Tài liệu Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hướng ứng dụng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT PHẠM VĂN PHÖC NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC APTAMER ĐẶC HIỆU KHÁNG SINH TETRACYCLINE VÀ ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 01. 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. LÊ QUANG HUẤN Hà Nội – 2014 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI MỞ ĐẦU Kháng sinh là loại thuốc quan trọng được coi là chiến lược cuối cùng để điều trị nhiễm trùng của con người. Tuy nhiên, hiệu quả điều trị của chúng bị đe dọa do việc sử dụng các kháng sinh rộng rãi và không phù hợp không chỉ trong y học mà còn trong nông nghiệp. Sự hiện diện của dư lượng kháng sinh trong thực phẩm ở trên mức cho phép là bất hợp pháp. Vì vậy, kiểm soát dư lượng trong sữa, trong thực phẩm…đang là vấn đề được xã hội quan tâm. Tetracyline là một nhóm thuốc kháng sinh phổ rộng. Chúng được sử dụng vừa để điều trị bệnh cho cả người và động vật vừa được dùng để kích thích tăng trưởng ở động vật. Do đó, các sản phẩm thực phẩm từ động vật (thịt, trứng, sữa) có nguy cơ chứa dư lượng Tetracycline dẫn đến nguy hại cho sức khỏe người sử dụng. Mức độ tối đa cho phép trong sữa là 100 μg/kg, trong gan là 600 μg/kg và trong thận là 1200 μg/kg (theo tiêu chuẩn Codex). Hiện nay, việc nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh Tetracycline trong thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng chủ yếu dựa trên phương pháp phân tích hóa lý thông thường như phương pháp vi sinh vật, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, ELISA. Các phương pháp này hầu hết cho độ nhạy cao, kết quả khá chính xác. Tuy nhiên, hạn chế của các phương pháp trên ở chỗ đòi hỏi nhiều hóa chất, dung môi; cần lượng mẫu phân tích lớn; không có khả năng phân tích nhanh theo thời gian thực; thiết bị cồng kềnh, sử dụng phức tạp, mặt khác chi phí cho mỗi lần còn đắt đỏ so với điều kiện kinh tế nước nhà. Công nghệ nano đã tạo ra các loại vật liệu thế hệ mới có các đặc tính siêu việt. Các ứng dụng của công nghệ nano vào khoa học sự sống ngày càng được phát triển rộng rãi, trong đó việc sử dụng các vật liệu nano để tạo các cảm biến sinh học (biosensor) đang là hướng nghiên cứu được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và trong nước quan tâm phát triển. Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong việc tạo các cảm biến sinh học là tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Nguyên lý cơ bản của các cảm biến sinh học là xác định các thay đổi về quang hoặc về điện hóa do sự tương tác đặc hiệu của các phân tử. Trong đó các tương tác kháng nguyên-kháng thể, tương tác enzyme-cơ chất, tương tác thụ thể-ligand là những tương tác cơ bản, đóng vai trò then chốt. Mặc dù có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nhưng khả năng ứng dụng của các cảm biến sinh học hiện nay trên thực tế còn nhiều hạn chế do thời gian chuẩn bị mẫu, các thao tác lâu, phức tạp. Hơn nữa, vấn đề thu nhận và tinh sạch các kháng thể, một trong các nguyên liệu then chốt để tạo cảm biến sinh học, là rất phức tạp, tốn kém và độ bền của kháng thể rất hạn chế. Vì vậy, việc sử dụng các phân tử thay thế kháng thể đơn dòng trong chế tạo cảm biến sinh học nhưng vẫn bảo đảm độ nhạy và độ đặc hiệu cao là rất cần thiết, và các aptamer được xem là phân tử thay thế kháng thể đơn dòng phù hợp nhất trong chế tạo các biosensor. Aptamer là các sợi đơn DNA, các phân tử RNA hoặc các đoạn peptide có cấu trúc đặc biệt và có khả năng gắn kết với các phân tử đích khác nhau, chẳng hạn như các phân tử hữu cơ nhỏ, các protein và các tế bào ung thư. Với các đặc tính độc đáo, aptamer trở thành một trong những nhóm chất có nhiều tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư. So với kháng thể đơn dòng thì aptamer có nhiều ưu điểm hơn: (1) aptamer có kích thước phân tử nhỏ hơn kháng thể và không sinh đáp ứng miễn dịch khi sử dụng in vivo, (2) aptamer có khả năng nhận biết và gắn kết đặc hiệu với các phân tử đích tương đương hoặc hơn các phân tử kháng thể, (3) việc chế tạo các aptamer đơn giản, nhanh, hiệu quả vượt trội so việc tạo các kháng thể đơn dòng hoặc các kháng thể tái tổ hợp, (4) aptamer có độ bền với các tác nhân hóa, lý, môi trường cao hơn kháng thể. Vì vậy, aptamer là một trong những hướng nghiên cứu mới của công nghệ gen nhằm sử dụng các chẩn đoán và điều trị miễn dịch. Từ những lí do trên, tôi xin đề xuất đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline và định hƣớng ứng dụng” Mục tiêu của đề tài:  Xây dựng được quy trình sàng lọc được aptamer đặc hiệu kháng sinh Tetracycline  Chọn dòng được ít nhất một phân tử aptamer có ái lực cao với kháng sinh Tetracycline  Bước đầu phát hiện được kháng sinh trong sữa bằng biosensor theo nguyên lý điện hóa 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH