa ñẻ chủ yếu là do thời gian có chửa lại sau khi ñẻ quyết ñịnh, bởi vì ñộ dài thời gian mang thai là một hằng số sinh lý và không thể rút ngắn ñược. Tuy nhiên trong thực tế, khoảng cách lứa ñẻ thường kéo dài hơn do nhiều nguyên nhân. (ðặng Xuân Biên, 1979) cho biết, dê Cỏ có khoảng cách giữa 2 lứa ñẻ là 270 ngày. (Nguyễn Thị Mai, 2002) thông báo, dê Bách Thảo nuôi tại Ninh Thuận có khoảng cách giữa hai lứa ñẻ là 180 - 210 ngày. ðối với các giống dê Ấn ðộ nuôi tại Việt Nam, các tác giả ñã thu ñược kết quả là: dê Barbari: 225 ngày; dê Jumnapari: 312 ngày và dê Beetal là 282 ngày. Thời gian có chửa lại sau khi ñẻ Muốn rút ngắn khoảng cách lứa ñẻ cần phải tuân thủ và áp dụng những quy trình chăn nuôi hợp lý hoặc phải tác ñộng ñể rút ngắn giai ñoạn từ khi ñẻ ñến khi phối giống có chửa xuống, tốt nhất là 3 tháng. Thời gian này phụ thuộc vào gia súc ñộng dục lại sau ñẻ, khả năng phát hiện ñộng dục, phối giống lại, cũng như khả năng thụ thai. Thời gian ñộng lại sau khi ñẻ Thời gian ñộng dục lại sau khi ñẻ là khoảng thời gian tính từ khi gia súc cái ñẻ ra con ñến khi xuất hiện kỳ ñộng dục tiếp theo. Khoảng thời gian ñộng dục lại của dê phụ thuộc vào quá trình hồi phục của cơ quan sinh dục, ñặc biệt là buồng trứng. Những dê cái ñược nuôi dưỡng kém trước và sau khi ñẻ hay ñang cho con bú thường ñộng dục trở lại muộn hơn. Thời gian ñộng dục lại sau ñẻ của dê núi Hà Giang là 40,22 ngày(Nguyễn Văn Bình và cs, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 9 2008), dê cỏ, dê lai ở Yên Bái lần lượt là 43,54 ±10,42, 51,82±10,42 (Nguyễn Bá Mùi, 2011). Tỷ lệ thụ thai Tỷ lệ thụ thai một mặt phụ thuộc vào bản thân con vật, nhất là sự hồi phục của ñường sinh dục và hoạt ñộng chu kỳ sau khi ñẻ. Mặt khác, còn phụ thuộc vào kỹ thuật thụ tinh nhân tạo. Cùng với việc ñộng dục trở lại sớm, tỷ lệ phối giống thụ thai cao góp phần rút ngắn thời gian có chửa lại sau ñẻ và khoảng cách lứa ñẻ. Thời gian mang thai Thời gian mang thai là thời gian tính từ lúc gia súc cái thụ thai ñến khi ñẻ. Theo (ðặng Xuân Biên, 1979) cho biết, thời gian mang thai trung bình của dê là 146-156 ngày. (ðinh Văn Bình và cs, 1998) theo dõi trên dê Ấn ðộ thấy: dê Barbari là 148,1 ngày (ở Ấn ðộ là 146 ngày), Jumnapari là 149,61 ngày (ở Ấn ðộ là 149 ngày), dê Beetal là 148,1 ngày (ở Ấn ðộ là 148 ngày). Tại Ấn ðộ, theo (Sing S.N. và Sengar P.S., 1985) cho biết: dê Jumnapari là 149 ngày, dê Beetal là 148 ngày, dê Barbari là 146 ngày. Số con sơ sinh trên lứa ðây là chỉ tiêu cho biết số dê con sơ sinh ñẻ ra trong một lứa ñẻ của dê mẹ. Tác giả (Lê Văn Thông, 2005) theo dõi ở Thanh Hóa cho biết dê Cỏ ñẻ 1,61 con/ lứa, (Mai Hữu Yên, 1998) là 1,52 con/lứa, (ðinh Văn Bình, 1998) nghiên cứu trên dê Ấn ðộ cho biết: dê Barbari: 1,45 con/lứa; dê Jumnapari: 1,36 con/ lứa; dê Beetal: 1,3 con/ lứa. Số con sơ sinh/ cái/năm Là số con sơ sinh ñược sinh ra trong một năm của một dê cái. Chỉ tiêu này phản ánh số dê con ñẻ ra hàng năm của dê mẹ. Theo nghiên cứu của một số tác giả cho biết chỉ tiêu này ở dê Cỏ là 1,97 con/ cái/ năm, dê Bách Thảo là 3,07 con/cái/năm (ðinh Văn Bình, 1994). Số lứa/cái/năm Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 10 Chỉ tiêu này xác ñịnh số lứa ñẻ của một dê cái trong một năm. Các giống dê khác nhau thì số lứa ñẻ cũng khác nhau trong một năm. Dê Jumnapari là 1,3 lứa/năm, dê Barbari là 1,4 lứa/năm. 2.2.Các yếu tố trong việc nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm ðể nuôi thành thục trứng trong ñiều kiện in vitro thành công thì bắt buộc phải tạo các ñiều kiện nuôi (nhiệt ñộ, thành phần không khí, môi trường nuôi...) gần giống với trong ñiều kiện in vivo nhất. Ngoài ra, thời gian nuôi cũng không ñược dài quá hay ngắn quá, cũng cần phải tương ñương với thời gian phát triển trong cơ thể ñộng vật. ðể làm ñược ñiều này cần phải có những nghiên cứu từng bước, từng công ñoạn của các nghiên cứu cơ bản. Có rất nhiều nghiên cứu về vấn ñề này và các tác giả ñã ñưa ra ñược con số tương ñối cụ thể cho công việc nuôi thành thục trứng nêu trên. 2.2.1. ðiều kiện nuôi Nhiệt ñộ: Yếu tố nhiệt ñộ nuôi cần phải tương ñương với nhiệt ñộ trong cơ thể con vật. Với dê, nhiệt ñộ nuôi cần ñảm bảo ổn ñịnh ở khoảng 390C (Cù Xuân Dần, 1996), tuy nhiên ñó là nhiệt ñộ trung bình của dê, trên thực tế ta cần phải xác ñịnh lại bằng thực nghiệm với các mức nhiệt ñộ giao ñộng trong khoảng 390C ñể tìm ra khoảng nhiệt ñộ thích hợp nhất. Trong thí nghiệm của (N.Crozet và cs, 1995), ông ñã nuôi trứng dê trong ñiều kiện nhiệt ñộ 38,50C ñể chuẩn bị trứng thành thục cho việc thụ tinh ống nghiệm. Tương tự như kết quả của N.Crozet, (Z.G.Wang và cs, 2007) cũng nuôi thành thục trứng dê Boer trong ống nghiệm ở nhiệt ñộ 38,50C, 5%CO2 trong 24 giờ ñể nghiên cứu sự ảnh hưởng của các phương pháp khai thác trứng ñến khả năng thụ tinh sau khi nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm dê Boer. (M.Khatun và cs, 2010) nuôi trứng dê trong ñiều kiện nhiệt ñộ là 390C. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ………………………. 11