Tài liệu Nghiên cứu sấy phun phlorotannin thu nhận từ rong mơ Sargassum thu mẫu tại bờ biển Khánh Hòa

Ket-noi.com i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này, trước tiên em xin gửi tới Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm lòng biết ơn và niềm tự hào đã được học tập tại trường trong những năm qua. Lòng biết ơn sâu sắc xin được dành cho Ths. Nguyễn Thị Mỹ Trang- Bộ môn Đảm bảo Chất lượng và An toàn Thực phẩm và Ths. Đặng Xuân Cườngphòng Hóa phân tích và Triển khai Công nghệ- Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án vừa qua. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và các khoa khác trong nhà trường đã tận tình dạy dỗ em trong suốt quá trình học tại trường. Xin cảm ơn cô Lê Thiên Sa- quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm và các thầy cô tại trung tâm thí nghiệm thực hành đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Xin cám ơn ba mẹ và gia đình đã tạo điều kiện về vật chất và ủng hộ về tinh thần giúp em vượt qua mọi chặng đường học tập vất vả. Nha Trang, tháng 6 năm 2012. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Nga ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................... 2 1.1. Tổng quan về phlorotannin ............................................................................. 2 1.1.1 Nguồn gốc và đặc điểm phlorotannin.......................................................... 2 1.1.2. Cơ chế, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng của phlorotannin ................ 4 1.1.2.1. Cơ chế chống oxy hóa của phlorotannin......................................... 4 1.1.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin ..................................... 5 1.1.2.3. Ứng dụng của phlorotannin............................................................ 8 1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng và hoạt tính của phlorotannin ........ 10 1.3. Các nghiên cứu về phlorotannin ở Việt Nam và trên thế giới ........................ 12 1.3.1. Tình hình nghiên cứu về phlorotannin ở Việt Nam .................................. 12 1.3.2. Tình hình nghiên cứu phlorotannin trên thế giới ...................................... 14 1.4. Cơ sở lý thuyết và thiết bị sấy phun .............................................................. 15 1.4.1. Cơ sở lý thuyết sấy phun ......................................................................... 15 1.4.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy sấy phun. ................................. 18 1.4.2.1. Cấu tạo chung .............................................................................. 18 1.4.2.2. Nguyên tắc hoạt động................................................................... 20 1.4.2.3. Thông số kỹ thuật ......................................................................... 21 1.4.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy....................................... 21 1.4.3. Phân loại thiết bị sấy phun. ...................................................................... 21 1.4.4. Ưu điểm và nhược điểm của công nghệ sấy phun. ................................... 22 1.4.4.1. Ưu điểm ....................................................................................... 22 1.4.4.2. Nhược điểm .................................................................................. 23 1.4.5. Một số thiết bị dùng trong sấy phun ......................................................... 23 1.4.5.1. Máy sấy phun sương..................................................................... 23 1.4.5.2. Máy sấy phun ly tâm tốc độ cao ................................................... 24 iii 1.4.5.3. Máy sấy phun tạo hạt áp lực cao .................................................. 25 1.4.5.4. Máy sấy phun SD-05 .................................................................... 27 1.4.6. Cơ sở xác định điều kiện sấy phun ........................................................... 30 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 32 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 32 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 32 2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học ............................................................... 32 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm................................................................. 32 2.2.2.1. Quy trình dự kiến sấy phun phlorotannin...................................... 32 2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm .......................................................................... 33 2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu .......................................................................... 40 2.3.1. Hóa chất: ................................................................................................. 