TETRACYCLINE 1.1.1. Kháng sinh Tetracycline Tetracycline là một kháng sinh thuộc thế hệ cũ được tìm ra từ năm 1948, nhưng cho đến nay nó vẫn là một loại thuốc tốt. Trong quá trình sử dụng dù tỷ lệ kháng lại khá nhiều nhưng nó vẫn là một kháng sinh công hiệu và chưa thể loại bỏ khỏi tủ thuốc của nhân loại. Tetracycline là một dòng kháng sinh phổ rộng, có hiệu lực với hầu như các vi khuẩn gram âm cũng như gram dương. Nó đã từng được coi là kháng sinh ―bách bệnh‖ dùng cho mọi loại vi khuẩn và được sử dụng khá lạm dụng. Tỷ lệ kháng kháng sinh này khá cao nhưng không phải vì thế mà nó mất đi công hiệu vốn có của mình. Với những tác dụng đặc hiệu thì Tetracycline vẫn được bảo toàn sau 70 – 80 năm và là kháng sinh đầu bảng của các bệnh nhiễm Chlamydiae, bệnh nhiễm Mycoplasma, Rickettsiae như sốt kiểu thương hàn, sốt hồi quy và đặc biệt là nhiễm phẩy khuẩn tả Vibrio cholerae gây ra bệnh dịch tả điển hình trong mùa hè. 1.1.2. Phân loại Hình 1.1. Công thức hóa học chung của nhóm Tetracycline ( Nguồn: Từ Ming Koóng, 2004) 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Kháng sinh nhóm Tetracycline bao gồm 3 loại chính là: Oxytetracycline, Tetracycline và Chlortetracycline. Các loại Tetracycline có cấu trúc cơ bản giống nhau, chúng chỉ khác nhau ở gốc R. 1.1.3. Cơ chế tác động Tetracycline được vận chuyển theo phương thức tích cực qua màng bào tương của các vi khuẩn mẫn cảm với thuốc. Các yếu tố vận chuyển tích cực này chỉ có ở vi khuẩn mà không có ở tế bào vật chủ. Sau khi thuốc vượt qua màng bào tương sẽ gắn vào tiểu phần 30s của Ribosom và đồng thời cũng gắn vào cả ARN thông tin, từ đó ngăn cản sự gắn kết các axit amin vào chuỗi peptid. Qua đó, chúng ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Nếu không có các protein này thì vi khuẩn không thể phát triển, nhân rộng và tăng số lượng. Do đó, Tetracycline làm dừng lại quá trình lây lan và những vi khuẩn còn lại sẽ bị giết bởi hệ thống miễn dịch hoặc tự chết dần dần. Hình 1.2. Cơ chế tác động của Tetracycline (Nguồn: Gary E. Kaiser) Đề kháng Tetracycline là do sự thay đổi khả năng thẩm thấu của vách tế bào vi khuẩn. Ở những vi khuẩn nhạy cảm, thuốc được tập trung vào bên trong và khó thoát khỏi tế bào, còn ở vi khuẩn đề kháng thì thuốc không được vận chuyển chủ động vào bên trong hoặc dễ dàng rời khỏi tế bào một cách nhanh chóng làm nồng độ ức chế của thuốc không còn được duy trì. Cơ chế này được kiểm soát bởi plasmid. 1.1.4. Phổ hấp thụ Kháng sinh nhóm Tetracycline có phổ tác dụng rất rộng. Chúng tác dụng với rất nhiều loại vi khuẩn gram dương và âm, nhiều loại Mycoplasma, Clamidia, 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Richketsia; tác dụng với cả các Protozoa (ở nồng độ cao) như Theileria, Anaplasma, Eperythrozoom. Tác dụng tốt với các Clostridium, Listeria, Streptococcus, E.rhusiopathiae, Brucella, B,bronchiseptica, Klebsiella. Không tác dụng với P.aeruginosa, P. vulgaris [6]. 1.1.5. Sự hấp thu, phân bố và thải trừ Hấp thu Tetracycline thường được hấp thu theo đường uống, có thể tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp cho động vật, tiêm dưới da cho gia cầm. Nếu đưa thuốc bằng đường miệng, kháng sinh nhóm Tetracycline có thể giữ được nồng độ tác dụng trong máu từ 2 – 4h. Oxytetracycline được thải qua phân với nồng độ 2,5 mg/g phân khi cho uống ở người. Khả năng hấp thu của thuốc sẽ giảm đi nhiều nếu cho uống cùng với sữa, các sản phẩm của sữa và các muối của các ion Al3+, Mn2+, Mg2+, Ca2+… Nếu tiêm, thuốc được hấp thu gần như hoàn toàn, nhanh đạt nồng độ hữu hiệu trong máu hơn đường uống. Đưa bằng đường tiêm, thuốc cũng được phân bố trong dịch tổ chức đều hơn, rộng hơn so với uống. Do vậy hiệu quả điều trị cũng cao hơn. Sau khi uống khoảng 2 – 4h, thuốc đạt nồng độ hữu hiệu trong máu và được giữ trong khoảng 6h hay lâu hơn, đôi khi có thể kéo dài tới 24h hay 30h. Nếu cứ sau 6h lại uống 250 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt 1 – 3 μg/ml. Còn uống liều 500 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt 3 – 5 μg/ml. Liều 1 g nồng độ cao hơn 5 μg/ml. Nồng độ này duy trì trong suốt thời gian điều trị. Khi tiềm liều 250 – 500 mg, nồng độ thuốc trong máu đạt từ 5 – 10 μg/ml [6]. Phân bố Hàm lượng thuốc trong các tổ chức có liên quan rất lớn đến liều lượng sử dụng với hàm lượng nước của các mô tổ chức trong cơ thể. Chúng phụ thuộc vào sự liên kết và biến đổi của protein huyết tương. Ví dụ như Chlortetracycline 50 – 70%, Oxytetracycline 20 – 25%. Tất cả các dạng thuốc nhóm Tetracycline sau khi hấp thu được chuyển tới gan theo mật đổ xuống ruột non. Hàm lượng thuốc trong gan, mật bao giờ cũng cao hơn trong máu ít nhất từ 5 – 10 lần. Thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột – máu nên được tồn tại lâu trong máu, vì vậy thời gian tác dụng của thuốc dài. Thải trừ 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Tetracycline