Tài liệu Nghiên cứu sản xuất văcxin cúm a-h1n1 trên tế bào vero và tế bào phôi gà một lớp

  • Số trang: 240 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 89 |
  • Lượt tải: 0
nguyetha

Đã đăng 8490 tài liệu

Mô tả:

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO PHÔI GÀ MỘT LỚP Mã số: ĐTĐL.2009 G/54 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nguyễn Đăng Hiền Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế 8784 Hà Nội – 2011 i BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO PHÔI GÀ MỘT LỚP Mã số: ĐTĐL.2009 G/54 Các cán bộ thực hiện đề tài 1. PGS.TS.Nguyễn Đăng Hiền 2. PGS.TS.Lê Thị Luân 3. PGS.TS.Đinh Duy Kháng 4. Ts. Nguyễn Thị Quỳ 5. Ths. Cao Xuân Thịnh 6. Ths. Đặng Mai Dung 7. Ts.Nguyễn Thúy Hường 8. Ts.Nguyễn Vân Trang 9. CN.Trần Bích Hạnh 10. CN. Lê Trung Dũng Cơ quan thực hiện: Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế ii CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO BSA : Bovine Serum Albumin CDC : Center for Disease Control and Prevention (Trung tâm Phòng chống và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ) DMEM : Dulbecco’s Modifiled Eagle Medium FBS : Fetal bovine serum HA : Hemagglutinin HAU : Đơn vị kháng nguyên ngưng kết hồng cầu HI : Ngăn ngưng kết hồng cầu LH3E : Lactalbumin hydrolysate Eagle LT : Ly tâm MDCK : Tế bào thận chó (Madin-Darby canine Kidney cell) MEM : Medium Essential Medium Eagle NA : Neuraminidase NBCS : Newborn Caft Serum NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control PCR : Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction) SPF : Trứng gà sạch (Specific pathogen free) SRD : Phản ứng khuếch tán miễn dịch vòng đơn (Single Radial Immunodifution) TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới iii Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................................1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................................................3 1.1. Virút cúm A/ H1N1 .........................................................................................................3 1.1.1. Phân loại.....................................................................................................................3 1.1.2. Hình thái.....................................................................................................................3 1.1.3. Cấu trúc phân tử.........................................................................................................4 1.1.4. Tính kháng nguyên ....................................................................................................5 1.1.5. Sự nhân lên của virút .................................................................................................7 1.1.6. Sự đề kháng với tác nhân vật lý, hoá học ..................................................................9 1.1.7. Độc lực của virút......................................................................................................10 1.1.8. Tính chất nuôi cấy....................................................................................................10 1.1.9. Khả năng gây bệnh và đặc điểm lâm sàng ...............................................................11 1.1.9.1. Khả năng gây bệnh (đáp ứng miễn dịch) ...........................................................11 1.1.9.2. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H1N1 .......................12 1.1.10. Tình hình dịch cúm A/H1N1 tại Việt Nam............................................................12 1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm ..................................................................13 1.2.1. Vắc xin cúm mùa .....................................................................................................13 1.2.1.1. Vắc xin cúm bất hoạt .........................................................................................13 1.2.1.2. Vắc xin cúm nhược độc .....................................................................................14 1.2.2. Vắc xin cúm cho đại dịch.........................................................................................14 1.2.3. Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên thế giới............................................15 1.2.3.1. Văc xin được sản xuất bởi hãng Novartis (Marburg- Đức) ...............................15 1.2.3.2. Vắc xin từ CSL Biotherapies (Parkville-Australia) ...........................................16 1.2.3.3. Vắc xin cúm A/H1N1 do hãng Sinovac của Trung Quốc..................................16 1.2.3.4. Tình hình sản xuất vắc xin tại Việt Nam ...........................................................17 1.3. Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm .............................................................................17 1.3.1. Sản xuất vắc xin cúm bất hoạt trên trứng gà có phôi...............................................17 1.3.2. Sản xuất vắc xin cúm bất hoạt trên tế bào ...............................................................18 1.3.3. Tế bào sử dụng trong sản xuất vắc xin cúm A/H1N1..............................................19 1.3.3.1. Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắc xin ..................................19 1.3.3.2. Các loại tế bào sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 .......19 1.3.3.3. Chủng virút sử dụng trong sản xuất vắc xin ......................................................20 1.3.4. Các phương pháp tạo chủng sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên nuôi cấy tế bào...22 1.3.4.1. Phương pháp tạo dòng thuần chủng từ đám hoại tử (Plaque)............................22 1.3.4.2. Phương pháp tạo dòng bằng phương pháp nồng độ giới hạn (Limited dilution) ..................................................................................................................................23 1.3.4.3. Phương pháp cấy truyền liên tiếp ......................................................................23 1.3.5. Các phương pháp cô đặc và tinh chế virút...............................................................24 1.3.5.1. Các phương pháp cô đặc và sơ chế protein virút ...............................................24 1.3.5.2. Phương pháp tinh chế virút ................................................................................26 CHƯƠNG II.............................................................................................................................30 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................................30 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu trong sản xuất chủng và vắcxin ............30 2.1.