40 2.3.2. Thiết bị chủ yếu: ...................................................................................... 40 2.4. Phương pháp xử lý số liệu. ............................................................................ 40 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................. 41 3.1. Kết quả khảo sát chất trợ sấy......................................................................... 41 3.2. Xác định tỷ lệ chất trợ sấy ............................................................................. 44 3.3. Xác định áp suất bơm.................................................................................... 47 3.4. Xác định tốc độ bơm ..................................................................................... 49 3.5. Xác định nhiệt độ đầu vào ............................................................................. 53 3.6. Xác định nhiệt độ đầu ra ............................................................................... 56 3.7. Đề xuất quy trình sấy phun tạo bột phlorotannin chống oxy hóa ................... 58 3.8. Sơ bộ đánh giá chất lượng bột phlorotannin chống oxy hóa .......................... 59 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................................. 61 1. KẾT LUẬN ...................................................................................................... 61 2. ĐỀ XUẤT ......................................................................................................... 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 62 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thông số kỹ thuật của máy sấy phun SD-05 .......................................... 29 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của phlorotannin chiết từ rong Eclonia cava ................. 2 Hình 1.2. Máy sấy phun......................................................................................... 18 Hình 1.3. (a)-Cơ cấu phun áp lực; (b)-Cơ cấu phun bằng khí động ........................ 18 Hình 1.4. Buồng sấy .............................................................................................. 19 Hình 1.5. Sơ đồ hệ thống sấy phun ........................................................................ 20 Hình 1.6. Phân loại thiết bị theo chiều của tác nhân sấy ......................................... 22 Hình 1.7. Máy sấy phun sương .............................................................................. 23 Hình 1.8. Máy sấy phun ly tâm tốc độ cao LPG ..................................................... 25 Hình 1.9. Máy sấy phun áp lực cao ký hiệu YPG................................................... 26 Hình 1.10. Máy sấy phun SD-05............................................................................ 27 Hình 1.11. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy sấy phun SD-05 ........................... 28 Hình 2.1. Sơ đồ dự kiến sấy phun phlorotannin từ dịch chiết rong mơ ................... 33 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát chất trợ sấy ................................................... 34 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát tỷ lệ chất trợ sấy ........................................... 35 Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát áp suất bơm .................................................. 36 Hình 2.5.Sơ đồ thí nghiệm khảo sát tốc độ bơm..................................................... 37 Hình 2.6. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ đầu vào ........................................... 38 Hình 2.7. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát nhiệt độ đầu ra .............................................. 40 Hình 3.1. Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến lượng phlorotannin trong bột sau khi sấy ................................................................................................................... 41 Hình 3.2. Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hoạt tính chống oxy hóa tổng số .......... 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất trợ sấy bổ sung đến hàm lượng phlorotannin thu được trong bột sau sấy ................................................................ 44 Hình 3.4. Sự ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung vào dịch chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng ................................................................................. 45 Hình 3.5. Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hàm lượng phlorotannin trong bột sau sấy ................................................................................................................... 48 vi Hình 3.6. Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của phlorotannin .......................................................................................................... 