Tài liệu Nghiên cứu sinh khả dụng và tương quan in vitro - in vivo của nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI AN PHƯƠNG HÀ NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO CỦA NHŨ TƯƠNG NANO DICLOFENAC DÙNG TRONG NHÃN KHOA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI AN PHƯƠNG HÀ NGHIÊN CỨU SINH KHẢ DỤNG VÀ TƯƠNG QUAN IN VITRO – IN VIVO CỦA NHŨ TƯƠNG NANO DICLOFENAC DÙNG TRONG NHÃN KHOA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Trần Linh 2. DS. Đặng Thị Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Nguyễn Trần Linh DS. Đặng Thị Hiền là những người thầy đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học và cũng là những người trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, bộ môn Vật lý – Hóa lý và bộ môn Công nghiệp Dược đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em đã dành cho tôi sự giúp đỡ và động viên quý báu trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên An Phương Hà MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 1 1.1. Thông tin về dược chất diclofenac................................................................... 2 1.1.1. Công thức hóa học ......................................................................................... 2 1.1.2. Đặc tính lý hóa............................................................................................... 2 1.1.3. Tác dụng dược lí ............................................................................................ 3 1.2. Thuốc nhỏ mắt ..................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.1. Định nghĩa ..................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.2. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt và biện pháp tăng sinh khả dụng của thuốc nhãn khoa ........................................................................................................................ 3 1.3. Nhũ tương nano .............................................................................................. 4 1.3.1. Định nghĩa ..................................................................................................... 4 1.3.2. Một số ưu điểm của nhũ tương nano .............................................................. 4 1.3.4. Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện................................ 5 1.4. Sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo .............................................. 6 1.4.1. Định nghĩa ..................................................................................................... 6 1.4.2. Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong nhãn khoa..................................................................................... 6 1.4.2.1. Định nghĩa .................................................................................................. 6 1.4.2.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong nhãn khoa ........................................................................................................................ 7 1.4.3. Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc dùng trong nhãn khoa..................................................................................... 8 1.4.3.1. Định nghĩa .................................................................................................. 8 1.4.3.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc dùng trong nhãn khoa ........................................................................................................................ 8 1.4.3.3. Tính toán mức độ và tốc độ hấp thu thuốc bằng phương pháp giải tích chập10 1.5. Tương quan in vitro – in vivo ............................ Error! Bookmark not defined.1 1.5.1. Định nghĩa ................................................... Error! Bookmark not defined.1 1.5.2. Phân loại mức tương quan in vitro – in vivo . Error! Bookmark not defined.1 1.5.4. Thiết lập mối tương quan in vitro – in vivo .. Error! Bookmark not defined.2 1.5.4.1. Yêu cầu chung .......................................... Error! Bookmark not defined.2 1.5.4.2. Thiết lập tương quan mức A ..................... Error! Bookmark not defined.4 1.5.5. Ứng dụng của tương quan in vitro – in vivo . Error! Bookmark not defined.4 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15 2.1. Nguyên liệu, thiết bị, động vật thí nghiệm ..................................................... 