phần lớn thải trừ qua nước tiểu. Sự lọc thải của thuốc phụ thuộc vào công năng của thận. Nếu tiêm khoảng 20 – 60%, lượng thuốc được thải qua thận sau 24h đầu. Có khoảng 20 – 55% liều uống cũng được thải qua nước tiểu. Trong đó có khoảng 10 – 35% lượng Oxytetracycline thuốc thải qua nước tiểu dưới dạng còn hoạt tính sau khi dùng thuốc 1/2h đến 5h. Còn Chlortetracycline nếu uống, chỉ có khoảng 10 – 15% lượng thuốc được tìm thấy trong nước tiểu. Sự thải của Chlortetracycline qua thận chỉ khoảng 35%, thấp hơn Oxytetracycline. Nếu tiêm tĩnh mạch, 60% lượng thuốc được thải qua nước tiểu trong 12h đầu. Nếu đưa thuốc qua đường uống, phần Tetracycline không được hấp thu sẽ thải trừ qua đường tiêu hóa (theo phân) dưới dạng còn hoạt lực. Có khoảng 500 – 600 μg Tetracycline trong 1 g phân. Đồng thời một phần lượng thuốc tiêm cũng được thải trừ qua phân do đó thuốc có chu kỳ: máu – gan – mật – ruột rồi theo phân ra ngoài [1]. 1.1.6. Tính kháng thuốc Kháng thuốc diễn ra chậm, theo từng bước tăng dần. Nguyên nhân do sự chuyển vận thuốc qua màng bị rối loạn, giảm dần. Trong trường hợp kháng do R.Plasmid thì ngược lại, lan truyền rất nhanh. Sử dụng Tetracycline quá rộng rãi, không kiểm soát được đã tạo điều kiện làm tăng tình trạng kháng thuốc trong thực tế lâm sàng. Tình trạng kháng thuốc ở các vi khuẩn E.coli, Salmonella, Proteus hầu như giống nhau; tỷ lệ chủng Staphylococcus kháng thuốc thay đổi tùy tình hình, tùy địa phương. Các chủng M.hyoneumoniae, M.bovis, Pasteurella, A.pleuropneumoniae có tỷ lệ kháng ít nhất [6]. 1.1.7. Tác dụng phụ Không thể phủ nhận hiệu lực của Tetracycline trong việc điều trị nhiễm trùng, đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng thuộc những vi khuẩn kể trên. Người bệnh sẽ thấy có sự biến chuyển ngay từ liều đầu tiên cho tới khi khỏi bệnh. Song nó cũng ẩn chứa nhiều nguy cơ có hại về mặt sức khỏe. Khi Tetracycline được sử dụng trong chăn nuôi quá nhiều sẽ dẫn đến dư thừa trong sản phẩm thực phẩm nói chung và trong sữa nói riêng. Hàm lượng dư thừa đó được người sử dụng hấp thụ trong một thời gian dài gây tích lũy và ảnh hưởng có hại tới sức khỏe. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Mặc dù tương đối an toàn, các tác dụng phụ thường gặp nhất ở Tetracycline bao gồm các phản ứng dị ứng từ nhẹ đến trung bình, nhạy cảm với ánh nắng mặt trời, rối loạn dạ dày, hiếm khi nhức đầu nặng và các vấn đề liên quan đến thị lực. Ngoài ra, nhóm kháng sinh Tetracycline có xu hướng tác dụng trên răng và xương trẻ em. Do đặc tính đặc thù là kết hợp và tạo phức hợp bền (chelat) với canxi, thành phần nhiều trong xương và răng nên Tetracycline dễ dàng tạo phức hợp bền với yếu tố này tại hai cơ quan đang cốt hóa. Sự lắng đọng lâu và kéo dài Tetracycline sẽ gây ra hiện tượng hỏng men răng, xỉn răng, hủy hoại sự phát triển xương. Nếu phụ nữ mang thai vào giai đoạn cuối của thai kỳ sử dụng sữa có chứa dư lương Tetracycline thì sẽ ngăn chặn sự phát triển xương của trẻ em. Do vậy, kháng sinh Tetracycline tuyệt đối không được sử dụng ở bà mẹ mang thai thời kỳ cuối (ba tháng cuối) và không dùng cho trẻ em đến khi nào đứa trẻ được 12 tuổi. Do thuốc gây ức chế tổng hợp protein nên nó sẽ gây ra ứ đọng các axit amin, các đơn vị tiền thân của protein. Sự dư thừa các axit amin gây tăng phân giải tạo ra các sản phẩm ure và nitơ. Do đó mà thuốc làm tăng nồng độ ure huyết. Bởi vậy, nếu người già và người bị các bệnh lý về thận mà vô tình bị tích lũy dư lượng Tetracycline thì hậu quả rất nguy hiểm. Chúng sẽ làm cho sự gia tăng ure huyết là đỉnh điểm và gây ra tai biến, có thể dẫn đến hôn mê. Nếu xét về độc tính trên gan thì Tetracycline là một thuốc kháng sinh gây viêm gan điển hình trong họ hàng nhà kháng sinh. Thuốc gây ra viêm gan và viêm tụy mức độ nặng nếu chúng ta dùng liều cao và kéo dài. Do đó, trên những đối tượng sẵn có các bệnh lý về gan và tụy như viêm gan virut, viêm tụy, viêm gan tắc mật, viêm gan vàng da thì việc sử dụng các sản phẩm sữa chứa dư lượng kháng sinh là một yếu tố làm tăng tình trạng bệnh.. Bên cạnh đó, việc tích lũy hàm lượng Tetracycline trong một thời gian dài còn dẫn đến nguy cơ phá vỡ hệ cân bằng các vi sinh vật đường ruột, tạo ra các chủng kháng thuốc kháng sinh. 1.1.8. Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới Nhu cầu về sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi động vật nói chung và nuôi bò sữa nói riêng là rất lớn. Kháng sinh được sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ khi dùng với liều lượng thấp 2,5 – 50 ppm. Việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi được đánh dấu bằng một thí nghiệm của Stokstad và Juke (1949) khi cho gia cầm ăn thức ăn có bổ sung Chlortetracycline, nhận thấy tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của gia cầm tăng rõ rệt. Từ đó rất nhiều công trình nghiên cứu về kháng sinh như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi đã được thực hiện. Bắt đầu từ những năm 1950 và 1960 của thế kỷ 20, một kỷ nguyên mới của ngành chăn nuôi đã được mở ra khi kháng sinh được coi như một yếu tố không thể thiếu, nó đã tạo nên một bước đột phá về năng suất và hiệu quả chăn nuôi ở nhiều nước trên thế giới. Ở Mỹ hàng năm khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong chăn nuôi. Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn; 70% bò sữa và 60% bò thịt ở Mỹ được nuôi dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh và cứ mỗi một USD chi phí cho kháng sinh dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2- 4 USD. Vào năm 1999, chỉ riêng lượng kháng sinh nhóm Tetracycline được sử dụng đã là 1453 tấn, chiếm khoảng 15,67% lượng kháng sinh được dùng (theo số liệu thống kê của viện thú y Mỹ) và đặc biệt khoảng 13,7% tổng lượng kháng sinh được sử dụng với mục đích kích thích sinh trưởng [7] Ở Anh, Tetracycline là nhóm kháng sinh được sử dụng nhiều nhất để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, chiếm hơn 50% tổng số kháng sinh bổ sung vào thức ăn. Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (quy theo mức 100% tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong dân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong đó, tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicillin: 9%; tetracycline: 66%; macrolide: 12%; Aminoglycoside: 4%; Fluoroquinolone: 1%; Trimethomprim/sulpha: 2% và các kháng sinh khác: 6% [6] Tình hình sử dụng kháng sinh tại Việt Nam Từ khi được đưa vào Việt Nam đến nay, kháng sinh ngày càng được sử dụng rộng rãi và liên tục, trong đó có một phần không nhỏ cho lĩnh vực chăn nuôi. Nhằm tăng khả năng chống chịu những thay đổi của môi trường và mầm bệnh nên trong quá trình chăn nuôi, người ta thường sử dụng kháng sinh trộn vào thức ăn, nước 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ uống hoặc tiêm với mục đích kích thích tăng trường, phòng bệnh và trị bệnh. Việc trộn kháng sinh vào thức ăn của vật nuôi với hàm lượng rất cao, không tuân thủ đúng thời gian quy định về ngưng thuốc trước khi xuất chuồng là nguyên nhân chính gây tồn dư kháng sinh trong thực phẩm vượt mức cho phép (Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT). Hậu quả có thể ảnh hưởng tới sức khỏe con người như nguy cơ dị ứng kháng sinh, độc tính mãn tính và gia tăng hiện tượng đề kháng kháng sinh. Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cao: 100% có Oxytetracycline, 67% có Chloramphenicol, 30% có Olaquindox, 77% có Dexamethasol [5]. Khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt ở các quầy kinh doanh gia súc, gia cầm (2003). Điều tra 628 hộ chăn nuôi lợn, gà cho thấy đa số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý như liều cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa bệnh cho gia súc cho đến khi nào bán được. Xét nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh được phát hiện. Trong đó, loại được sử dụng nhiều nhất là Chloramphenicol (chiếm 15,35%), Tylosin (15%), Colistin (13,24%), Norfloxacin (10%), Gentamycin (8,35%), nhóm Tetracycline (7,95%), Ampicillin (7,24%)… Trong đó, Chloramphenicol là kháng sinh hiện đã bị cấm sử dụng trên nhiều quốc gia. Trong 149 mẫu thịt gà được kiểm tra, phân tích có đến 44,96% số mẫu có dư lượng kháng sinh vượt quá mức quy định cho phép từ 2,5 – 1.100 lần so với tiêu chuần ngành. Trong đó, loại kháng sinh Chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất đến 87,50%, Flumequin chiếm 83,33%, Chlortetracycline chiếm 62,50%, Amoxillin chiếm 60%... Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh ở các hộ chăn nuôi trên địa bàn Hà Nội cho thấy tỷ lệ sử dụng các loại kháng sinh là Quinolones 78,14%, Macrolides 86,89%, Polipeptides 54,92%, Aminoglycosides 50,96%, β-lactams 4,58% và Tetracycline 46,58%. Từ năm 2003 – 2006, kết quả phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng trong 150 mẫu thịt và gan của gia cầm, gia súc thu thập tại Hà Nội của Khoa Thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện dinh dưỡng Quốc gia cho thấy: đã 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ phát hiện tồn dư thuốc kháng sinh nhóm Tetracycline trong 18 mẫu, chiếm tỷ lệ 12%. Có 5,5% số mẫu trong 290 mẫu thịt lợn trên thị trường Hà Nội có tồn dư kháng sinh Tetracycline. Tại các khu vực chăn nuôi ở miền nam cũng nhận thấy có 4 cơ sở chiếm 22,2% các mẫu thịt gà có tồn dư các loại kháng sinh Tetracycline, amoxyline, erofloxacine với hàm lượng cao gấp từ 1,4 – 30,9 lần so với ngưỡng cho phép [3]. 