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nhân chủng vi rút X-179a trên trứng gà SPF......30 2.1.1.1. Nguyên vật liệu ..................................................................................................30 2.1.1.2.Các bước tiến hành .............................................................................................30 iv 2.1.2. Nguyên vật liệu và phương pháp thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào .............................................................................................................31 2.1.2.1 Trên tế bào vero ..................................................................................................31 2.1.2.2 Trên tế bào phôi gà một lớp ................................................................................32 2.1.3. Nguyên vật liệu và các bước tiến hành nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào vero .........................................................................39 2.1.3.1. Qui trình sản xuất tế bào vero ............................................................................39 2.1.3.2. Qui trình sản xuất hỗn dịch virút .......................................................................39 2.1.3.3. Qui trình tinh sạch..............................................................................................40 2.1.3.4. Qui trình siêu lọc................................................................................................40 2.1.3.5. Siêu ly tâm bằng TNC+40% sacharose .............................................................42 2.1.3.6. Nghiên cứu qui trình bất hoạt ............................................................................42 2.1.3.7. Thẩm định hiệu quả bất hoạt và xác định thời gian bất hoạt .............................43 2.1.3.8. Qui trình loại bỏ ADN tồn dư bằng enzym benzonase ......................................44 2.1.4. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm(Thử nghiệm tiền lâm sàng)...............................................................................................................45 2.1.4.1. Trên chuột lang và chuột nhắt............................................................................45 2.1.4.2. Trên khỉ Macaca mulatta ...................................................................................45 2.2. Nguyên vật liệu và phương pháp tiến hành thử nghiệm kiểm định vắc xin ..................53 2.2.1. Kiểm tra vi khuẩn, nấm (theo dược điển Việt Nam IV) ..........................................53 2.2.1.1. Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy..................................................53 2.2.1.2. Kiểm tra vô trùng bằng thạch máu.....................................................................57 2.2.2. Kiểm tra mycoplasma bằng phương pháp nuôi cấy.................................................58 2.2.3. Qui trình kiểm tra tác nhân ngoại lại tế bào sử dụng sản xuất.................................64 2.2.4. Qui trình kiểm tra nhận dạng cúm A/H1N1(Real time PCR) ..................................66 2.2.5. Qui trình kiểm tra hiệu quả bất hoạt ........................................................................68 2.2.6. Qui trình định lượng kháng nguyên HA( phương pháp SRD).................................72 2.2.7. Qui trình xác định nội độc tố ...................................................................................75 2.2.8. Qui trình xác định formaldehyt tồn dư ....................................................................77 2.2.9. Xác định protein toàn phần ......................................................................................79 2.2.10. Kiểm tra an toàn chung ..........................................................................................79 2.2.11. Thử nghiệm đo pH .................................................................................................80 2.2.12. Qui trình xác định kháng thể cúm bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu........81 2.2.13. Qui trình giải trình tự gen ......................................................................................89 2.2.14. Thử nghiệm phát hiện ADN tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắc xin bằng phương pháp lai điểm....................................................................................91 2.2.15. Xác định hàm lượng hydroxit nhôm AL(OH)3 trong vắc xin................................94 CHƯƠNG III ...........................................................................................................................96 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN..........................................................................96 3.1. Kết quả nhân chủng vi rút X-179A trên trứng gà SPF ..................................................96 3.2. Kết quả thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào...................99 3.2.1. Kết quả thích nghi trên tế bào thận khỉ tiên phát .....................................................99 3.2.2. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero ......................................................105 3.2.2.1. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero ................................................105 3.2.2.2. Kết quả Sản xuất và kiểm định chủng cúm A/H1N1 giống gốc trên tế bào vero ................................................................................................................................107 3.2.3. Kết quả thích nghi trên tế bào phôi gà một lớp......................................................119 3.2.3.1 Môi trường cho tế bào phôi gà P1.....................................................................119 3.2.3.2. Kết quả thích nghi chủng H1N1 trên tế bào phôi gà Po và P1 ........................128 3.3. Kết quả nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 ...................131 v 3.3.1. Kết quả nghiên cứu nghiên cứu qui trình...............................................................131 3.3.2. Kết quả sản xuất vắc xin theo qui trình..................................................................138 3.3.2.1. Qui trình sản xuất và kiểm định vắc xin ..........................................................138 3.3.2.2. Sản xuất và kiểm định 10.000 liều vắc xin theo qui trình................................140 3.4. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm (Tiền lâm sàng) ........................................................................................................................................145 3.4.1. Kết quả an toàn trên chuột lang .............................................................................145 3.4.2. Kết quả an toàn trên chuột nhắt .............................................................................148 3.5. Kết quả an toàn và đáp ứng miễn dịch trên khỉ Macaca Mulatta.................................151 3.5.1. Kết quả an toàn vắc xin..........................................................................................151 3.5.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin trên khỉ thử nghiệm .............................................153 3.5.2.1 Kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu (HI).........................................................153 3.5.2.2. Hiệu giá kháng thể trung hòa ...........................................................................162 3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin cúm A/ H1N1 trên tế bào vero......................170 KẾT LUẬN............................................................................................................................171 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................................174 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................................175 vi Danh mục các bảng Bảng 2.1. Sơ đồ lấy mẫu ..........................................................................................................44 Bảng 3.1. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10-2 ..................................96 Bảng 3.2 Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10-3 ...................................96 Bảng 3.3. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10-4 ..................................97 Bảng 3.4. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10-5 ..................................97 Bảng 3.5. So sánh hiệu giá HA tại các nồng độ gây nhiễm.....................................................98 Bảng 3.6. Sự phát triển của chủng virút X-179A-C trên tế bào thận khỉ tiên phát lần 1.........99 Bảng 3.7. Hiệu giá HA của các chủng trên tế bào thận khỉ tiên phát tại môi trường gây nhiễm khác nhau ...............................................................................................................................100 Bảng 3.8. Hiệu giá HA tại lần thích nghi thứ 3 với nồng độ pha loãng 1/4 ..........................100 Bảng 3.9. Hiệu giá HA tại lần thích nghi thứ 3 với nồng độ pha loãng 1/10 ........................101 Bảng 3.10. Kết quả nhân chủng lần 4 trên tế bào thận khỉ tiên phát .....................................102 Bảng 3.11. Hiệu giá HA sau cấy truyền lần 5 trên tế bào thận khỉ tiên phát .........................102 Bảng 3.12.Tóm tắt kết quả thích nghi chủng trên tế bào thận khỉ tiên phát ..........................104 Bảng 3.13. Hiệu giá HA của chủng cúm A/H1N1 trên tế bào vero.......................................105 Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu nồng độ trypsin thích hợp trên chủng D1V3.......................105 Bảng 3.15. Liều gây nhiễm tối ưu với chủng sản xuất ..........................................................109 Bảng 3.16. Kết quả nhận dạng hỗn dịch virút thu được ........................................................110 Bảng 3.17. Tóm tắt kết quả sản xuất, kiểm định chủng vi rút ...............................................110 Bảng 3.18. So sánh trình tự nucleotide của gen HA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number 063211) .........................................112 Bảng 3.19. So sánh trình tự axit amin của protein HA giữa 5 chủng virút với chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY063211) ...................................114 Bảng 3.20. So sánh trình tự nucleotide của gen NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL/2010 (Accession number CY063213) .......................................115 Bảng 3.21. So sánh trình tự axit amin của protein NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY0632.........................................117 Bảng 3.22. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin........................................117 Bảng 3.23. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng vắc xin X179 và các chủng khác (179M, 179W, HV4 và AV4) ...........................................118 Bảng 3.24. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein NA giữa chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin........................................118 Bảng 3.25. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường 199 với 5% huyết thanh.......................................................................................................................................119 Bảng 3.26. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường 199 với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm2 ..........................................................................................120 Bảng 3.27. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường MEM với 5% huyết thanh.......................................................................................................................................120 Bảng 3.28. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MEM với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm2 ..........................................................................................121 Bảng 3.29. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường LH với 5% huyết thanh.......................................................................................................................................122 Bảng 3.30. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường LH với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm2 ..........................................................................................122 Bảng 3.31. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường DMEM với 5% huyết thanh.......................................................................................................................................123 Bảng 3.32. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường DMEM với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm2 ..........................................................................................124 vii Bảng 3.33. Hiệu giá HA của chủng gốc X-179A-C gây nhiễm trên tế bào với các loại môi trường gây nhiễm ...................................................................................................................128 Bảng 3.34. Hiệu giá HA của chủng X-179A-V gây nhiễm trên tế bào phôi gà với các loại môi trường gây nhiễm ...................................................................................................................128 Bảng 3.35. Hiệu giá HA của chủng X-179A-M gây nhiễm trên tế bào phôi gà với các loại môi trường gây nhiễm ...................................................................................................................129 Bảng 3.36. Hiệu giá HA nghiên cứu chủng X-179A-M trên môi trường DMEM glucosa cao với nồng độ trypsin khác nhau ...............................................................................................129 Bảng 3.37. Hiệu giá HA trong thời gian theo dõi ..................................................................130 Bảng 3.38. Hiệu giá HA trong quá trình cấy truyền liên tiếp ................................................130 Bảng 3.39. Thể tích và hiệu giá vắc xin thô...........................................................................131 Bảng 3.40. Kết quả nghiên cứu tinh sạch kháng nguyên......................................................131 Bảng 3.41. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV06.............................132 Bảng 3.42. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV07.............................133 Bảng 3.43. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV08.............................134 Bảng 3.44. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu ly tâm ........................................135 Bảng 3.45. Kết quả nghiên cứu hiệu quả bất hoạt .................................................................136 Bảng 3.46. Kết quả nghiên cứu sử dụng enzym cắt ADN tồn dư của tế bào.........................138 Bảng 3.47. Kết quả sản xuất loạt FV06 .................................................................................140 Bảng 3.48 Kết quả sản xuất loạt FV07 ..................................................................................141 Bảng 3.49. Kết quả sản xuất loạt FV08 .................................................................................141 Bảng 3.50. Kết quả sản xuất loạt FV09 .................................................................................142 Bảng 3.51. Kết quả sản xuất 4 loạt vắc xin thô......................................................................142 Bảng 3.52. Chất lượng tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin .................................................143 Bảng 3.53. Kết quả formaldehyde trong bán thành phẩm .....................................................143 Bảng 3.54. Kết quả Protein toàn phần trong bán thành phẩm ...............................................144 Bảng 3.55. Kết quả ADN tồn dư trong bán thành phẩm........................................................144 Bảng 3.56. Kết quả vắc xin thành phẩm ................................................................................144 Bảng 3.57. Kết quả định lượng kháng nguyên và mức chuyển đổi đơn vị HA .....................145 Bảng 3.58. Kết quả thử an toàn trên chuột lang.....................................................................145 Bảng 3.59. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trưởng thành ...............................................148 Bảng 3.60. Trọng lượng khỉ (kg) ...........................................................................................151 Bảng 3.61. Trọng lượng khỉ trong quá trình thử nghiệm.......................................................152 Bảng 3.62. Triệu chứng khỉ trong quá trình thử nghiệm .......................................................153 Bảng 3.63. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều ..153 Bảng 3.64. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều ..154 Bảng 3.65 Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều ...155 Bảng 3.66. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều .156 Bảng 3.67. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều ....157 Bảng 3.68. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều ..........................................................................................158 Bảng 3.69. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều ..........................................................................................159 Bảng 3.70. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều ..........................................................................................160 Bảng 3.71. Hiệu giá kháng thể HI khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và không có Al(OH)3 .................................................................................................................161 Bảng 3.72. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30ug/liều........162 Bảng 3.73. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15ug/liều........163 Bảng 3.74. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều........164 viii Bảng 3.75. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5ug/liều.......165 Bảng 3.76. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều..........166 Bảng 3.77. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều......................................................................................167 Bảng 3.78. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều......................................................................................167 Bảng 3.79. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều......................................................................................168 Bảng 3.80. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và không có Al(OH)3.............................................................................................................169 ix Danh mục các hình Hình 1.1. Hình thái các hạt virion của virút cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử (A) và mô hình hạt virút (B)........................................................................................................................4 Hình 1.2. NA phân cắt phân tử axit sialic để giải phóng hạt virút ra khỏi tế bào......................6 Hình 1.3. Chu kỳ nhân lên của virút cúm trong tế bào vật chủ .................................................8 Hình 1.4. Sơ đồ nhân lên của virút RNA sợi đơn, (-) ................................................................9 Hình 2.1. Trứng gà sạch SPF ...................................................................................................30 Hình 2.2. Kiểm tra chất lượng trứng........................................................................................30 Hình 2.3. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI ...................................................................................88 Hình 3.1. Hiệu giá HA gây nhiễm trên trứng tại các nồng độ khác nhau...............................98 Hình 3.2. Hiệu giá HA khi gặt và sau khi đông băng ............................................................106 Hình 3.3. Hình ảnh nhân lên của virút cúm A/H1N1 trên tế bào dưới kính hiển vi điện tử..107 Hình 3.4. Hình ảnh kiểm tra hiệu giá HA của cúm A/H1N1.................................................108 Hình 3.5. Liều gây nhiễm tối ưu ............................................................................................109 Hình 3.6. Chủng vi rút được bảo quản tại tủ âm sâu .............................................................111 Hình 3.7. Môi trường 199 nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp ..............................120 Hình 3.8. Môi trường MEM nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp ..........................121 Hình 3.9. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp...............................123 Hình 3.10. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp.............................125 Hình 3.11. Tỷ lệ tách tế bào sử dụng các loại môi trường với huyết thanh bê bào thai ........125 Hình 3.12. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường M199.........................................................126 Hình 3.13. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường MEM.........................................................127 Hình 3.14. So sánh hiệu giá HA với các màng lọc khác nhau...............................................132 Hình 3.15. Hiệu suất cô đặc loạt FV06 tại các mức độ cô đặc khác nhau.............................133 Hình 3.16. Hiệu suất cô đặc loạt FV07 tại các mức độ cô đặc khác nhau.............................134 Hình 3.17. Hiệu suất cô đặc loạt FV 08 tại các mức độ cô đặc khác nhau............................135 Hình 3.18. Hiệu xuất siêu ly tâm bằng đường và không đường ............................................136 Hình 3.19. Hiệu quả bất hoạt .................................................................................................137 Hình 3.20. Hình ảnh vắc xin pFluvac ....................................................................................142 Hình 3.21. Hình ảnh kết quả định lượng kháng nguyên HA loạt FV-06 (BTP)....................145 Hình 3.22. Trọng lượng chuột lang trong thời gian cách ly...................................................146 Hình 3.23. Tăng trọng chuột lang trong thời gian cách ly .....................................................146 Hình 3.24. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F-0110 .............................................147 Hình 3.25. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F-0210 .............................................147 Hình 3.26. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F-0310 .............................................147 Hình 3.27. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F- 0111 ............................................148 Hình 3.28. Trọng lượng chuột nhắt trong thời gian cách ly...................................................149 Hình 3.29. Tăng trọng chuột nhắt trong thời gian cách ly .....................................................149 Hình 3.30. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0110 .....................................150 Hình 3.31. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0210 .....................................150 Hình 3.32. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0310 .....................................150 Hình 3.33. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0111 .....................................150 Hình 3.34. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều...154 Hình 3.35. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều...155 Hình 3.36. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều...156 Hình 3.37. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều..157 Hình 3.38. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều.....158 Hình 3.39. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều ..........................................................................................................159 x Hình 3.40. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều ..........................................................................................................160 Hình 3.41. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều ..........................................................................................................161 Hình 3.42. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều ........162 Hình 3.43. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều ........163 Hình 3.44. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều .......164 Hình 3.45. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều .......165 Hình 3.46. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều ..........166 Hình 3.47. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều......................................................................................167 Hình 3.48. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều......................................................................................168 Hình 3.49. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều......................................................................................169 Hình 3.50. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và không có Al(OH)3.............................................................................................................169 xi ĐẶT VẤN ĐỀ Dịch cúm luôn là mối quan tâm hàng đầu của nhân loại. Trong lịch sử đã ghi nhận nhiều vụ đại dịch cúm xảy ra với số người thiệt mạng lên đến hàng chục triệu người. Tác nhân gây bệnh của mỗi vụ dịch là khác nhau, như dịch cúm Tây Ban Nha 1918-1919 do H1N1, cúm Hồng Kông 1968-1969 do H3N2 v.v. Từ năm 1997, dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và có tỷ lệ tử vong cao. Tháng 4 năm 2009, dịch cúm A/H1N1 xuất hiện đầu tiên ở Mehicô. Sau đó đã lan nhanh ra toàn thế giới trong một thời gian ngắn. Đây là một chủng H1N1 mới do sự tái tổ hợp từ virút cúm lợn, cúm gia cầm và cúm người tạo thành. Ngày 11 tháng 6 năm 2009, Tổ chức Y tế Thế giới đã tuyên bố dịch ở cấp độ cảnh báo cao nhất, cấp độ 6 - Đại dịch cúm. Sau 41 năm kể từ đại dịch cúm Hồng Kông lại có một đại dịch cúm xảy ra. Tính đến tháng 8/2009 đã có trên 112 nước và vùng lãnh thổ có dịch với trên 209.000 người mắc và trên 2000 người tử vong. Nhiệm vụ cấp bách của thế giới và mỗi quốc gia là làm sao nhanh chóng có được vắc xin phòng bệnh. Ngay giữa tháng 5/2009, TCYTTG đã nhóm họp có sự tham gia của các hãng sản xuất vắc xin lớn trên thế giới để bàn kế hoạch sản xuất vắc xin. 32 nhà sản xuất đã được TCYTTG gửi yêu cầu sản xuất. 24 trong số họ đã chấp thuận yêu cầu và lên kế hoạch sản xuất. Một số phòng thí nghiệm chuẩn về cúm của TCYTTG đã nhanh chóng phân lập, tạo chủng để cung cấp cho các nhà sản xuất tiến 1 hành sản xuất vắc xin như CDC Mỹ với chủng X-179a, NIBSC của Anh với chủng NIBRG-121, Úc với chủng IVR-153 v.v. Theo ước tính, năng lực sản xuất tối đa hiện nay của toàn thế giới cũng chỉ đáp ứng được khoảng 10% dân số nếu có đại dịch xảy ra. Do đó, tất cả các nước cần chủ động nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm để cung cấp cho cộng đồng khi có đại dịch. Cuối tháng 5/2009 dịch cúm A/H1N1 xuất hiện ở Việt Nam. Đến đầu tháng 9 dịch đã lan ra cả 4 khu vực miền Bắc, miền Nam, miền Trung và Tây nguyên với 3201 ca mắc và 2 ca tử vong. Chính phủ đã lập ban chỉ đạo quốc gia phòng chống đại dịch cúm A/H1N1 và giao Bộ Y tế là thường trực. Ban chỉ đạo đã thực hiện một số nhiệm vụ cấp bách nhằm giảm thiểu khả năng lây lan dịch bệnh, giảm tỷ lệ tử vong, liên hệ với các tổ chức quốc tế để nhập vắc xin phòng bệnh. Tới thời điểm tháng 10/2009 có một số hãng đã sản xuất thành công vắc xin này nhưng số lượng rất hạn chế. Những nước này đưa ra chính sách ưu tiên cho quốc gia của họ trước. Tiếp theo đó là một số nước giàu sẵn sàng mua với giá cao để có được vắc xin. Việt Nam chúng ta không nhận được sự trợ giúp nào về vắc xin. Chúng ta cũng chưa sản xuất được vắc xin cúm, kể cả cúm thông thường. Trước tình hình đó, Ban chỉ đạo quốc gia đã huy động toàn bộ các nhà sản xuất vắc xin trong nước tập trung lực lượng để nghiên cứu tự sản xuất vắc xin cúm A/H1N1. Mỗi đơn vị với thế mạnh của mình sẽ nghiên cứu nhằm nhanh chóng tạo ra được vắc xin. POLYVAC được giao nhiệm vụ “Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO và tế bào phôi gà một lớp”. Với mục tiêu là “Sản xuất được vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO hoặc tế bào phôi gà một lớp”. Nội dung cần đạt được: - Nhân chủng virút X-179a trên trứng gà SPF - Thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào - Sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 - Đánh giá tính an toàn và sinh miễn dịch của vắc xin trên khỉ 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Virút cúm A/ H1N1 1.1.1. Phân loại Virút