48 Hình 3.7. Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến hàm lượng phlorotannin trong bột ................................................................................................................ 50 Hình 3.8. Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu đến hoạt tính chống oxy hóa tổng ....................................................................................................................... 50 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào của quá trình sấy đến hàm lượng phlorotannin trong bột sau sấy ............................................................................... 53 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào của quá trình sấy đến hoạt tính chống oxy hóa tổng ............................................................................................... 54 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu ra đối với hàm lượng của phlorotannin trong sản phẩm ................................................................................. 56 Hình 3.12. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ đầu ra đối với hoạt tính chống oxy hóa tổng ....................................................................................................................... 56 Hình 3.13. Quy trình sấy phun dịch chiết phlorotannin tạo bột chống oxy hóa....... 58 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACE: Angiotensin I-converting enzyme DDPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrasyl EC: Eckloniacava ESR: Electron sprin resonance ROS: Regulated Oxygen System UV: Untraviolet UV-B: Ultraviolet-Biological UVR: Ultraviolet iradiation 1 MỞ ĐẦU Ngày nay cùng với sự phát triển của nền kinh tế, đời sống con người ngày càng được nâng cao thì vấn đề sức khỏe là vấn đề luôn được quan tâm hàng đầu. Vì vậy người tiêu dùng ngày càng có xu hướng lựa chọn những thực phẩm tốt cho sức khỏe, như các dạng thực phẩm có chứa hợp chất chống oxy hóa, chống lão hóa, bảo vệ tim mạch. Biển nước ta có trữ lượng rong mơ rất lớn, trong rong mơ có chứa những hoạt chất có hoạt tính sinh học có giá trị trong thực phẩm, dược liệu như: Iod, alginate, fucoidin, phlorotannin, các acid béo.... Do vậy rong mơ đang là đối tượng được các nhà khoa học quan tâm. Hiện nay các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu về phlorotannin- một chất có khả năng chống oxy hóa chỉ có ở rong nâu. Được sự đồng ý của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và khoa Công nghệ Thực phẩm, em thực hiện đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu sấy phun phlorotannin thu nhận từ rong mơ Sargassum thu mẫu tại bờ biển Khánh Hòa” với mục đích xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy phun tạo bột phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa. Từ đó tìm ra điều kiện sấy phun mang lại hiệu quả tốt nhất, ít ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa và lượng phlorotannin thu được là nhiều nhất. Nội dung đề tài: 1)Xác định một số thông số cho quá trình sấy phun phlorotannin: xác định chất trợ sấy, tỷ lệ bổ sung chất trợ sấy, nhiệt độ sấy,… 2) Đề xuất quy trình sấy phun phlorotannin; 3) Sơ bộ đánh giá chất lượng bột phlorotannin; Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu khoa học, trong điều kiện kiến thức còn hạn chế, điều kiện cơ sở vật chất, kinh phí nghiên cứu còn thiếu thốn, ngoài việc nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ của người hưỡng dẫn cùng các giáo viên phụ trách phòng thí nghiệm của trường Đại học Nha Trang, tôi đã hoàn thành đề tài được giao. Tuy nhiên, đề tài không tránh khỏi những hạn chế, rất mong sự quan tâm và góp ý kiến của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về phlorotannin 1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm phlorotannin Tannin [21] được coi là hợp chất tự nhiên phân bố rộng rãi nhất trong thực vật. Các polyphenol này thường được chia thành các nhóm riêng biệt theo cấu trúc của chúng. Chúng bao gồm các flavonoid hoặc các polyme acid galic của thực vật trên cạn, trong khi đó rong biển có chứa các đơn vị phloroglucinol (1,3,5trihydroxybenzene), sau này chúng được gọi với cái tên là phlorotannin. Theo Ragan M. A [21] thì phlorotannin được định nghĩa như sau: Chúng là polyme sinh học được hình thành từ gốc phloroglucinol (1,3,5 trihydroxybenzen) và các gốc này liên kết với nhau bằng nhiều cách khác nhau. Cho đến nay, trên thế giới có một số cấu trúc của các hợp chất thuộc nhóm phlorotannin từ rong Nâu đã được xác định và nhiều dịch chiết thô của chúng đã được khảo sát hoạt tính sinh học. Là những hợp chất có kích thước phân tử nằm trong khoảng (từ 126DA đến 650kDA) và có thể chia thành 6 nhóm cụ thể: fucols, phlorethols, fucophlorethols, fuhalols, isofuhalolsvà eckols (hình 1.1), đặc trưng bởi sự khác biệt trong bản chất các mối liên kết cấu trúc giữa các đơn vị phloroglucinol và số lượng nhóm hydroxyl có trong nó. Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của phlorotannin chiết từ rong Eclonia cava: Phloroglucinol (1), Tetrafucol A (2), Tetraphlorethol B (3), FucodiphloretholA(4), Tetrafuhalol A (5), Tetraisofuhalol (6 ), Phlorofucofuroeckol (7). 3 Phlorotannin chỉ được tìm thấy ở tảo nâu (Phaeophyceae) và sinh tổng hợp thông qua con đường acetate-manolate trong bộ máy Golgi trong khu vực perinuclear của tế bào và được lưu trữ trong các túi gọi là physodes. Là dung dịch không màu và có tính acid, bình thường phlorotannin không được tiết ra ngoài tế bào chỉ đến khi tế bào bị tổn thương thì chúng mới được tiết ra để bảo vệ. Phlorotannin có một loạt các vai trò trao đổi chất, bao gồm cả sơ cấp (ví dụ như xây dựng thành tế bào) và thứ cấp (ví dụ như phòng vệ chống lại các sinh vật ăn tảo và bảo vệ khỏi tia tia cực tím). Các hợp chất phlorotannin chủ yếu được coi như các tác nhân hóa học phòng vệ [21]. Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Đức về việc tạo thành phlorotannin và oxy hóa lipid, như một khả năng để bảo vệ chống lại bức xạ cao và tia cực tím [18] có chỉ ra rằng: Bức xạ UV-B và bức xạ quang hoạt động cao (PAR) đã được chứng minh là có tác động bất lợi trên sinh vật biển. Các tác động của bức xạ UV-B trên các sinh vật đa dạng và dao động từ tế bào đến các mô và cấu trúc bậc cao hơn. Trên cấp độ tế bào, ức chế gây tổn thương DNA, thay đổi về hình thái tế bào, số lượng tế bào, ức chế quá trình quang hợp và thay đổi thành phần của các acid béo. Những thiệt hại do bức xạ có thể là kết quả peoroxy hóa lipid của màng tế bào macroalgal, để ngăn chặn quá trình oxy hóa trong tế bào, các chất chống oxy hóa như phlorotannin được tổng hợp. Trong số nhóm chất của tảo nâu, chỉ có một nhóm của polyphenolic, các phlorotannin, là có thể được coi như là một chỉ số về bảo vệ khỏi UV và khả năng thích nghi đối với UVR. Trong giới hạn bào tử, phlorotannin được đặt trong túi hình cầu của màng liên kết (physodes) được phân phối ngẫu nhiên trên toàn tế bào. Phlorotannin trong tảo trưởng thành nằm trong thành tế bào và tế bào chất cũng như trong các tế bào biểu bì lớp ngoài cùng, trong vỏ tế bào và tận cùng phía trong của tủy cây. Phlorotannin được dựa trên monomer phloroglucinol và có ý kiến cho rằng được hình thành thông qua con đường acetate malonate liên quan đến phức enzyme tổng hợp polyketide. Chúng được chỉ ra ở tảo nâu Saccharina latissima rằng, phlorotannin được hình thành có nguồn gốc từ chất béo lưu trữ ở giai đoạn đầu của quá trình hình thành liên kết trao đổi chất lipid với 4 hoạt tính chống oxy hóa tiềm ẩn. Phlorotannin có rất nhiều chức năng cũng như đóng vai trò quan trọng về sinh thái và đáp ứng một số các thông số môi trường, chẳng hạn như độ mặn, chất dinh dưỡng và ánh sáng sẵn có cũng như UVR và bức xạ cao. Tuy nhiên, thuộc tính quan trọng nhất của phlorotannin trong nghiên cứu này là khả năng hấp thụ ở bước sóng tia cực tím trong khoảng (6, 11, 18, 19, 4042) và quét các gốc tự do hoạt động của chúng (chất chống oxy hóa). Phlorotannin có thể được tích hợp hoặc đi vào trong thành tế bào là chất hỗ trợ hoặc được giải phóng thông qua quá trình tiết dịch vào môi trường nước xung quanh, tạo ra cái gọi là tia cực tím refugia để bảo vệ các tế bào khỏi các bức xạ có hại và động vật ăn tảo. Polyphenol và phlorotannin được biết đến là những chất chống oxy hóa tự nhiên. Polyphenol được tạo nên từ nhiều liên kết vòng và vòng thêm nghĩa là các điện tử có thể được hấp thụ từ các gốc tự do độc hại. Trong khi các chất chống oxy hóa có thể có hai hoặc bốn vòng một đơn vị thì các phlorotannin được chiết ra từ tảo nâu có đến 13 vòng hoạt động do đó khả năng liên kết với các gốc tự do lớn hơn nên hoạt động chống oxy hóa đạt được hiệu quả cao. Tác dụng sinh học của các phlorotannin được giải thích là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do, giống như tác dụng của các chất chống oxy hóa. Các gốc tự do được sinh ra và tích luỹ trong quá trình sống, chính là nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hoá cơ thể con người. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tác dụng của phlorotannin ở mức độ khác nhau đối với bệnh ung thư, bệnh tim mạch, bệnh cao huyết áp, bệnh đường ruột, bệnh răng và có tác dụng làm chậm quá trình lão hoá, tăng tuổi thọ. 1.1.2. Cơ chế, hoạt tính chống oxy hóa và ứng dụng của phlorotannin 1.1.2.1. Cơ chế chống oxy hóa của phlorotannin Cơ chế chống oxy hóa của phlorotannin tương tự như cơ chế chống oxy hóa của polyphenol. Polyphenol được coi là chất chống oxy hóa hữu hiệu nhất hiện nay (gấp 100 lần vitamin C và gấp 25 lần vitamin E). Sự oxy hóa các hợp chất polyphenol có ý nhĩa rất lớn trong sinh tổng hợp nhiều chất tự nhiên như licnhin, alkaloid và melanin. Sự tạo thành các hợp chất này có thể giải thích bằng cơ chế bắt 5 gốc tự do, trong đó ở giai đoạn đầu các hợp chất monomer phenol xuất hiện các gốc phenol. Ở giai đoạn sau, xảy ra sự ghép đôi các gốc tự do với sự tạo thành mối liên kết C-C hoặc C-O-C phụ thuộc vào kiểu ghép đôi [7]. Khả năng chống oxy hóa mạnh của polyphenol được giải thích dựa trên số lượng lớn các nhóm hydroxyl trong công thức của chúng, nó cho phép tiếp nhận electron một cách dễ dàng, tức là chúng có khả năng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do. 1.1.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin Hoạt tính sinh học của phlorotannin được công bố nhiều nhất là hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính này được nghiên cứu thông qua khảo sát khả năng quét các gốc DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrasyl), gốc hydroxyl (-OH), các anion như superoxide anion (O2-), khử săt (III), tạo phức chelat với các ion hóa trị (II) và oxy hóa lipid của chúng. Các nhà khoa học Mexico đã xác định khả năng quét các gốc DPPH, anion O2- và hoạt tính khử của hỗn hợp các chất thuộc nhóm phlorotannin được chiết từ một số loài rong nâu sinh trưởng tại vùng biển nhiệt đới tại Mexico. Họ đã thu các phlorotannin bằng chiết lạnh, sử dụng dung môi là dichloromethanol : methanol (2:1) trong 20 giờ. Kết quả thu được cho thấy tất cả tổng phlorotannin được chiết từ các loài rong (Lobophora variegata, padina gymnospora, Dictyota Cervicornis và một số loài rong thuộc chi Sargassum, chi Turbianaria) đều có hoạt tính chống oxy hóa với giá trị EC50 của gốc DPPH tương ứng như sau: Lobophora variegata: 0.32±0.01 mg/ml, padina gymnospora: 3,45 mg/ml, chi Sargassum: từ 6.64 đến 7.14 mg/ml, chi Tubinaria: 8,85 mg/ml và chi Dictyola: 6.42 mg/ml. Ngoài ra tổng phlorotannin chiết từ loài Labophora variegata còn thể hiện khả năng quét gốc anion O2- và tính khử mạnh [24]. Hoạt động chống oxy hóa của phlorotannin tinh chế từ Ecklonia cava đã được một nhóm các tác giả người Hàn Quốc nghiên cứu và công bố [20]: Các hoạt động chống oxy hóa tiềm năng của ba phlorotannin (phloroglucinol, eckol và dieckol) tinh chế từ Ecklonia cava thu ở đảo Jeju đã được nghiên cứu để đánh giá giá trị tiềm năng của chúng như là các sản phẩm tự nhiên chống oxy hóa trong thực 6 phẩm hoặc ứng dụng mỹ phẩm. Trong nghiên cứu này, chất chống oxy hóa họat động được đo bằng phương pháp quang phổ cộng hưởng quay điện tử (ESR). Quá trình quét các gốc tự do có thể gây ảnh hưởng với các gốc tự do như 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH), alkyl, hydroxyl (HO•) và gốc tự do superoxide anion (O2 • ) và nghiên cứu thử nghiệm đối với bảo vệ hiệu quả chống lại thiệt hại DNA qua trung gian H2O2. Kết quả cho thấy tất cả các phlorotannin có DPPH tiềm năng, alkyl, hydroxyl và hoạt động quét gốc tự do. Đặc biệt, các mẫu eckol scavenged khoảng 93% của DPPH 0,25, 0,5, 1 mg / mL của các nồng độ và cao hơn so với các phlorotannin khác, ví dụ như mẫu phloroglucinol và dieckol. Ngoài ra, bảo vệ hiệu quả của các phlorotannin chống lại thiệt hại DNA qua trung gian H2O2 tăng với nồng độ gia tăng của các mẫu thí nghiệm trên chuột L5178 T-cell lymphoma tế bào dòng (L5178Y-R). Từ những kết quả này cho thấy rằng ba phlorotannin tinh chế từ E. cava có tiềm năng tác dụng ức chế thiệt hại DNA qua trung gian H2O2 và các gốc tự do độc hại và có thể được sử dụng như chất chống oxy hóa trong các ngành công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm. Trong một nghiên cứu tại Hàn Quốc[26] đã chỉ ra các tác dụng ức chế của phlorotannin từ các phần phân đoạn của dịch chiết EC đến sự oxy hóa, đã được kiểm tra trong các nguyên bào sợi biểu bì của con người (HDFs) liên quan đến hình thành nếp nhăn và viêm nhiễm tế bào bạch cầu như U-937 và HL-60. Trong số các phần phân đoạn của dung môi, phlorotannin từ phần ethyl acetate gây hiệu ứng quét gốc tự do cao nhất, cao nhất trên DPPH căn bản, quét các gốc tự do hydroxyl và alkyl một cách triệt để thông qua phân tích quang phổ cộng hưởng xoay điện tử (ESR). Các mức độ ROS trong tế bào, peoroxy hóa lipid và quá trình oxy hóa protein đo bằng cách sử dụng 2,-dichlorofluorescin 7'diacetate (DCFH-DA), diphenyl-1-pyrenylphosphine (DPPP) và hydrazine 2,4-dinitro-phenyl, tương ứng. Mức độ của chúng đã được giảm đáng kể khi có sự hiện diện của phlorotannin từ ethyl acetate phần nhỏ so với các phần phân đoạn khác thu được từ chiết xuất EC (P <0,01). Phlorotannin từ ethyl acetate phần ức chế hoạt động myeloperoxidase HL-60 tế bào được kích thích bởi TNFa. Hơn nữa, mức độ nội bào glutathione 7 (GSH) đã được tăng lên đáng kể phụ thuộc thời gian tồn tại của phlorotannin trong tế bào. Vì vậy, những kết quả này cho thấy rằng phlorotannin chiết xuất từ EC có thể có một tiềm năng điều trị trong công tác phòng, chống và điều trị một số bệnh như hình thành nếp nhăn và tình trạng viêm mãn tính liên quan đến oxy hóa do căng thẳng. Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học người Đức[19] chỉ ra rằng: Phlorotannin được coi là một chất có khả năng bảo vệ cơ thể khỏi một loạt các yếu tố gây căng thẳng, trong khi chất béo trong tế bào được biết đến là yếu tố cung cấp nhiên liệu cho quá trình trao đổi chất khác nhau trong quá trình tạo thành và tiêu diệt các bào tử. Ở đây, phlorotannin là sản phẩm trong zoospore/ gametophyte liên quan đến quá trình trao đổi chất lipid, được điều tra lần đầu tiên trong thí nghiệm nghiên cứu liên quan đến trao đổi chất. Thí nghiệm được thực hiện trên Ny-Ålesund (Svalbard, Bắc cực) trong sự phát triển từ bào tử đến thể trung gian gametophytes của tảo nâu Saccharina latissima hơn 20 ngày. Trong giai đoạn phát hành, thành phần phlorotannin zoospores duy nhất là 1,5 × 10 -7 mg và 1,9 × 10 -7 mg trong môi trường xung quanh. Sau khi phát hành, tổng số lượng của chất béo là 1,76 × 10 -5 mg lipid zoospore -1có chứa các acid béo quan trọng 16:00, 18:00, 18:01 (n9), 18:02 (n-6) 18:03 (n-3), 20:04 (n-6), và 20:05 (n-3).Trong quá trình phát triển từ bào tử đến gametophytes, giảm acid béo đã được quan sát qua kính hiển vi điện tử và giảm 18:01 acid béo (n-9) 45-30% được đo bằng sắc ký khí đặc biệt. Trong khi đó hàm lượng phlorotannin trong các bào tử vẫn ổn định, phlorotannin tích lũy trong môi trường xung quanh của gametophytes 4,0 × 10 -7 mg phlorotannin bào tử -1 cho thấy quá trình tiết dịch. Kết quả thu được hỗ trợ vai trò quan trọng và đa chức năng của chất béo trong quá trình trao đổi chất zoospore/ gametophyte và có thể cho thấy gametophytes của S. latissima cần khoảng 10 ngày để chuyển đổi sang hình thức tự dưỡng, trở thành độc lập của các chất béo lưu trữ. Ngoài ra, acid béo có thể đại diện cho một nguồn năng lượng cần thiết để cung cấp nhiên liệu cho phản ứng thích nghi. 8 Viêm xương khớp được cho là gây ra bởi sự mất mát liên quan đến lão hóa của sự cân bằng hằng định nội môi giữa thoái hóa và cơ chế sửa chữa xung quanh mô sụn, trong đó trung gian viêm nhiễm chẳng hạn như phản ứng oxy, các cytokine và prostaglandin dễ hình thành hơn trong điều kiện sinh lý không ổn định. Phlorotannin là các hợp chất polyphenolic độc đáo mang dibenzo-1, 4-dioxin bộ xương được tìm thấy ở thực vật trên cạn, nhưng chỉ tìm thấy ở một số loài tảo nâu như Ecklonia và Eisenia. Chiết xuất giàu phlorotannin Ecklonia cava cho thấy, hoạt động chống oxy hóa quan trọng như: DPPH triệt để quét các gốc tự do, giảm ion sắt, loại bỏ peroxynitrite, và ức chế quá trình oxy hóa LDL. Vì vậy chúng có thể chống oxy hóa trong cả hai giai bắt đầu hình thành và giai đoạn cuối của viêm xương khớp. Chiết xuất giàu phlorotannin Ecklonia cava cũng cho thấy sự ức chế đáng kể xuống dưới mức quy định của PGE2 thế hệ trong LPS xử lý RAW 246,7 tế bào, và quan trọng hơn đối với con người trong quá trình suy thoái và tái tổ hợp proteoglycan interleukin-1alpha, cho thấy sự tham gia và mang lại lợi ích trong việc khắc phục các hậu quả sinh lý của bệnh viêm xương khớp [23]. 1.1.2.3. Ứng dụng của phlorotannin. Polyphenol là những chất chống oxy hóa, do đó chúng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Ứng dụng được quan tâm nhiều nhất hiện nay là khả năng chống oxy hóa và chữa bệnh của nó. Khả năng ngăn chặn có hiệu quả các quá trình oxy hóa, đặc biệt là quá trình oxy hóa lipid, nên nhóm chất này được dùng để bổ sung vào rất nhiều lĩnh vực như mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm. Riêng trong công nghệ thực phẩm, do đặc điểm có nguồn gốc từ tự nhiên, đảm bảo tính an toàn, nên chúng được sử dụng chủ yếu như một chất phụ gia chống oxy hóa nhằm thay thế cho các phụ gia tổng hợp thường dùng như: BHA (butyl hydroxyl anisol), BHT (butyl hydroxyl toluen)..., những chất này dễ gây tác dụng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng. Polyphenol chủ yếu được ứng dụng để làm bền chất béo trong các sản phẩm bánh kẹo...[7] Ngoài ra polyphenol còn được sử dụng như thực phẩm chức năng, nhằm tăng cường khả năng phòng ngừa và chữa bệnh của cơ thể. Phlorotannin trong tảo nâu 9 còn có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bệnh, ức chế các quá trình phát triển của tế bào ung thư, tế bào HIV, các bệnh thuộc hệ tuần hoàn như điều hòa lượng đường huyết trong cơ thể và các bệnh về đường tiêu hóa. Chúng được bổ sung vào một số thực phẩm chức năng với tác dụng làm giảm khó chịu, tăng cường chức năng gan, hệ thống miễn dịch, tác dụng tốt đối với hệ tiêu hóa, chức năng của dạ dày, ruột và duy trì khối lượng cơ. Trong một nghiên cứu về hoạt tính của phlorotannin chiết xuất từ Eclonia cava của các nhà khoa học Hàn Quốc Wajp Wijesinghe, Seok-Chun Ko và You-Jin Jeon [36] có viết: Các polyphenols nổi bật lên như là một nhóm chất chính của sản phẩm tự nhiên quan trọng đối với sức khỏe con người. Các bằng chứng khoa học cho thấy rằng các polyphenol là chất chống oxy hóa tốt, có hiệu quả trong việc ngăn ngừa bệnh tim mạch và viêm, và cũng có thể được sử dụng để phòng ngừa các tác nhân hóa trị ung thư ứng dụng trong điều trị các chứng bệnh về viêm da dị ứng. Phlorotannin (polyphenol, tảo nâu), một nhóm nhỏ của tannin, nhóm chất được nghiên cứu ít nhất của tannin và chỉ được tìm thấy trong tảo nâu. Chúng được sản xuất hoàn toàn trùng hợp phloroglucinol. Hơn nữa, rong biển màu nâu đã được công nhận là nguồn tiềm năng của các hợp chất này. Dự kiến hàm lượng cao phlorotannin hiện diện trong loài Ecklonia chịu trách nhiệm cho các hoạt động sinh học khác nhau. Ít sự chú ý đã được đưa ra hoặc các hiệu ứng định tính hoặc định lượng của phlorotannin trên cao huyết áp. ACE ức chế hoạt động của phlorotannin từ E. mạch chủ và động học của họ đã không được báo cáo cho đến nay. Sự ức chế enzyme Angiotensin I-converting (ACE) hoạt động là cơ chế phổ biến nhất là cơ sở để hạ thấp huyết áp. Trong nghiên cứu, chiết xuất hữu cơ của tảo nâu Ecklonia cava đã được chiết bằng cách sử dụng ethanol, ethyl acetate, chloroform, hexane và diethyl ether làm dung môi, sau đó được kiểm tra hoạt tính ức chế ACE. Dịch chiết xuất từ dung môi Ethanol cho thấy hoạt động ức chế ACE mạnh nhất với giá trị IC50 là 0,96 mg/ ml. Năm loại phlorotannin, phloroglucinol, triphlorethol-A, eckol, dieckol, và eckstolonol, đã được tìm thấy trong dịch chiết ethanol của E. cava, cho thấy tiềm năng ức chế ACE. Dieckol là chất ức chế ACE mạnh nhất và đã được tìm 10 thấy là một chất ức chế không cạnh tranh chống lại ACE theo lô LineweaverBurk. Dieckol đã có một hiệu ứng cảm ứng vào việc sản xuất NO trong EAhy926 của tế bào mà không có tác dụng gây độc tế bào. Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng, E. cava có thể là nguồn tiềm năng để thu phlorotannin với hoạt động ức chế ACE sử dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng. 1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng và hoạt tính của phlorotannin Tảo biển, giống như thực vật quang hợp khác, được tiếp xúc với một sự kết hợp của ánh sáng và oxy dẫn đến sự hình thành của các gốc tự do và các tác nhân oxy hóa mạnh mẽ khác. Tuy nhiên, không có thiệt hại oxy hóa trong các thành phần cấu trúc (axit béo không bão hòa đa) rong biển và sự ổn định của quá trình oxy hóa trong quá trình lưu trữ cho thấy rằng các tế bào của chúng có tác động phòng ngừa, bảo vệ hệ thống chống oxy hóa. Phlorotannin thường được xác định rằng có chức năng phòng thủ hay bảo vệ, ví dụ như,chống lại động vật ăn cỏ, vi khuẩn, nấm, sinh vật ô nhiễm và bức xạ UV-B, để hoạt động trong vết thương quy trình chữa bệnh, hoặc trong xây dựng thành tế bào [40]. Phlorotannin là polyphenol được hình thành bởi các đơn vị polymerization phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) và chỉ được hình thành trong tảo nâu. Sự thay đổi hàm lượng phlorotannin tổng số đã được nghiên cứu mạnh mẽ, đặc biệt ly do tính chất thích nghi giả định của các hợp chất này ngăn chặn chống lại động vật ăn cỏ. Hàm lượng phlorotannin tổng số thay đổi như là một phản ứng thích nghi với môi trường, các yếu tố như chất dinh dưỡng, độ mặn và sự sẵn có ánh sáng, bức xạ tia cực tím, và cường độ ăn thực vật đều có ảnh hưởng đến hàm lượng của phlorotannin trong tảo nâu[31]. Phlorotannin có chức năng như một phòng vệ hóa học chống lại động vật ăn thực vật và bức xạ tia cực tím, và sản xuất của phlorotannin đã được chứng minh là được gây ra bởi cường độ gia tăng của các yếu tố này[22] Phlorotannin thường tập trung trong màu nâu của rong biển, lượng phlorotannin có trong rong biển là khác nhau giữa các loài, phụ thuộc vào kích 11 thước, độ tuổi của rong biển, độ mặn của nước biển, mùa, mức độ dinh dưỡng, cường độ ánh sáng và nhiệt độ nước. Nồng độ của chúng có thể đạt tối đa trong vùng ôn đới và nhiệt đới của Đại Tây Dương (lên đến 20% khối lượng chất khô của rong biển màu nâu), và tối thiểu trong vùng nhiệt đới Thái Bình Dương và vùng Ấn Độ- Thái Bình Dương [21] Hàm lượng phlorotannin phụ thuộc vào điều kiện môi trường nơi tảo nâu sinh sống và điều kiện thời tiết, mùa vụ. Trong các nghiên cứu về loài tảo nâu ở vùng biển Địa Trung Hải thì, vào mùa hè hàm lượng phlorotannin được tổng hợp nhiều nhất nhiều nhất còn mùa đông là ít nhất. Khi mức độ dinh dưỡng thấp và hạn chế tăng trưởng, tăng mức độ ánh sáng dẫn đến carbon dư thừa có thể được sử dụng cho sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp dựa trên carbon.Các dự đoán của mô hình phụ thuộc vào sự sẵn có tương đối của carbon và nitơ cho các loại thực vật. Mô hình này phù hợp với những quan sát vào việc sản xuất phlorotannin trên tảo nâu trong phản ứng thay đổi mức độ dinh dưỡng và ánh sáng khá tốt,với polyphenolic hiện diện ở nồng độ cao hơn khi hàm lượng nitơ thiếu hụt. Tiếp xúc với ánh sáng mặt trời đã có một ảnh hưởng tích cực về hàm lượng phlorotannin tự nhiên trong quần thể của hai tảo nâu, Ascophyllum nodosum và fucus vesiculosus. Ở tảo non thì hàm lượng phlorotannin trong nó nhiều hơn so với tảo đã trưởng thành. Làm giàu nitơ thì tảo tăng trưởng tăng cường đáng kể tuy nhiên nồng độ phlorotannin giảm. Sắt làm phong phú thêm chứ một mình không có ảnh hưởng nồng độ phlorotannin, nhưng ảnh hưởng đến hình dạng chứ không phải là kích thước tổng thể của phôi. Không có sắt, làm giàu phốt pho không có hiệu lực từ ngày nồng độ tăng trưởng nhưng phlorotannin giảm đáng kể.Làm giàu phốt pho và sắt đã có một ảnh hưởng mạnh mẽ tiêu cực đến nồng độ phlorotannin. Nồng độ Phlorotannin tăng trong tảo tiếp xúc với tia cực tím bức xạ. Các tác giả cho rằng phlorotannin có tác dụng như màn hình cảm ứng chống lại bức xạ tia cực tím có hại vì phlorotannin hấp thụ bức xạ UV-B [35]. Mô phỏng ăn thực vật (gây tổn thương cơ học) đã được được thực hiện để tạo ra sản xuất phlorotannin trong một số nghiên cứu. Phlorotannin cảm ứng có thể 12 xảy ra nhanh chóng, trong vòng 1-3 ngày bị thương. Pavia vàToth phát hiện ra rằng một vài tuần chăn thả gia súc bằng cây dừa cạn ốc Littorina obtusata có thể gây ra việc sản xuất phlorotannin trong Ascophyllum nodosum, nhưng chăn thả bởi isopod Idotea granulosa và mô phỏng ăn thực vật gây ra không đáng kể thay đổi nồng độ phlorotannin. Họ đề xuất rằng mô hình chăn thả gia súc của L. obtusata, mà cuộc sống và nguồn cấp dữ liệu trên một vài loài fucoid tảo, có thể là một yếu tố quan trọng trong việc giải thích tự nhiên sự thay đổi ở các cấp độ của phlorotannin trong A. Nodosum. Cảm ứng của một số động vật ăn cỏ và không phải chúng cho thấy rằng động vật ăn cỏ tín hiệu cụ thể có liên quan. Toth và Pavia thử nghiệm xem đường nước tín hiệu hóa học có thể là quan trọng trong cảm ứng của phlorotannin trong A. nodosum.Họ phát hiện ra rằng các tín hiệu đường nước từ loài nhuyễn thể tích cực cho ăn, L. obtusata, có thể gây ra phlorotannin sản xuất trong các cá nhân không hề hấn gì của tảo biển, làm giảm tính ngon miệng của rong biển để phụ tiê p theo chăn thả gia súc của động vật ăn cỏ. Phlorotannin sản xuất trong tảo bẹ Laminaria hyperborea không gây ra như là kết quả của thiệt hại nhân tạo hoặc chăn thả của loài ốc đá nắp Ansates pellucida hoặc ốc littorinid Lacuna vincta. Thay vào đó, những động vật ăn cỏ này giảm nội dung phlorotannin của chăn thả Gốc tảo bẹ liên quan đến điều khiển ungrazed [35]. Ngoài những thay đổi trong hàm lượng phlorotannin gây ra bởi các chất dinh dưỡng, mức độ của phlorotannin cũng được tìm thấy có thay đổi ở màng tế bào như là một phản ứng với các yếu tố môi trường như độ mặn, tính sẵn có ánh sáng, bức xạ tia cực tím và cường độ ăn thực vật. Trong số các loài tảo bản địa, biến thể nội dung phlorotannin có thể phát sinh từ phản ứng thay đổi môi trường hoặc từ sự phân kỳ di truyền giữa các quần thể, hoặc cả hai [30]. 1.3. Các nghiên cứu về phlorotannin ở Việt Nam và trên thế giới 1.3.1. Tình hình nghiên cứu về phlorotannin ở Việt Nam Hiện nay việc nghiên cứu tách chiết và ứng dụng phlorotannin vào trong thực phẩm tại Việt Nam đã và đang được Viện Nghiên Cứu và ứng dụng Nha Trang tiến hành nghiên cứu: 13 - Năm 2009, Đặng Xuân Cường đã nghiên cứu thành công việc thu nhận dịch chiết kháng khuẩn chứa polyphenol/ phlorotannin từ rong nâu Dictyota dichotoma [1]. - Năm 2010 đến nay, nghiên cứu xây dựng quy trình chiết tách và sàng lọc các chất phlorotannin có hoạt tính sinh học từ rong Nâu tại vùng biển Nam Trung Bộ đang được thực hiện bởi Trần Thị Thanh Vân và cộng sự [37]. - Năm 2010 đến nay, thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang - Khánh Hòa và thử nghiệm sử dụng phlorotannin làm thực phẩm chức năng chống oxy hóa đang được thực hiện bởi Đặng Xuân Cường dưới sự hướng dẫn chính của TS. Vũ Ngọc Bội và TS. Trần Thị Thanh Vân [38]. Ngoài ra có một số công bố về chiết tách và nghiên cứu biến động phlorotannin từ rong nâu đã được công bố bởi Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang. - Sự tích lũy và phân bố phlorotannin chống oxy hóa trong một số loài rong nâu sargassum Khánh Hòa theo thời gian sinh trưởng đã được công bố năm 2011 [2]. - Năm 2011, Đặng Xuân Cường, Trần Thị Thanh Vân, Vũ Ngọc Bội đã ứng dụng mô hình đáp ứng bề mặt Box-Behnken trong tối ưu hóa công đọan chiết phlorotannin từ rong nâu (Sargassum aemulum Sonder) Khánh Hòa [3]. - Tối ưu hóa quá trình chiết phlorotannin từ rong nâu Sargassum baccularia ở Khánh Hòa, Việt Nam bằng phương pháp đáp ứng bề mặt được công bố bởi tài liệu [15]. - Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết polyphenol từ loài rong Sargassum mcclurei [4]. Ngoài ra có rất nhiều các nghiên cứu về hợp chất polyphenol đã được thực hiện và công bố. Dưới đây là một số nghiên cứu về hợp chất này: - Năm 2004, Hoàng Văn Hoan đã công bố kết quả nghiên cứu hoàn thiện công nghệ tách chiết một số hoạt chất từ lá chè và củ nghệ cho ngành Hóa mỹ phẩm và Dược liệu [41].