1.1.9. Sự tồn dƣ kháng sinh Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi: - Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc - Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh - Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh gia súc - Kháng sinh cho thêm vào thức ăn gia súc để bảo quản súc sản lâu hư - Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với mục đích kéo dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi. Hai là, có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo quản thực phẩm. Do vận chuyển sản phẩm đi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bảo quản [4]. Tác hại của việc tồn dư kháng sinh Việc người chăn nuôi và các bác sỹ thú y sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi, sai nguyên tắc đối với động vật như hiện nay, đặc biệt là ở những nơi trình độ dân trí còn thấp cộng với công tác quản lý của cán bộ nhà nước còn lỏng lẻo đã dẫn tới tình trạng tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật. Không chỉ vậy, việc này còn gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe của con người và về lâu dài còn ảnh hưởng tới cả môi trường sinh sống, cụ thể như sau: - Ảnh hưởng ngay lập tức sau khi tiêu thụ sản phẩm - Phản ứng quá mẫn cảm đối với người nhạy cảm kháng sinh - Gây dị ứng sau khi tiêu thụ thịt tồn dư kháng sinh - Ảnh hưởng muộn hơn khi tiêu thụ thịt tồn dư kháng sinh: - Tạo ra vi sinh vật kháng thuốc 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Gây khó khăn cho công tác điều trị nhiễm khuẩn - Gây tốn kém kinh tế - Làm giảm sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể - Ảnh hưởng tới quá trình chế biến thực phẩm - Một số kháng sinh, hóa dược có thể gây ung thư cho người tiêu thụ Berends B và cộng sự (2001) khi đánh giá mối nguy hiểm của việc quản lý kháng sinh trên động vật giết mổ đối với sức khỏe của người tiêu dùng tại Hà Lan cho thấy: nguy cơ gây hại của dư lượng Tetracycline trong thịt lợn giết mổ gây nên phản ứng dị ứng trên người tiêu dùng là 1/33.000.000 và các rối loạn của vi khuẩn đường ruột là 1/45.000.000 (được ước tính ngẫu nhiên tối đa). Khi so sánh giữa hai nguy cơ gây hại trên đối với sức khỏe của con người, ông đã kết luận rằng: nguy cơ của dư lượng Tetracycline gây rối loạn vi khuẩn được ưu tiên chú trọng. Trong đó, tạo ra sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn là tác hại nghiêm trọng nhất khi sử dụng thực phẩm tồn dư kháng sinh. Việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi (sử dụng không đúng cách trong điều trị, phòng bệnh và dùng trong thức ăn chăn nuôi như chất kích thích sinh trưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng là làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Có ý kiến cho rằng, việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi đã biến vật nuôi thành nơi để một số loài vi khuẩn học cách vô hiệu hóa tác dụng của các loại kháng sinh. Hậu quả của sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn về kinh tế rất lớn. Theo dẫn liệu của Robyn (2002), chi phí điều trị một bệnh nhân mắc bệnh lao ở Mỹ tăng từ 12000 USD (thông thường trước đây) lên 180000 USD cho những bệnh nhân nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc. Tuy nhiên, những thiệt hại về kinh tế không phải là chính yếu mà vấn đề đáng lo ngại không chỉ ở vật nuôi mà ngay cả loài người đang đứng trước hiểm hoạ xảy ra các thảm dịch do những loài vi khuẩn kháng thuốc gây ra mà không thể kiểm soát được [7]. Tình trạng phổ biến của vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam đang ở mức độ báo động. Ngoài nguyên nhân của việc sử dụng kháng sinh một cách rộng rãi trong điều trị y học, nhóm nghiên cứu GARP – Việt Nam (2010) đã nhấn mạnh đến ý nghĩa của việc sử dụng kháng sinh trên động vật ngày một rộng rãi mà chưa bị phát 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hiện về vai trò đối với các căn nguyên gây bệnh ở người. Thực trạng này đã gây ra những ảnh hưởng tiêu cực về kinh tế của mỗi quốc gia. Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy: ở bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ E.coli kháng kháng sinh tăng từ 18% năm 2005 lên 42% năm 2008: cho thấy mức độ kháng kháng sinh Tetracycline 88,6%, ciprofloxacine 82,3% [5] Ngoài ra, sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi còn là mối đe dọa cho môi trường. Kháng sinh vào cơ thể vật nuôi thông qua thức ăn hoặc bằng các con đường khác đều được thải ra môi trường. Ảnh hưởng của việc thải kháng sinh đến môi trường thể hiện ở các khía cạnh sau: Phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất Quần thể vi sinh vật đất có ý nghĩa rất quan trọng trong các chu trình chuyển hoá vật chất trong đất và cải thiện độ phì nhiêu của đất. Kháng sinh dù bằng con đường nào được thải ra môi trường đều phá vỡ sự cân bằng sinh thái hệ vi sinh vật và ảnh hưởng đến độ phì của đất, tăng ô nhiễm môi trường. Sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường Phân của vật nuôi được nuôi dưỡng bằng các loại thức ăn có kháng sinh không chỉ gồm các cặn bã của quá trình tiêu hoá hấp thu mà còn chứa rất nhiều loài vi sinh vật, trong đó có nhiều loài vi