cúm H1N1 thuộc type A chi Influenza virút thuộc họ Orthomyxoviridae bắt nguồn từ hai từ gốc Hy Lạp “Orthos” là “trực tiếp” “myxo” là “tuyến”, bao gồm các virút tấn công trực tiếp vào tuyến đường hô hấp. Có 5 nhóm (týp) virút được xếp vào họ Orthomyxoviridae, gồm: Nhóm virút cúm A (týp A), nhóm virút cúm B (týp B), nhóm virút cúm C (týp C), nhóm virút Isa và nhóm virút Thogoto. Sự phân nhóm virút dựa trên các epitope thuộc kháng nguyên Nucleoprotein (Kháng nguyên NP). Ngoài ra, dựa trên các epitope thuộc kháng nguyên M (Matrix protein) người ta cũng có thể định týp được virút cúm. Phân týp của virút cúm chỉ có ở virút cúm týp A, được xác định bằng mức độ phản ứng chéo của kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA), khi thực hiện phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) và kháng nguyên có hoạt tính emzyme neuraminidase (NA), khi thực hiện phản ứng ức chế neuraminidase (NI). Cho tới nay, người ta đã xác định được 16 phân týp HA (H1 – H16) và 9 phân týp NA (N1 – N9). Giới hạn vật chủ của các phân týp virút cúm A là rất khác nhau. Vì tất cả các phân týp đều có nguồn gốc lây nhiễm từ các loài chim cho nên tất cả các phân týp HA và NA đều đã được tìm thấy trên các loài chim. Tuy nhiên, đối với các loài động vật có vú thì giới hạn vật chủ rất khác nhau. 1.1.2. Hình thái Hạt virút có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình oval có đường kính trung bình từ 80-120 nm, hoặc đôi khi có hình sợi kéo dài tới 2000 nm (hình 1.1). 3 Kênh dẫn truyền ion Vỏ lipid A B Hình 1.1. Hình thái các hạt virion của virút cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử (A) và mô hình hạt virút (B) Các hạt virion của virút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ virút có bản chất là protein có nguồn gốc từ màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hoá và một số protein dạng trần không được glycosyl hoá. Trên vỏ đính các gai glycoprotein, đó là các kháng nguyên Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA). Tỉ lệ HA/NA là 4/1. Virút cúm C chỉ có một gai glycoprotein. 1.1.3. Cấu trúc phân tử Genome của virút cúm A là ARN 1 sợi đơn âm có chiều dài tổng số khoảng 13500 nucleotide, gồm 8 phân đoạn mã hoá cho 8 protein: Phân đoạn 1- 3 mã hoá cho các protein không cấu trúc (enzyme polymerase - protein sớm phục vụ cho sao chép ARN) gồm PB1 (87 kDa), PB2 (84 kDa) và PA (83 kDa); phân đoạn 4 mã hoá cho hemagglutin (HA) (protein bề mặt gắn vào thụ thể tế bào, gây ngưng kết hồng cầu) (63 kDa khi chưa được glycosyl hoá và 77 kDa nếu được glycosyl hoá); phân đoạn 5 mã hoá cho nucleoprotein (NP) (protein muộn đóng vai trò cấu trúc dưới đơn vị nucleocapsid) (56 kDa); phân đoạn 6 mã hoá cho enzyme neuraminidase (NA); phân đoạn 7 mã hoá cho protein đệm (M) (matrix protein), gồm 2 tiểu phần M1 (28 kDa) và M2 (11 kDa); phân đoạn 8 mã hoá cho protein không cấu trúc (NS) (non - structural protein) với chức năng chưa rõ, gồm 2 tiểu phần NS1 (27 kDa) và NS2 (14 kDa). ARN và protein của virút sắp xếp theo kiểu xoắn lò so xung quanh một trục tạo nên cấu trúc đối xứng xoắn hình cầu (đường kính 89 - 120 nm) hoặc hình sợi kéo dài 4 (tới vài µm) của virion. Một hạt virion có trọng lượng phân tử khoảng 250 kilo Dalton. Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền M1; phía ngoài màng là lớp lipid kép có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ, có chức năng chính là ổn định cấu trúc của virút. Lớp vỏ ngoài của virút còn có các glycoprotein (protein đã được glycosyl hoá). Những protein này thực chất là protein của màng tế bào nhiễm đã được biệt hoá để gắn protein màng của virút vào, gồm: protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài và 2 protein gai nhô ra ngoài bề mặt (HA và NA). Virút cúm A được chia thành các phân typ (subtype), phân biệt nhau bởi các kháng nguyên bề mặt hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Có 16 phân typ HA và 9 phân typ NA đã được xác định [3]. Có tất cả 9 biến thể gen NA (N1Æ N9) đã được phân lập từ hạt virút cúm A. Tuy nhiên, chỉ có type N1 và N2 là được phân lập từ chủng virút gây bệnh cho người. Năm 1983, nhờ kỹ thuật X quang tinh thể, các nhà khoa học đã khám phá ra cấu trúc của NA. NA bao gồm 4 dưới đơn vị giống nhau có vùng hoạt động ở phần đầu của enzym này. Nếu không có NA, HA của một virút mới tạo thành sẽ dính vào axit sialic trên bề mặt của tế bào chủ và bề mặt của các hạt virút mới làm virút bất động và không còn khả năng xâm nhiễm vào tế bào khác. Vì vậy, NA có vai trò quyết định trong việc virút mới tạo thành có xâm nhập được vào tế bào khác hay không. 1.1.4. Tính kháng nguyên Các kháng nguyên quan trọng của virút cúm gồm các kháng nguyên đặc hiệu nhóm (typ) và các kháng nguyên đặc hiệu phân typ. Các kháng nguyên đặc hiệu typ bao gồm: Kháng nguyên nucleoprotein (NP) và protein màng M1. Các kháng nguyên đặc hiệu phân typ bao gồm hai kháng nguyên quan trọng nhất của virút là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu HA và kháng nguyên có hoạt tính enzym NA. - Kháng nguyên nucleoprotein (NP): Là protein bao bọc xung quanh các sợi ARN của virút cúm, xuất hiện trong các tế bào nhiễm virút. Sử dụng kháng nguyên này để chẩn đoán cúm bằng phản ứng kết hợp bổ thể (CF) sẽ phát hiện được kháng thể kháng tất cả các phân typ cúm trong cùng một typ nhưng phân biệt được virút cúm thuộc các typ khác nhau (cúm A, B và C). Ngoài ra, kháng nguyên NP còn có vai trò như một 5 kháng nguyên hướng đích chủ yếu tới tế bào lympho T CD8 gây độc tế bào hình thành nên đáp ứng miễn dịch chống nhiễm trùng virút. - Kháng nguyên màng M1: Có vai trò chủ yếu là giữ tính ổn định cho các virion, kiểm soát hoạt tính phiên mã và có vai trò trong lắp ráp các protein mới tổng hợp để hình thành các virion. Kháng nguyên này cũng có thể được sử dụng để chẩn đoán hoặc xác định typ virút cúm A, B, C bằng phản ứng kết hợp bổ thể hoặc khuếch tán miễn dịch hai chiều (DID). - Kháng nguyên HA: Đây là một trong hai glycoprotein quan trọng nằm trên bề mặt của hạt virút và có nhiều chức năng cần thiết: khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virút bằng việc gắn lên các thụ thể axit neuraminic trên bề mặt tế bào vật chủ. Sau khi xâm nhập vào tế bào, HA khởi đầu cho quá trình dung hợp để giải phóng phức hợp RNP vào bào tương. Sự phân cắt HA nhờ enzym phân cắt protein là một quá trình quan trọng quyết định độc lực của virút. Kháng nguyên HA tạo ra đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể HI, đồng thời cũng là kháng thể trung hòa virút. - Kháng nguyên NA: Là glycoprotein quan trọng thứ hai nằm trên bề mặt của hạt virút. NA vừa có tính chất kháng nguyên vừa có hoạt tính enzym. NA cắt các thụ thể gắn HA trên các phân tử mucin của tế bào biểu mô, tạo điều kiện cho virút nhanh chóng lan tỏa ra khắp các tế bào đường hô hấp của vật chủ nhiễm virút. Ngoài ra, hoạt tính enzym của NA còn giúp giải phóng các hạt virút mới tổng hợp ra khỏi tế vào vật chủ (hình 1.2). Hình 1.2. NA phân cắt phân tử axit sialic để giải phóng hạt virút ra khỏi tế bào Sự thay đổi kháng nguyên HA và NA của virút cúm tạo điều kiện cho sự lưu hành của chúng trong quần thể người và không thể dự báo được sự thay đổi đó. Sự thay đổi từ từ của kháng nguyên được gọi là sự trôi kháng nguyên - “antigennic 6 drift”. Đó là kết quả của tích lũy dần các đột biến điểm tại các gen mã hoá cho HA và NA. Sự thay đổi các axit amin liên tiếp trong vùng gen quan trọng được tích lũy từ năm này qua năm khác. Đối với virút cúm A, những kết quả từ áp lực chọn lọc của sự tăng cấp độ miễn dịch trong quần thể người là nguyên nhân của sự trôi kháng nguyên và dẫn tới sự biến đổi đáng kể về kháng nguyên theo chu kỳ từ 2 đến 3 năm. Axit amin thay đổi tại protein HA và NA là khoảng 0,5 đến 1% trong 1 năm. Sự trôi kháng nguyên tạo ra chủng virút gây dịch thường có đột biến tại hai hoặc nhiều vùng của kháng nguyên HA. Một sự thay đổi về kháng nguyên của virút cúm cũng rất được quan tâm đó là sự trượt kháng nguyên -“antigennic shift”. Kết quả thu được là một tổ hợp gen mới (chủ yếu gặp trong gen HA) được hình thành. Hiện tượng này có thể xảy ra khi virút cúm người và virút cúm gia cầm đồng nhiễm trên một tế bào cảm nhiễm hoặc trực tiếp lây truyền từ loài này sang loài khác. Khi virút có sự trượt kháng nguyên – thay đổi cơ bản về kháng nguyên - sẽ dễ dàng lan truyền trong cộng đồng người và đó chính là nguyên nhân gây ra đại dịch mới. Sự trượt kháng nguyên chỉ xảy ra ở virút cúm týp A trong khi sự trôi kháng nguyên xảy ở cả virút cúm týp A và B. Danh pháp Để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ, các chủng cúm sau khi phân lập phải được đặt tên theo danh pháp quy định của Tổ chức Y tế thế giới (WHO). Đối với các chủng virút cúm phân lập từ động vật, trật tự tên được qui định như sau: Týp huyết thanh/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình phân typ theo kháng nguyên HA (H) và NA (N). Đối với các chủng virút cúm phân lập từ người, trật tự tên được qui định như sau: Týp huyết thanh/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình phân typ theo kháng nguyên HA (H) và NA (N). Ví dụ: A/Taiwan/T1773/2009(H1N1) là chủng virút cúm A phân lập từ người tại Đài Loan, ký hiệu chủng là T1773, năm phân lập là năm 2009, có kháng nguyên HA là H1 và NA là N1. 1.1.5. Sự nhân lên của virút Đầu tiên, virút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào nhờ gai glycoprotein HA. Màng tế bào bao lấy virút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế 7 bào chất. Bơm proton trong endosome làm pH giảm xuống 5, tạo điều kiện cho màng virút dung hợp với màng endosome làm giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Sau khi hợp nhất màng, nucleocapsid được vận chuyển vào trong nhân tế bào. Trong nhân sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung [cARN (+)] nhờ enzym ARN - polymeraza phụ thuộc ARN. Chính các cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của virút. Các ARN (-) mới này một phần được phiên mã tạo ra các mARN (+) ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các chức năng khác nhau xảy ra ở tế bào chất. Một số protein được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó, được vận chuyển ra tế bào chất. Tại đây, một số các protein khác được chuyển qua lưới nội chất tới bộ máy Golgi, tương tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việc nảy chồi của virút. Hạt virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất. Phân tử NA phân cắt axit sialic giải phóng virút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm mới (Hình 1.3). Hình 1.3. Chu kỳ nhân lên của virút cúm trong tế bào vật chủ 8 Hình 1.4. Sơ đồ nhân lên của virút RNA sợi đơn, (-) Sau khi xâm nhập và cởi vỏ một phần (bước 1), RNA tiến hành phiên mã nhờ RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp) do virút mang theo để tạo mRNA (bước 2) cho tổng hợp protein cấu trúc và không cấu trúc (bước 3). Enzyme RdRp tiến hành sao chép RNA thông qua bước trung gian là tạo RNA chuỗi dương (đối genome) có chiều dài đủ (bước 4 và 5). Đối genome được dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều RNA genome (bước 5). Một phần RNA genome được dùng để phiên mã mạnh, tạo ra mRNA cần cho tổng hợp protein (bước 6 và 7), một phần để lắp ráp với protein để tạo virút mới (bước 8). 1.1.6. Sự đề kháng với tác nhân vật lý, hoá học Virút cúm tương đối mẫn cảm với nhiệt độ. Khả năng lây nhiễm của virút bị phá huỷ ở 56oC trong 30 phút hoặc chiếu tia cực tím hay bức xạ gamma. Hiệu giá của virút giảm sau một thời gian bảo quản ở - 20oC hoặc đông tan băng nhiều lần. Virút bền vững hơn nếu cho thêm protein như gelatin hoặc albumin huyết thanh bò và bảo quản ở - 70oC. Virút cúm cũng có thể bảo quản bằng cách đông khô, sau đó cất ở 4oC. Khả năng lây nhiễm của virút cũng bị phá huỷ nếu xử lý virút bằng diethyl ether 20% trong 18 giờ ở 4oC, bằng formalin nồng độ 1/4000, Triton X–100 1%, sodium deoxycholate 1% và sodium dodecyl sulfate (SDS) 0,1%. 9
- Xem thêm -