15 2.1.1. Hóa chất và nguyên liệu sử dụng ................................................................. 15 2.1.2. Thiết bị ........................................................................................................ 15 2.1.3. Động vật thí nghiệm .................................................................................... 16 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 16 2.3.1. Phương pháp bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac ........................... 16 2.3.2. Phương pháp bào chế dung dịch nhỏ mắt diclofenac so sánh ....................... 17 2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ .............................................. 18 2.3.3.1. Xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân ................ 18 2.3.3.2. Đo thế zeta ................................................................................................ 18 2.3.4. Phương pháp định lượng dược chất ............................................................. 18 2.3.5. Đánh giá sinh khả dụng ............................................................................... 19 2.3.5.1. Các bước tiến hành thí nghiệm .................................................................. 19 2.3.5.2. Tính toán các thông số dược động học ...................................................... 22 2.3.5.3. Mức độ giải phóng dược chất in vivo ........................................................ 22 2.3.6. Phương pháp xây dựng tương quan in vitro – in vivo ................................... 22 2.3.6.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro ..................................................... 22 2.3.6.2. Xác định các điều kiện thử giải phóng dược chất in vitro (phương pháp mô hình hóa đồ thị giải phóng) .................................................................................... 24 2.3.6.3. Thiết lập mô hình tương quan phù hợp...................................................... 25 2.3.7. Ứng dụng tương quan lựa chọn công thức bao chế thích hợp ....................... 25 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ........................... 26 3.1. Đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ ......................................................................................... 26 3.1.1. So sánh nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng của nhũ tương nano và dạng dung dịch ...................................................................................................... 27 3.1.2. Xây dựng đường biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của nhũ tương nano so với dung dịch......................................................................................................... 27 3.1.3. Các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ .... 27 3.2. Xây dựng tương quan in vitro – in vivo ......................................................... 28 3.2.1. Đánh giá giải phóng dược chất in vitro ........................................................ 28 3.2.2. Mô hình hóa đồ thị giải phóng ..................................................................... 30 3.2.3. Thiết lập tương quan .................................................................................... 32 3.3. Ứng dụng tương quan lựa chọn công thức bào chế thích hợp...................... 33 3.3.1. Thiết kế công thức ....................................................................................... 33 3.3.1.1. Lựa chọn thành phần ................................................................................. 33 3.3.1.2. Xác định tỷ lệ các thành phần ................................................................... 34 3.3.2. Thiết kế thí nghiệm và kết quả ..................................................................... 34 3.3.2.1. Các biến đầu ra ......................................................................................... 34 3.3.2.2. Các biến độc lập ....................................................................................... 35 3.3.2.3. Bố trí thí nghiệm và kết quả ...................................................................... 35 3.3.2.4. Phân tích một số yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ giải phóng in vivo của NTN so với mức độ giải phóng in vivo tối đa của dung dịch (Fvivo) ..................................... 36 3.3.3. Lựa chọn công thức ..................................................................................... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AD AIC AUC Diclofenac Tiêu chuẩn thông tin Akaike (Akaike information criterion) Diện tích dưới đường cong (Area under curve) CDH Chất diện hoạt CTTƯ Công thức bào chế thích hợp DAD Detector mảng diod (Diode Array Detector) DC Dược chất ĐDH Chất đồng diện hoạt ĐNH Đồng nhất hóa FDA HPLC Cơ quan quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ (Food and Drug Administration) Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography) IPM Isopropyl myristat IVIVC Tương quan in vitro – in vivo KLPT Khối lượng phân tử kl/tt Khối lượng/thể tích KTTP Kích thước tiểu phân MRT Thời gian lưu trung bình (Mean residence time) NSAIDs NTN PdI Nhóm thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal anti-inflammatory drugs) Nhũ tương nano Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) PE Phần trăm sai số dự đoán PG Propylen glycol PL Phụ lục PT Phương trình SD SKD USP Độ lệch chuẩn (Standard deviation) Sinh khả dụng Dược điển Mỹ (The United States Pharmacopeia) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hóa chất và nguyên liệu sử dụng........................................................... 15 Bảng 2.2. Các mô hình giải phóng khác nhau phù hợp với mô hình phân tích dữ liệu in vitro ................................................................................................................... 24 Bảng 3.1. Mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch ........................... 27 Bảng 3.2. Các thông số dược động học của nhũ tương nano diclofenac trên mắt thỏ .............................................................................................................................. 28 Bảng 3.3. Kết quả AIC của các môi trường giải phóng với các mô hình giải phóng khác nhau .............................................................................................................. 30 Bảng 3.4. Giá trị AIC theo tương quan giữa mức độ giải phóng in vitro trong các điều kiện thử giải phóng và mức độ giải phóng in vivo của dược chất ................... 32 Bảng 3.5. Các thành phần trong công thức NTN AD ............................................. 34 Bảng 3.6. Các biến định tính ................................................................................. 35 Bảng 3.7. Các biến định lượng .............................................................................. 35 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các biến độc lập đến các biến phụ thuộc....................... 36 Bảng 3.9. Kết quả luyện mạng neuron nhân tạo .................................................... 37 Bảng 3.10. Thành phần công thức NTN AD lựa chọn ............................................ 39 Bảng 3.11. Kết quả Fvivo – tỷ lệ giải phóng in vivo của CTTƯ so với dung dịch ..... 39 Bảng P1. Kết quả thí nghiệm và tính toán trung bình 6 lô (n=6) ........................ PL1 Bảng P2. Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm trong các môi trường đệm phosphat pH khác nhau ............................................................................... PL2 Bảng P3. Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm trong các môi trường đệm phosphat pH 7,4 có chứa Tween 80 và ethanol hàm lượng khác nhau ......... PL2 Bảng P4. Các biến phụ thuộc ............................................................................. PL3 Bảng P5. Thiết kế thí nghiệm cho NTN AD ........................................................ PL3 Bảng P6. Một số đặc tính của 20 công thức thiết kế ........................................... PL3 Bảng P7. Phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm của 20 công thức thiết kế........................................................................................................................ PL3 Bảng P8. Tỷ lệ Fvivo của mức độ giải phóng in vivo của dạng NTN với dạng dung dịch của 20 công thức NTN thiết kế (n = 20) ...................................................... PL3 Bảng P9. Kết quả thử giải phóng in vitro của CTTƯ .......................................... PL3 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo acid diclofenac [36] ................................................... 2 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn đường cong nồng độ - thời gian trung bình 6 lô........... 26 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch .. 27 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DC giải phóng của NTN diclofenac trong một số môi trường đệm phosphat pH khác nhau ............................................................... 29 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ DC giải phóng của NTN diclofenac trong một số môi trường đệm phosphat pH 7,4 khác nhau.......................................................... 29 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự giải phóng dược chất theo mô hình Weibull trong môi trường phosphat pH 5,8 ......................................................................................... 31 Hình 3.6. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại CDH thân nước và hàm lượng CDH thân nước đến mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch ở thời điểm 75 phút ......................................................................................................... 37 Hình 3.7. Mặt đáp biểu diễn ảnh hưởng của loại dung môi pha dầu (IPM và Miglyol) và hàm lượng Transcutol HP đến mức độ giải phóng in vivo của NTN so với dung dịch ở thời điểm 180 phút ....................................................................... 38 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn Fvivo tại các thời điểm dự đoán và thực tế .................... 40 Hình P1. Kết quả phân bố kích thước tiểu phân mẫu NTN CTTƯ ..................... PL4 Hình P2. Kết quả thế zeta mẫu NTN CTTƯ ........................................................ PL5 Hình P3. Sắc đồ của dung dịch acid diclofenac chuẩn ...................................... PL6 Hình P4. Sắc đồ của NTN AD CTTƯ ................................................................. PL6 Hình P5. Mô hình thử nghiệm kỹ thuật thẩm tách micro [39] ........................... PL7 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, các thuốc chống viêm không steroid - NSAIDs là một nhóm dược chất quan trọng dùng cho mục đích giảm đau, chống viêm trong các bệnh về mắt. Diclofenac là một dược chất điển hình thuộc nhóm này, là một dẫn chất acid phenyl acetic có ưu điểm chính không gây ra các tác dụng phụ như thuốc chống viêm không steroid khác như giảm đáp ứng miễn dịch, tăng nhãn áp và ức chế sự tái tạo của lớp biểu mô giác mạc. Tuy nhiên sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt thường rất thấp (chỉ khoảng 1 – 3%) do tác động của cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ thống nước mắt và bản chất cấu tạo của các lớp giác mạc. Do vậy, một số dạng bào chế đã được áp dụng như hỗn dịch, thuốc mỡ, nhũ tương...với mục đích làm tăng thời gian lưu thuốc. Với sự phát triển của công nghệ nano, những ưu điểm của dạng bào chế nhũ tương, và thị trường Việt nam chưa có chế phẩm thuốc nhỏ mắt NTN nào, bộ môn Bào chế đã tiến hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nhỏ mắt diclofenac nhằm tăng tính thấm của dược chất, duy trì tác dụng kéo dài, hiệu quả và thuận tiện cho người sử dụng. Hiện tại, công thức cơ bản cho chế phẩm cũng như phương pháp bào chế đã được xác định [8], [9], [11], [12] và bước đầu đã đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac [10]. Tiếp theo những nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo của nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa” với các mục tiêu: 1. Đánh giá sinh khả dụng của nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa. 2. Xây dựng tương quan in vitro – in vivo và ứng dụng tương quan để tối ưu hóa công thức nhũ tương nano diclofenac dùng trong nhãn khoa. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Thông tin về dược chất diclofenac 1.1.1. Công thức hóa học Hình 1.1. Công thức cấu tạo acid diclofenac [36] 1.1.2. Đặc tính lý hóa  Tính chất vật lý  Cảm quan: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần trắng, hơi hút ẩm [7].  Độ tan: Rất ít tan trong nước, độ tan trong nước ở 25oC thay đổi tùy theo giá trị pH từ 17,8 – 1771 μg/mL [32]. Tan tốt trong dầu thực vật (dầu thầu dầu, dầu oliu…) [13]; không tan/hexan, toluen; ít tan/cloroform; tan tốt/methanol; tan rất tốt/dimethyl sulfoxyd, dimethyl formamid, dioxan… [44].  Hấp thụ UV: λmax (methanol) = 285 nm; λmax (acetonitril) = 278 nm [44].  Tính chất hóa học:  Là một dẫn chất của anilin, diclofenac có thể bị oxy hóa.  Dung dịch trong methanol, thêm acid nitric đặc sẽ có màu đỏ nâu [5], [7].  Dung dịch trong ethanol cho phản ứng với các dung dịch kali fericyanid, sắt (III) clorid, và acid hydrocloric sẽ cho màu xanh và có tủa [5], [7].  Định tính:  Dựa trên các phản ứng đặc trưng trình bày ở mục tính chất hóa học [7].  Đo phổ hồng ngoại và sắc kí lớp mỏng: so sánh với chất chuẩn [7].  Định lượng: 3  Chuẩn độ trong môi trường khan: acid diclofenac có thể định lượng bằng dung dịch kali hydroxyd trong methanol trong môi trường cloroform [5].  Đo mật độ quang [7].  Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC [7]. 1.1.3. Tác dụng dược lí Diclofenac thuộc nhóm chống viêm không steroid – NSAIDs, có tác dụng ức chế tổng hợp prostagladin rõ rệt, tạo ra tác dụng chống viêm, giảm đau mạnh. Các thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh, diclofenac có khả năng ngăn chặn co đồng tử xảy ra trong quá trình lấy tinh thể đục, làm giảm viêm và đau mắt trong tổn thương biểu mô giác mạc sau một số phẫu thuật can thiệp khác. Không có dấu hiệu nào cho thấy diclofenac có tác dụng phụ làm ảnh hưởng đến quá trình lành vết thương [6]. 1.2. Thuốc nhỏ mắt 1.2.1. Định nghĩa Thuốc nhỏ mắt là dung dịch nước, dung dịch dầu hoặc hỗn dịch vô khuẩn của một hay nhiều hoạt chất, dùng để nhỏ vào mắt. Chế phẩm cũng có thể được bào chế dưới dạng khô (bột, bột đông khô, viên nén) vô khuẩn, được hòa tan hoặc phân tán vào một chất lỏng vô khuẩn thích hợp khi dùng [2]. Tuy nhiên, trên thực tế thuốc nhỏ mắt cũng có thể là dạng nhũ tương. Ví dụ như chế phẩm RestasisTM (Allergan, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt chứa cyclosporin A 0,05%; chế phẩm Refresh Dry Eye Therapy® (Allergan, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt không có DC; chế phẩm Durezol™ (Sirion therapeutics, Mỹ) là nhũ tương nhỏ mắt chứa difluprednat 0,05% [20]. 1.2.2. Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt và biện pháp làm tăng sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt Sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt thường rất thấp. Chỉ có khoảng 1% - 3% lượng DC có trong liều thuốc đã đưa vào mắt là thấm được qua giác mạc và phân bố đến nơi tác dụng tại các khoang ở trong mắt. Đó là do tác động của cơ chế bảo vệ sinh lý của hệ thống nước mắt và bản chất cấu tạo các lớp mô của giác mạc [2]. 4 Một số biện pháp làm tăng sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt qui ước [2], [27]:  Tăng thời gian lưu thuốc ở vùng trước giác mạc: hạn chế gây kích ứng mắt, chất làm tăng độ nhớt, bào chế hỗn dịch, thuốc mỡ, gel, hệ cài đặt ở mắt,…  Tăng tính thấm của giác mạc với dược chất: sử dụng các chất làm tăng tính thấm của biểu mô giác mạc với dược chất: CDH (Tween 80, Brij…), thay đổi tính thấm của dược chất với biểu mô giác mạc (tiền thuốc).  Hiện nay các hệ tiểu phân như: vi cầu, vi nang, hỗn dịch, nhũ tương, liposome, niosome, dendrime, tiểu phân chứa trong kính tiếp xúc…có kích thước nm đến µm sử dụng cho nhãn khoa đang được tập trung nghiên cứu nhiều, trong đó NTN với đặc điểm riêng về cấu trúc, tính chất đã được chứng minh là có khả năng kéo dài thời gian tác dụng của thuốc, tăng sinh khả dụng và hiệu lực điều trị, giảm số lần sử dụng thuốc cho người bệnh [27], [38]. 1.3. Nhũ tương nano 1.3.1. Định nghĩa Nhũ tương là một hệ phân tán cơ học vi dị thể, được tạo bởi hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất lỏng được phân tán đồng đều vào chất lỏng thứ hai (môi trường phân tán) dưới dạng các tiểu phân có đường kính từ 0,1 đến hàng chục micromet [2]. NTN (còn được gọi là nhũ tương siêu mịn, nhũ tương dưới micro), thường có KTTP từ 50-200 nm, và có chỉ số đa phân tán thấp [23], [38], [43]. 1.3.2. Một số ưu điểm của nhũ tương nano  Sử dụng đơn giản và tiện lợi [38].  Giảm kích ứng mắt với các dược chất dễ gây kích ứng [38].  Giảm số lần dùng thuốc trong ngày so với dạng thuốc nhỏ mắt, hạn chế tác dụng phụ và tổn thương tế bào biểu mô mắt. Các tiểu phân có sức căng bề mặt nhỏ làm tăng khả năng thấm ướt, giúp hệ phân tán rộng và tăng thời gian tiếp xúc của thuốc với giác mạc [38].  Độ ổn định cao, ít bị lên bông, kết tụ, sa lắng như các nhũ tương micro [38]. 5 1.3.3. Các nghiên cứu nhũ tương nano diclofenac đã thực hiện Cùng với xu hướng chung của thế giới, tại Việt nam các hệ siêu vi tiểu phân cũng đã được triển khai nghiên cứu rất nhiều. Tuy nhiên, dạng nano nhũ tương nhỏ mắt chứa diclofenac chỉ mới lần đầu tiên được nghiên cứu bắt đầu ở bộ môn Bào chế - trường Đại học Dược Hà nội từ năm 2011. Đầu tiên, Vũ Ngọc Mai (2011) sử dụng phương pháp siêu âm đã bào chế thành công NTN diclofenac (cả dạng acid và dạng muối) với ba loại pha dầu là isopropyl myristat, Labrafac PG và Miglyol cùng với CDH Tween 80, Cremophor EL, Span 80, ĐDH Transcutol HP. Đồng thời, tác giả cũng đánh giá được ảnh hưởng của các loại hệ đệm, lượng pha dầu, nồng độ CDH và ĐDH đến độ ổn định vật lý và khả năng giải phóng dược chất in vitro [8]. Trên cơ sở đó, Nguyễn Thị Phượng (2012) lựa chọn dạng acid của diclofenac, pha dầu isopropyl myristat với tỉ lệ các CDH và ĐDH thích hợp để so sánh phương pháp bào chế siêu âm và siêu âm kết hợp đồng nhất hóa áp suất cao. Kết quả cho thấy, tuy không có sự khác biệt về độ ổn định và tỉ lệ dược chất được nhũ hóa nhưng phương pháp siêu âm kết hợp đồng nhất hóa có KTTP nhỏ hơn, lượng dược chất giải phóng in vitro trong 2 giờ đầu là tương tự nhưng các giờ tiếp theo siêu âm kết hợp đồng nhất hóa giải phóng nhiều hơn [9]. Nguyễn Hồng Vân (2012) tiếp tục thay đổi công thức bằng cách kết hợp cả hai pha dầu Miglyol và isopropyl myristat, thay đổi các tỉ lệ CDH và ĐDH, bổ sung thêm PG và bào chế bằng phương pháp phân cắt tốc độ cao. Sau đó tương tự các nghiên cứu trên đánh giá độ ổn định vật lý, các đặc tính vật lý (KTTP, PdI, thế zeta, độ nhớt) và khả năng giải phóng dược chất in vitro, qua đó đã lựa chọn ra 3 công thức tối ưu để nghiên cứu độ ổn định trong 6 tháng. Sau 6 tháng KTTP, thế zeta, tỉ lệ dược chất trong pha dầu, hàm lượng dược chất và phần trăm dược chất giải phóng tại các thời điểm có thay đổi, nhưng vẫn có khả năng tác dụng kéo dài. Tác giả đã đi đến kết luận NTN nhỏ mắt diclofenac bảo quản tốt nhất ở 2 – 8oC [12]. 6 Nguyễn Thị Thúy (2013) lựa chọn ra 4 công thức, sử dụng phương pháp siêu âm kết hợp phân cắt tốc độ cao hoặc đồng nhất hóa áp suất cao để khảo sát nâng quy mô bào chế từ 100 mL lên 1000 mL. Tác giả đã tìm được thời gian siêu âm cũng như đồng nhất hóa thích hợp thông qua đánh giá các đặc tính vật lý (KTTP, PdI, thế zeta, độ nhớt) và khả năng giải phóng dược chất in vitro [11]. Tiếp tục, Quản Duy Quang (2014) đã tiến hành thẩm định phương pháp định lượng và bước đầu đánh giá sinh khả dụng của NTN diclofenac, lựa chọn phương pháp bào chế siêu âm. Tác giả đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp thêm chuẩn với tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác đạt tiêu chuẩn của FDA. Nghiên cứu đã bước đầu đánh giá sinh khả dụng trên mắt thỏ (thực hiện trên 3 lô mẫu) và cho kết quả dạng NTN có nồng độ diclofenac trong dịch tiền phòng cao hơn so với dạng dung dịch ở đa số các thời điểm lấy mẫu, NTN có mức độ giải phóng in vivo gấp khoảng 1,34 lần so với dạng dung dịch [10]. Với những kết quả đã đạt được, nghiên cứu hoàn thiện đánh giá sinh khả dụng in vivo ở giai đoạn tiếp theo là cần thiết để có những đánh giá, lựa chọn giá trị hơn trong việc xây dựng tương quan in vivo – in vitro để ứng dụng tìm ra công thức bào chế thích hợp. 1.4. Sinh khả dụng và tương quan in vitro – in vivo 1.4.1. Định nghĩa Sinh khả dụng là đại lượng chỉ tốc độ và mức độ hấp thu dược chất từ một chế phẩm bào chế vào vòng tuần hoàn chung của cơ thể ở dạng còn hoạt tính và đưa đến nơi tác dụng. Tùy thuộc phương pháp đánh giá, sinh khả dụng được phân thành hai loại là sinh khả dụng in vitro và sinh khả dụng in vivo [4]. 1.4.2. Sinh khả dụng in vitro và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong nhãn khoa 1.4.2.1. Định nghĩa 7 Sinh khả dụng in vitro đánh giá quá trình giải phóng, hòa tan dược chất từ dạng thuốc [4]. 1.4.2.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vitro cho thuốc dùng trong nhãn khoa Các thiết bị sử dụng:  Bình Franz: mẫu NTN được chứa ở ngăn cho phía trên (donor), môi trường khuếch tán ở ngăn nhận phía dưới (receptor), màng thử giải phóng được đặt giữa hai phần. Sau thời gian nhất định, lấy mẫu từ môi trường khuếch tán để định lượng, và bổ sung lại thể tích môi trường khuếch tán mới tương ứng [22], [28].  Màng giải phóng: thường sử dụng màng thẩm tích hoặc túi thẩm tích có giới hạn KLPT thường 12 – 14 kDa [28]. Các màng này thường được xử lý bằng môi trường khuếch tán trước khi tiến hành thí nghiệm.  Môi trường khuếch tán: thường là đệm phosphat pH 7,4 [14] hoặc dung dịch nước mắt nhân tạo [24], được điều nhiệt để duy trì nhiệt độ thích hợp và khuấy trộn với tốc độ nhất định.  Nhiệt độ: 34±0,5oC (nhiệt độ bề mặt nhãn cầu) [14], [24] hoặc 37±0,5oC [17].  Qi Li (2014) sử dụng bình Franz để nghiên cứu giải phóng in vitro của Tacrolimus dùng cho nhãn khoa. Mẫu Tacrolimus được chứa ở ngăn cho phía trên (donor), môi trường khuếch tán là hỗn hợp ethanol: nước mắt nhân tạo tỷ lệ thể tích 25:75, màng thử giải phóng là giác mạc của thỏ được sử dụng trong nghiên cứu được đặt giữa hai phần. Sau các khoảng thời gian nhất định, 1 mL mẫu từ môi trường khuếch tán được lấy ra định lượng bằng phương pháp HPLC với detector UV (G1314A VWD) tại bước sóng 220 nm; và bổ sung lại thể tích môi trường khuếch tán mới tương ứng [30].  Thiết bị thẩm tách micro (hình P5 – PL 7) [39].  Naseem A. Charoo và cộng sự (2003) nghiên cứu giải phóng in vitro từ hệ phân phối thuốc Ciprofloxacin hydroclorid dùng cho nhãn khoa bằng phương pháp thẩm tách. Sử dụng thiết bị thẩm tách, màng giải phóng là màng mắt nhân tạo, môi 8 trường khuếch tán là nước mắt nhân tạ o pH 7,4 được khuấy liên tục bằng máy khuất từ, nhiệt độ được duy trì ở mức 37±0,5oC, tại các thời điểm lấy 3 mL mẫu và bổ sung 3 mL môi trường khuếch tán, lọc mẫu và đem đo quang tại bước sóng 274 nm, sử dụng dung dịch nước mắt nhân tạo pH 7,4 làm mẫu trắng [18].  Thiết bị thử hòa tan [14], [15], [17], [42], [50].  H. O. Ammar (2009) đã tiến hành nghiên cứu bào chế nhũ tương nano dorzolamid dùng cho nhãn khoa, nghiên cứu giải phóng in vitro được tiến hành: thiết bị sử dụng là thiết bị thử hòa tan (SR8 PLUS, máy thử hòa tan Handson, Mỹ), 900 mL môi trường giải phóng là đệm phosphat (pH 7,4), nhiệt độ môi trường được cài đặt là 34±0,5oC, tốc độ khuấy là 50 vòng/phút, tiến hành thử nghiệm trong 6 giờ, NTN được chứa trong túi thẩm tích với 2 đầu được kẹp chặt. Tại những thời điểm nhất định, lấy 5 mL mẫu từ môi trường khuếch tán (bổ sung thế tích môi trường tương ứng) và định lượng DC bằng phương pháp đo quang tại bước sóng 252,6 nm [14]. 1.4.3. Sinh khả dụng in vivo và phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc dùng trong nhãn khoa 1.4.3.1. Định nghĩa Sinh khả dụng in vivo đánh giá giai đoạn hấp thu dược chất từ chế phẩm bào chế [4]. 1.4.3.2. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng in vivo cho thuốc dùng trong nhãn khoa Để đánh giá sinh khả dụng, dược động học hay tác dụng dược lý của một thuốc bất kì trước hết tiến hành thử nghiệm đánh giá trên động vật. Với thuốc nhỏ mắt thỏ được lựa chọn bởi sự giống nhau tương đối giữa cấu tạo giải phẫu và các thông số sinh lý cơ bản giữa mắt người và mắt thỏ [33]. Hiện tại, có khá nhiều phương pháp để đánh giá sinh khả dụng của thuốc nhỏ mắt trên thỏ tuy nhiên đều gặp phải hạn chế bởi lượng mẫu lấy được từ mỗi thời điểm rất ít và khó lấy mẫu. Mặt khác với những thuốc mà đích tác dụng là trong