khuẩn đã có khả năng kháng một hoặc một vài loại kháng sinh, chính chúng là vật mang và luân chuyển các gen kháng kháng sinh trong môi trường. Với kháng sinh Tetracycline, sự dư thừa trong sữa còn gây thiệt hại về kinh tế vì làm chậm quá trình lên men sữa chua và lên men pho mát. 1.1.10. Quy định tồn dƣ kháng sinh Tetracycline trong thực phẩm Những tác hại nghiêm trọng khi sử dụng kháng sinh bừa bãi trong chăn nuôi hiện nay thực sự đáng báo động. Nhưng nếu loại bỏ hoàn toàn kháng sinh trong điều trị, trong thức ăn thì chắc chắn sẽ làm tăng chi phí cho nhà sản xuất, sản lượng gia súc, gia cầm hàng năm không đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Vấn đề đặt ra là các cơ quan quản lý liên Bộ-ngành về chất lượng vệ sinh anh toàn thực phẩm, chất lượng thuốc thú y trong đó có kháng sinh sử dụng trong thức ăn chăn nuôi thế nào cho đúng và an toàn cho con người. Chẳng hạn như trên thế giới, để tăng cường kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Ủy ban Châu Âu, Mỹ 13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ và các nước phát triển khác đã ban hành các quyết định, quy định giới hạn cho phép thuốc, hóa chất dùng trong thú y bao gồm cả thuốc kháng sinh được dùng trong sản phẩm động vật (chẳng hạn Quyết định sô 2377/90 EC), theo đó các sản phẩm có nguồn gốc động vật phải được kiểm soát dư lượng và tuân thủ các quy trình cụ thể (chẳng hạn Chỉ thị số 96/23 EC). Ủy ban Tiêu chuẩn về Thực phẩm Quốc tế (Codex) đã đưa ra các quy định giới hạn dư lượng tối đa (Maximum Residue Limit, MRL) của nhóm Tetracycline. Tức là lượng kháng sinh cao nhất được phép tồn dư trong thực phẩm mà không ảnh hưởng đến sức khỏe con người và vật nuôi khi sử dụng sản phẩm đó làm thức ăn. Ở Việt Nam, do chưa có các đánh giá nguy cơ toàn diện cho kháng sinh này nên chưa đưa ra được các quy định riêng. Bởi vậy, hiện tại, Việt Nam đang sử dụng các tiêu chuẩn Codex làm quy định. Ngày 19/12/2007, Bộ Y Tế ban hành quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm kèm Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT, trong đó có giới hạn tối đa dư lượng kháng sinh nhóm Tetracycline trong thực phẩm như sau: Bảng 1.1. Dƣ lƣợng tối đa kháng sinh nhóm Tetracycline trong thực phẩm Thực phẩm Thịt Gan Thận Sữa MRL (μg/kg) 200 600 1200 100 1.1.11. Các phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng kháng sinh Các phương pháp phân tích xác định dư lượng kháng sinh trong sữa cũng như trong các mẫu thịt và các mẫu thực phẩm khác có thể phân thành các nhóm phương pháp sau: Phương pháp sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, rẻ tiền và cũng có độ nhạy cần thiết. Phương pháp này chủ yếu cho phép định tính sự hiện diện của các kháng sinh trong mẫu phân tích nhưng đôi khi cũng có thể xác định được lượng kháng sinh trong khoảng 0,4-0,6 μg/kg đối với streptomycin, kanamycin, gentamycin [57], khi sử dụng các hệ dung môi thích hợp, ví dụ Acetone–methanol– ammonia, 5:4,5:0,5 trong phân tích Streptomycin, Chloroform–methanol–ammonia, 1:1:1 trong phân tích Tetracycline. 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phương pháp điện di mao quản là kỹ thuật phân tách có nhiều ưu điểm, hiệu quả và cho phép phân tách đồng thời hàng trăm thành phần khác nhau với nhu cầu lượng mẫu ít. Tuy nhiên, một trong các trở ngại của phương pháp này là độ nhạy. Khi kết hợp với đánh dấu huỳnh quang, phương pháp này có thể xác định được dư lượng kháng sinh trong khoảng nồng độ 0,5-1,5 μg/kg mẫu thực phẩm. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để xác định dư lượng của các aminoglycoside và các macrolide. Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh được đặc trưng bởi 2 hoặc hơn đường gắn với aminocyclitol thông qua liên kết glycoside, ví dụ neomycin, streptomycin, gentamycin, kanamycin. Các kháng sinh thuộc nhóm này ngăn cản sinh tổng hợp protein của vi khuẩn thông qua việc gắn kết thuận nghịch với ribosome và kết quả làm tổn thương màng tế bào vi khuẩn. Trong khi đó, các Macrolide được đặc trưng bởi vòng lactam lớn chứa 14, 15 hoặc 16 nguyên tử carbon gắn với đường thông qua liên kết glycoside. William (1995) sử dụng phương pháp HPLC đã định lượng kháng sinh tetracycline trong các mẫu thịt và sữa bò với ngưỡng giới hạn là 20-50 ppb trong mẫu thịt và 4-8 ppb trong các mẫu sữa [83], xác định được dư lượng kháng sinh sulfamethazine ở 3 trong 4 mẫu sữa bò đã phân tích với hàm lượng 12,2 μg/kg cao hơn rất nhiều so với giới hạn cho phép [20] Sử dụng phương pháp HPLC để xác định các dư lượng kháng sinh Cefotaxime và cephalexine trong sữa, với giới hạn xác định tương ứng là 0,1 và 0,3 ng/ml [68]. Phương pháp này cũng được áp dụng để xác định dư lượng các thuốc thú y có chứa cephalexine. Phương pháp HPLC có thể kết hợp với các phương pháp sắc ký khác như sắc ký khí, khối phổ cho phép xác định chính xác các dư lượng kháng sinh trong các mẫu phân tích. Tuy nhiên, đây là phương pháp yêu cầu trang thiết bị đắt tiền và đội ngũ cán bộ thực hiện được đào tạo chuyên sâu. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: Để kiểm tra dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm có nguồn gốc động vật, phương pháp xác định sự ức chế phát triển của vi sinh vật thường được sử dụng, các xét nghiệm này có giá rẻ và cho phép phân tích một số lượng lớn các mẫu trong một thời gian ngắn. Phương pháp này có phổ rộng và không đặc hiệu. Chất thử nghiệm (sữa hoặc dịch chiết mẫu thực phẩm) được bổ sung vào môi trường thạch nuôi cấy chủng vi sinh vật và vòng kháng 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch được xem xét để đánh giá mức độ tồn dư của kháng sinh trong mẫu phân tích. Chủng vi sinh vật sử dụng trong phép thử, tất nhiên là không thể đặc hiệu với tất cả các kháng sinh. Ví dụ, khả năng phát hiện tốt nhất đối với các kháng sinh nhóm β-lactam là các chủng Geobacillus stearothermophilus, Kocuria rhizophila, và Bacillus subtilis, trong khi đó đối với các kháng sinh macrolide là chủng K. rhizophila. Giới hạn phát hiện tetracycline thấp khi sử dụng chủng Bacillus cereus, còn đối với quinolone là Escherichia coli và Yersinia ruckeri. Sulfonamid được phát hiện khi sử dụng các chủng G. stearothermophilus và Bacillus pumilus. Chủng B. subtilis được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các aminoglycoside [24] Phương pháp Bioautography kết hợp với sắc ký lớp mỏng để xác định dư lượng kháng sinh trong thịt động vật và trong sữa đã tiến hành cho phép xác định được dư lượng một số kháng sinh trong thịt và trong sữa là: 4 μg/L đối với penicillin G, 100 μg/L đối với oxytetracycline, 200 μg/L đối với streptomycin, 100 μg/L đối với gentamicin, và 1000 μg/L đối với neomycin. Và dư lượng kháng sinh trong các mẫu sữa đã tiệt trùng là 150,4 μg/L đối với oxytetracycline, 33,5 μg/L đối với penicillin G, 7688,4 μg/L đối với neomycin và tỉ lệ các mẫu sữa đã phân tích bị nhiễm chiếm 1,25% [45] 1.2. CÔNG NGHỆ NANO VÀ CẢM BIẾN SINH HỌC 1.2.1. Công nghệ nano Công nghệ nano là một trong những hướng nghiên cứu mới, có nhiều ứng dụng trong khoa học và đời sống. Việc kết hợp giữa công nghệ nano và công nghệ sinh học đã và đang mang lại những thành tựu to lớn, cho phép tạo ra những sản phẩm khoa học có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Sử dụng công nghệ nano, các nhà khoa học đã tạo ra các hạt nano, như hạt nano vàng, hạt nano bạc, hạt nano từ, hạt sillica phát quang, hạt quantum dot,...với những đặc tính siêu việt mà các hạt có kích thước lớn không thể có được Hạt nano vàng đã và đang được quan tâm nghiên cứu mạnh vì một số tính năng đặc biệt và có tiềm năng lớn cho việc ứng dụng trong y sinh. Đặc tính ưu việt của các hạt nano vàng là ổn định về cấu trúc, không độc, có khả năng tương hợp sinh học cao và nhất là chúng dễ dàng hoạt hoá để gắn kết với các phân tử sinh học như 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ amino acid, protein, enzyme, DNA và các phân tử thuốc thông qua các chất có chứa nhóm –SH. Với các đặc tính hoá học bề mặt đặc thù này, các nghiên cứu đang tập trung sử dụng hạt nano vàng làm tâm mang cho các hệ thống phân phối thuốc nano, ứng dụng cho chữa trị một số bệnh như ung thư, đái tháo đường .... Về khía cạnh vật lý, nhờ vào hiệu ứng plasmon cộng hưởng nên các hạt nano vàng có thiết diện tắt (hấp thụ và tán xạ) rất mạnh trong vùng nhìn thấy, các hạt nano vàng được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm theo dõi đơn phân tử và hiện ảnh các tế bào ung thư. Với khả năng hấp thụ và tán xạ trải tới vùng hồng ngoại gần của các hạt nano đó, người ta có thể tạo ảnh in vivo sâu trong cơ thể (10 cm) để phát hiện và tiêu diệt các khối ung thư bằng liệu pháp quang nhiệt. , phân đầu dò DNA siêu nhạy (Ultrasensitive DNA detection), chẩn đoán ung thư, máy đếm dòng tế bào (flow cytometry)… 1.2.2. Cảm biến sinh học Các ứng dụng của công nghệ nano vào khoa học sự sống ngày càng được phát triển rộng rãi, trong đó việc sử dụng các vật liệu nano làm các chất đánh dấu và vận chuyển thuốc tới các tế bào đích mang bệnh đang là những hướng nghiên cứu được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và trong nước quan tâm phát triển. Ưu điểm nổi bật đối với việc sử dụng các cấu trúc nano trong việc tạo các cảm biến sinh học (biosensor) là tính đặc hiệu và độ nhạy cao. Các hạt nano thường được sử dụng trong việc tạo các cảm biến sinh học để phát hiện các kháng sinh trong các mẫu thực phẩm cũng như phát hiện các tác nhân gây bệnh trong cơ thể, trong môi trường như các hạt nano vàng, các hạt nano bạc, hạt nano từ hoặc quantum dot [28] Cảm biến sinh học được hai tác giả Clark và Lyons công bố đầu tiên năm 1962, các năm sau đó, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ thông tin, cảm biến sinh học cũng đạt được những tiến bộ vượt bậc. Theo hiệp hội quốc tế về hóa học ứng 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học là một thiết bị tích hợp có khả ăng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phân tử nhận biết sinh học ( bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đồi ( transducer) Hình 1.3. Mô hình cảm biến sinh học Như vậy, có thể hiểu cảm biến sinh học là thiết bị phân tích gồm hai thành phần chính: phần tử nhận biết sinh học và bộ phận chuyển đổi tín hiệu. Phần tử nhận biết sinh học được cố định trực tiếp hoặc gián tiếp trên bộ phận chuyển đổi tín hiệu. Nó là một loại vật liệu sinh học có thể liên kết hoặc phản ứng với cơ chất (chất cần phân tích) sinh ra sản phẩm làm thay đổi tín hiệu sinh hóa trong quá trình phân tích Đầu thu sinh học là nhưng chất có khả năng phản ứng trực tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học. Có thể phân loại cảm biến sinh học theo loại đầu thu sinh học đó là cảm biến enzyme (enzyme sensor), cảm biến DNA (DNA sensor), cảm biến miễn dịch…. Tác nhân cố định là một phần rất quan trọng của cảm biến sinh học. Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên đế. Nói một cách khác đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học với thành phần vô cơ. Những thành phần này vừa phải đảm bảo độ bền cơ học, vừa phải đảm bảo khả năng chuyển tải tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phân chuyển đổi. Việc nghiên 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ cứu lựa chọn những tác nhân cố định thích hợp giúp nâng cao độ nhạy, độ ổn định cho cảm biến sinh học. Bộ phận chuyển đổi: Có nhiều dạng chuyển đổi như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ… Trong đó, chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có nhiều ưu điểm như chế tạo đơn giản, độ nhạy và độ chính xác cao. Có nhiều phương pháp đo tín hiệu điện hóa khi có sự tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích như phương pháp đo dòng, phương pháp đo thế, phương pháp đo độ dẫn, phương pháp đo tổng trở…. Các cảm biến miễn dịch theo nguyên tắc quang và nguyên tắc điện[56], phép thử miễn dịch dòng chảy (flow cytometric immunoassays) đề xuất cũng như công nghệ chip sinh học đã và đang được ứng dụng để phân tích định tính và định lượng kháng sinh tồn dư trong sữa cũng như trong các mẫu thực phẩm [16, 75]. Cảm biến sinh học (cảm biến quang học, optical biosensor và cảm biến điện hóa, electrochemical biosensor) là các hệ cảm biến tương đối mới cho phép xác định nhanh và chính xác dư lượng kháng sinh trong các mẫu phân tích. Sử dụng cảm biến sinh học để xác định dư lượng sulfomamide trong sữa, ngưỡng xác định của cảm biến là 1,44 μg/ml (5,92 nmol/L) [42, 88]. Sử dung biosensor, Sternesjo và cs (2006) đã xác định được dư lượng ampicilin trong các mẫu sữa là 2,5 ng/mL với thời gian cần cho phép thử là 10 phút [72]. 1.3. TỔNG QUAN VỀ APTAMER 1.3.1. Giới thiệu về aptamer Aptamer (thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Latin aptus – phù hợp, tiếng Hy Lạp meros – phần) có bản chất là axit oligonucleic hoặc các phân tử peptide có khả năng liên kết chặt chẽ và đặc hiệu với một phân tử đích cụ thể. Aptamer được phát hiện từ năm 1990 bởi 2 phòng thí nghiệm độc lập Ellington & Szostak, 1990 và Tuerk & Gold, 1990 [27,79]. 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 1.4. Hình ảnh cấu trúc của aptamer khi liên kết với protein và kháng sinh Aptamer được tạo ra theo con đường nhân tạo. Aptamer được sàng lọc bằng phương pháp SELEX – Systematic Evolution of Ligans by Exponential enrichment [79]. Quá trình sàng lọc bắt đầu với thư viện oligonucleotide lớn ngẫu nhiên. Các chuỗi oligonucleotit được ủ với phân tử đích và qua nhiều vòng sàng lọc để lựa chọn những phân tử có ái lực cao với phân tử đích. Sau đó, sử dụng PCR để khuếch đại aptamer mong muốn. Được tổng hợp từ những năm 1990 đến nay, aptamer đã được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các mối nguy, cảm biến sinh học, điều trị ung thư, y dược, thuốc phân tử, điều trị lâm sàng, thực phẩm… Phổ đích của aptamer rất đa dạng từ các ion, các phân tử, các chất, thậm chí cả tế bào [11,43,55,58,59,63,81]. Aptamer còn có khả năng phát hiện các chất độc hoặc các chất không có hoạt tính miễn dịch. Một số aptamer đã được nghiên cứu có hằng số phân ly (Kd) trong phạm vi nanomol hoặc picomol [8]. Trong một số trường hợp vai trò như đầu dò nhận biết phân tử, aptamer có ái lực liên kết thậm chí vượt qua các kháng thể đơn dòng [25,41,63,87]. Đã có Kit thương phẩm của aptamer để nhận biết các phân tử: EGFR (ErbB1), INSR (Isulin Receptor), ErbB2, EphA2, IGF-1R, HGFR (c-MET)…[40] và một số thuốc thương phẩm được xây dựng trên nền tảng aptamer được đưa ra lưu thông trên thị trường. Hơn thế, aptamer còn có nhiều ưu điểm so với các kháng thể (Bảng 1.2). Do đó, 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn/