Tài liệu Nghiên cứu sản xuất chế phẩm giàu axit amin và b glucan từ tế bào nấm men saccharomyces cerevisiae để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng và năng lượng cho người​

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LAN ANH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM GIÀU AXIT AMIN VÀ -GLUCAN TỪ TẾ BÀO NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM GIÀU DINH DƯỠNG VÀ NĂNG LƯỢNG CHO NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM GIÀU AXIT AMIN VÀ -GLUCAN TỪ TẾ BÀO NẤM MEN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM GIÀU DINH DƯỠNG VÀ NĂNG LƯỢNG CHO NGƯỜI Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Lê Mai Hương ThS. Vũ Duy Nhàn Họ tên học viên: Nguyễn Thị Lan Anh Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 Hà Nội - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Mai Hương - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS Vũ Duy Nhàn - Viện Hóa học Vật liệu - Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đã tạo điều kiện, quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Lan Anh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm giàu axit amin và -Glucan từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng và năng lượng cho người” là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Lê Mai Hương và ThS Vũ Duy Nhàn. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực và rõ ràng. Đây là đề tài nghiên cứu mới, không giống với các đề tài luận văn nào trước đây, do đó không có sự sao chép của bất kì luận văn nào. Nội dung của luận văn được thể hiện theo đúng quy định, các nguồn tài liệu, tư liệu nghiên cứu và sử dụng trong luận văn đều được trích dẫn nguồn. Nếu xảy ra vấn đề gì với nội dung luận văn này, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm theo quy định. Học viên Nguyễn Thị Lan Anh MỤC LỤC PHẦN I. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1.Đặt vấn đề……………………………………………………………………….1 1.2. Mục đích và yêu cầu……………………………………………………………2 1.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu……………………………………………….2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 2.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae và thành phần hóa học của nấm men 3 2.1.1. Giới thiệu về nấm men Saccharomycescerevisiae ............................................................................... 3 2.1.2. Thành phần hóa học của nấm men Saccharomyces cerevisiae ............................................................ 3 2.1.2.1. Nước................................................................................................................................................................ 3 2.1.2.2. Protein và các loại axit amin ............................................................................................................................. 4 2.1.2.3. Carbonhydrat ................................................................................................................................................... 4 2.1.2.4. Lipit................................................................................................................................................................. 4 2.1.2.5.  - Glucan ........................................................................................................................................................ 4 2.1.2.6. Các nguyên tố khoáng và nguyên tố vi lượng .................................................................................................... 5 2.1.2.7. Vitamin............................................................................................................................................................ 5 2.1.2.8. Enzyme ............................................................................................................................................................ 5 2.2. Cấu tạo thành tế bào nấm men………………………………………………….5 2.3. Các phương pháp thủy phân tế bào nấm men…………………………………..6 2.3.1.Phương pháp hóa học ......................................................................................................................... 6 2.3.2. Phương pháp sinh học ....................................................................................................................... 7 2.3.3. Phương pháp tự phân ........................................................................................................................ 8 2.4. Hiện trạng công nghệ sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae[39]………………………………………………………9 2.4.1. Các nguồn thu sinh khối nấm men giàu protein[15] ........................................................................... 9 2.4.2. Thành phần axit amin trong cao nấm men và các axit amin thiết yếu .................................................10 2.4.2.1. Thành phần axit amin trong cao nấm men ....................................................................................................... 10 2.4.2.2. Các axit amin thiết yếu ................................................................................................................................... 11 2.4.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế phẩm giàu axit amin từ nấm men bia trên thế giới ...................12 2.4.5. Ứng dụng của chế phẩm giàu axit amin từ nấm men bia ...................................................................15 2.4.5.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và chăn nuôi ................................................................... 15 2.4.5.2. Ứng dụng trong công nghiệp lên men .............................................................................................................. 16 2.4.6. Triển vọng thị trường sử dụng chế phẩm giàu axit amin ....................................................................16 2.4.7. Công nghệ thủy phân nấm men thu hồi axít amin tự do và protein [39]..............................................17 2.5. Hiện trạng công nghệ sản xuất chế phẩm giàu -Glucan từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae………………18 2.5.1. Giới thiệu chung về β – glucan..........................................................................................................18 2.5.2. Ứng dụng của -glucan ....................................................................................................................19 2.5.2.1. Ứng dụng trong y dược ................................................................................................................................... 19 2.5.2.2. Ứng dụng trong thực phẩm ............................................................................................................................. 20 2.5.3. Các phương pháp thu hồi, tách chiết, tinh sạch  - glucan từ nấm men ..............................................21 2.5.3.1. Các phương pháp thu hồi, tách chiết  - glucan từ nấm men ............................................................................. 21 2.5.3.2. Các phương pháp tinh sạch  - glucan từ nấm men .......................................................................................... 21 2.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới giá thành của chế phẩm -glucan ..............................................................22 PHẦN III. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................................................. 23 3.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu…………………………23 3.1.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................................................23 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ............................................................................................................23 3.1.2.1. Hóa chất: ....................................................................................................................................................... 23 3.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị: ........................................................................................................................................ 23 3.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………………23 3.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford ..................................................................23 3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số (theo phương pháp Kjeldahl) ....................................24 3.2.3. Phân tích độ hòa tan.........................................................................................................................25 3.2.4. Đánh giá chất lượng nguyên liệu ......................................................................................................25 3.2.5. Xác định hàm lượng chất đắng (bằng phương pháp so màu)..............................................................25 3.2.6. Xác định pH của bã nấm men bằng máy đo pH .................................................................................26 3.2.7. Phân tích độ ẩm nấm men .................................................................................................................26 3.2.8. Phương pháp xác định nồng độ protein tổng .....................................................................................26 3.2.9. Phương pháp xác định axit amin tổng bằng phản ứng Ninhydrin .......................................................26 3.2.10. Phương pháp thu thành tế bào ........................................................................................................27 3.2.11. Tinh sạch axit amin bằng phương pháp trao đổi ion ........................................................................27 3.2.12. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo theo Lecoq (1965) ........................................................28 3.2.13. Phương pháp tách chiết -glucan tổng số........................................................................................28 3.2.14. Phương pháp xác định hàm lượng -glucan (theo phương pháp McCleary và Glennie-Holmes (1985) ..................................................................................................................................................................28 3.2.15. Phương pháp xác định hàm lượng chất béo .....................................................................................29 3.2.16. Phương pháp xây dựng công thức và đánh giá lý thuyết năng lượng của sản phẩm ..........................30 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 32 4.1. Nghiên cứu xác định các điều kiện thủy phân nấm men bia để sản xuất axit amin và –glucan…………………………………………………………………..32 4.1.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tự phân nấm men...............................................................................32 4.1.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ nồng độ % nấm men ............................................................................................. 32 4.1.1.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ tự phân .......................................................................................................... 33 4.1.1.3. pH ban đầu của mẫu nấm men tự phân ............................................................................................................ 33 4.1.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tự phân ................................................................................................... 34 4.1.2. Ảnh hưởng của phương pháp hóa lý đến quá trình thủy phân ............................................................35 4.1.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của tác nhân hóa lý đến quá trình thủy phân. ................................................................ 35 4.1.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân lên hiệu quả của quá trình thủy phân .......................... 36 4.1.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bằng phương pháp sử dụng enzyme ...................................37 4.1.3.1.Lựa chọn enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân nấm men. ......................................................................... 37 4.1.3.2. Nghiên cứu các điều kiện thích hợp của enzyme thủy phân nấm men ............................................................... 38 4.2. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm giàu axit amin……………………………….42 4.2.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp thu nhận dịch chứa protein sau quá trình thủy phân tế bào Saccharomyces cerevisie ............................................................................................................................42 4.2.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô của dịch trước khi lọc .................................................................................. 42 4.2.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất trợ lọc ..................................................................................................................... 43 4.2.1.3 Ảnh hưởng của tốc độ bơm .............................................................................................................................. 43 4.2.2. Nghiên cứu công nghệ tinh sạch axit amin tổng số ............................................................................44 4.2.2.1. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch ..................................................................................................................... 44 4.2.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ protein đến hiệu quả tinh sạch bằng trao đổi ion ......................................................... 45 4.2.2.3. Lựa chọn chế độ cô thích hợp ......................................................................................................................... 46 4.2.3. Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ thích hợp trong quá trình tinh sạch. .............................47 4.2.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ protein trước khi bơm vào cột .................................................................................... 47 4.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch .................................................................................................... 48 4.2.3.3. Nghiên cứu tinh sạch ở quy mô pilot ............................................................................................................... 48 4.2.4. Nghiên cứu tạo dạng sản phẩm .........................................................................................................49 4.2.4.1. Lựa chọn phương pháp sấy thích hợp cho việc tạo sản phẩm bột giàu axit amin từ nấm men. ........................... 49 4.2.4.2. Nghiên cứu điều kiện sấy phun sản phẩm bột giàu axit amin từ nấm men ......................................................... 51 4.2.5.Xây dựng quy trình cho các bước công nghệ của các quá trình sản xuất chế phẩm giàu axit amin làm thức ăn bổ sung cho người .........................................................................................................................52 4.3. Kết quả nghiên cứu sản xuất thực phẩm giàu -Glucan………………………55 4.3.1.Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tinh sạch -glucan .......................................................................55 4.3.2.Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ bổ sung enzyme lipase thích hợp tinh sạch -glucan ...................................56 4.3.3.Nghiên cứu lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp tinh sạch -glucan ..............................................57 4.3.4.Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp cho quá trình tinh sạch -glucan ..........................58 4.3.5.Nghiên cứu lựa chọn pH thích hợp cho quá trình tinh sạch -glucan tổng số ......................................58 4.3.6.Nghiên cứu tạo dạng sản phẩm -glucan làm thức ăn cho người ........................................................59 4.3.6.1.Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo sản phẩm .............................................................................................. 59 4.3.6.2.Nghiên cứu tạo sản phẩm -glucan dạng bột bằng phương pháp sấy phun ......................................................... 59 4.3.7.Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm β-glucan ................................................................................63 4.4. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm dinh dưỡng và năng lượng giàu axit amin và thực phẩm chức năng chứa  - glucan 65 4.4.1. Nghiên cứu sản xuất thực phẩm dinh dưỡng và năng lượng giàu axit amin ........................................65 4.4.1.1. Nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu .................................................................................................................... 65 4.4.1.2. Xây dựng công thức ....................................................................................................................................... 66 4.4.1.3. Xây dựng quy trình sản xuất lương khô ........................................................................................................... 71 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 76 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa của từ viết tắt OD Optic density: Độ hấp thu của mẫu thử S. cerevisiaes Saccharomyces cerevisiae E.coli Escherichia coli C.saitoana Candida saitoana IGF-1 Insulin-like Growth Factor-1:Yếu tố tăng trưởng giống Insulin-1 BSA Bovine Serum Albumin: dung dịch máu huyết thanh bò TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam YGT Nấm men bánh mỳ Đ/C Đối chứng proPO prophonoloxidaza Pmt Áp suất riêng của hơi nước trong môi trường cs Cộng sự v/p Vòng/phút DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần axit amin trong cao nấm men ............................................. 11 Bảng 2.2 Nhu cầu tối thiểu của các axit amin cần thiết của con người .................. 12 Bảng 3.1. Bảng tính toán các loại thực phẩm khác ................................................. 30 Bảng 3.2. Đánh giá lý thuyết khẩu phần ................................................................ 31 Bảng 3.3. Đánh giá mức đáp ứng nhu cầu.............................................................. 31 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến hiệu suất thủy phân ..................... 32 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân ................................... 33 Bảng 4.3: Ảnh hưởng pH đến hiệu suất thủy phân ................................................. 34 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của hàm lượng HCl đậm đặc lên hiệu quả của quá trình thủy phân ...................................................................................................................... 36 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân bằng tác nhân HCl ...... 36 Bảng 4.6: Nghiên cứu lựa chọn enzyme thủy phân nấm men ................................. 38 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới hiệu suất thủy phânnấm men ......... 39 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của pH tới hiệu suất thủy phân nấm men ............................. 39 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới hiệu suất thủy phân nấm men ... 40 Bảng 4.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất thủy phân nấm men ................... 41 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô của dịch trong lọc tinh ..................... 42 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của chất trợ lọc ................................................................... 43 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch vào máy lọc khung bản ..................... 44 Bảng 4.14. Thành phần hóa học của bã nấm men trước và sau khi lọc ................... 44 Bảng 4.15. Ảnh hưởng của tốc độ chảy ................................................................. 45 Bảng 4.16. Ảnh hưởng của nồng độ dịch protein đến hiệu quả tinh sạch................ 46 Bảng 4.17. Lựa chọn chế độ cô thích hợp .............................................................. 46 Bảng 4.18. Kết quả tổng kết quá trình thu nhận và tinh sạch axit amin từ nấm men .............................................................................................................................. 47 Bảng 4.19.Ảnh hưởng của nồng độ dịch protein đến hiệu quả tinh sạch................. 47 Bảng 4.20.Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến quá trình tinh sạch ....................... 48 Bảng 4.21. Tổng kết quá trình thu nhận và tinh sạch protein quy mô pilot ........... 49 Bảng 4.23. Kết quả lựa chọn điều kiện sấy phun.................................................... 51 Bảng 4.24: Ảnh hưởng của phương pháp tinh sạch tới hiệu suất thu hồi ................ 56 Bảng 4.25: Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ bổ sung enzyme lipase tới quá trình tinh sạch -glucan......................................................................................................... 57 Bảng 4.26: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân enzyme lipasse tới quá trình tinh sạch -glucan......................................................................................................... 57 Bảng 4.27: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình tinh sạch-glucan ...... 58 Bảng 4.28: Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới thu nhận -glucan tổng số .............. 58 Bảng 4.29: Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tạo sản phẩm cho chế phẩm -glucan làm thức ăn cho người ........................................................................................... 59 Bảng 4.30: Ảnh hưởng của tỷ lệ chất mang .......................................................... 60 Bảng 4.31: Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào -glucan đã tinh sạch của dịch trước sấy phun ....................................................................................................... 61 Bảng 4.32: Ảnh hưởng của chế độ sấy phun .......................................................... 62 Bảng 4.33. Thành phần dinh dưỡng trong mỗi loại thực phẩm khảo sát ................. 66 Bảng 4.34. Khối lượng các thành phần sinh nhiệt .................................................. 68 Bảng 4.35. Tỉ lệ và thành phần lipid và glucid để tạo bột bán thành phẩm ............. 68 Bảng 4.36. Công thức để sản xuất thử nghiệm bột bán thành phẩm ....................... 69 Bảng 4.37. Khẩu phần ăn được bố sung ................................................................. 69 Bảng 4.38. Công thức của sản phẩm lương khô ..................................................... 70 Bảng 4.39. Công thức để sản xuất lương khô ......................................................... 70 Bảng 4.40. Tiêu chí gói thực phẩm chức năng ......... Error! Bookmark not defined. Bảng 4.41. Công thức gói thực phẩm chức năng ..... Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1. Ảnh hưởng của thời gian tự phân từ bã nấm men bia............................. 35 Hình 4.2. Sơ đồ quy trình sản xuất giàu axit amin................................................. 53 Hình 4.3.Quy trình sản xuất chế phẩm β-glucan ................................................... 63 Hình 4.4. Quá trình tạo dạng sản phẩm giàu axit amin .......................................... 67 Hình 4.5. Quy trình sản xuất lương khô ................................................................ 71 Hình 4.6. Quy trình sản xuất gói thực phẩm chức năng......... Error! Bookmark not defined. PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Nấm men là một nguồn thức ăn bổ sung có giá trị cao và không cholesterol. Hàm lượng protein trong nấm men đạt từ 40 – 60%, với axit amin không thay thế gần giống protein của động vật [5,13,14]. Hệ số hấp phụ của protein này cũng rất cao. Hàm lượng vitamin trong nấm men với hoạt tính cao hơn gấp 2 -3 lần so với vitamin tổng hợp [14]. Nấm men còn cung cấp vitamin B tự nhiên phong phú, chứa nhiều enzym kích tố có ảnh hưởng tốt tới quá trình trao đổi chất, nhưng không gây độc hại cho cơ thể[13]. Trên thế giới đã có nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tận dụng nấm men bia Saccharomyces cerevisiaevào các mục đích khác nhau, sử dụng dịch chiết nấm men bia đã khử đắng được tận dụng làm thuốc bổ, sử dụng sinh khối nấm men bia được tận dụng làm thức ăn gia súc. Với sự phát triển của khoa học hiện đại ngày nay đã phát hiện ra sự phong phú về thành phần dinh dưỡng của nấm men như các vitamin, axitamin, -Glucan… Từ đó có rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là ở Nhật, Đức, Pháp rất quan tâm và đã tận dụng nguồn sinh khối nấm men sản xuất ra các chế phẩm giàu axitamin, cao nấm men… Để ứng dụng trong các lĩnh vực y học, dược học, công nghiệp thực phẩm và công nghệ lên men. Trong công nghệ lên men, chế phẩm này là nguồn bổ sung nitơ và các chất kích thích lý tưởng cho quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây ngành sản xuất bia đã có những bước phát triển mạnh mẽ, tiêu thụ bia tại Việt Nam tăng trung bình 12% giai đoạn 20062010, tăng 13% giai đoạn 2011-2015[12]. Hiện cả nước có hơn 400 nhà máy bia. Như vậy với sản lượng bia sản xuất khoảng 5 tỷ lít bia sẽ thải ra một lượng nấm men vô cùng lớn, theo ước tính cứ sản xuất 1000 lít bia có thể thu được từ 12-15 kg nấm men dạng sệt. Trong thực tế thì một lượng nấm men dư tương đối lớn được bán cho các hộ gia đình chăn nuôi làm thức ăn thô cho gia súc, gia cầm, tôm, cá. Việc sử dụng như vậy không những không tận dụng được triệt để nguồn dinh dưỡng quý giá của nấm men, mà còn có thể gây ra sự ô nhiễm môi trường. Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu tận dụng nấm men bia để tạo bột nấm men ứng dụng trong chế biến thực phẩm và bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Các dạng chế phẩm này chủ yếu dùng phương pháp tự phân hoặc có bổ sung 1 enzyme Neutrase trong quá trình thủy phân và để nguyên cả xác tế bào nấm men, nên chất lượng sản phẩm chưa cao chưa đáp ứng được nhu cầu ngày đòi hỏi càng cao của thị trường, như ngành công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm đặc biệt là ngành công nghệ lên men vẫn phải nhập khẩu cao nấm men với giá rất đắt 2-2,7 triệu/kg. Sản xuất bột giàu axit amin và giàu -Glucantừ nấm men bia nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước là nhu cầu hết sức cấp thiết. [11] Việc chiết xuất các chất có lợi từ nấm men bia để bổ sung cho thực phẩm chức năng là một đóng góp có giá trị cho đời sống xã hội. Ý nghĩa hơn nữa là việc này tận dụng được nguồn nguyên liệu khá dồi dào trong nước (hầu như địa phương nào cũng có nhà máy bia), nên sẽ giảm rất nhiều giá thành cho ngành sản xuất thực phẩm chức năng trong nước. Sản xuất bột nấm men giàu axit amin và -Glucanvào làm thức ăn cho người, quy trình sản xuất an toàn, các công đoạn trong quy trình tối ưu hóa để có thể thu hồi axit amin và -Glucanvới hiệu suất cao nhất, giá thành hợp lý, đáp ứng được nhu cầu khi ứng dụng vào sản xuất công nghiệp các sản phẩm thực phẩm khác. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm giàu axit amin và -Glucan từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae để làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm giàu dinh dưỡng và năng lượng cho người” với mục đích đóng góp một loại sản phẩm dành cho người sử dụng hiệu quả trong các hoạt động và điều kiện đặc biệt hiện nay. 1.2. Mục đích và yêu cầu - Sản xuất được hỗn hợp axit amin và-Glucan từ tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. - Sản xuất được thực phẩm giàu dinh dưỡng, năng lượng cho người từ nguồn nguyên liệu axit amin vàthực phẩm chức năng chứa -Glucan. 1.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: Viện Hóa học Vật liệu - Viện Khoa học và Công nghệ Quân sự Việt Nam - Thời gian nghiên cứu: 06/2014-12/2015 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae và thành phần hóa học của nấm men 2.1.1. Giới thiệu về nấm men Saccharomycescerevisiae Không một nhóm vi sinh vật nào lại gắn liền với sự tiến bộ và phồn vinh của loài người hơn là nấm men. Đây là nhóm vi sinh vật đã được con người sử dụng rất nhiều trong sản xuất và nghiên cứu khoa học. Các sản phẩm từ nấm men chiếm gần 70% tổng số các sản phẩm sinh học trên toàn thế giới. Có thể nói nấm men là đối tượng quan trọng bậc nhất của ngành công nghệ sinh học hiện đại, nó được ứng dụng trong nhiều ngành, nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau như: sản xuất nấm men bánh mì, lên men bia rượu, sản xuất các chế phẩm enzyme, các chế phẩm giàu axitamin, cao nấm men…[5]. Nấm men là vi sinh vật điển hình của nhóm nhân thật là một loại nấm đơn bào, sinh sản bằng phương pháp nẩy trồi hoặc tự phân đôi tế bào. Loại nấm men mà các nhà máy bia, rượu thường sử dụng là Saccharomyses cerevisiace, kích thước của tế bào nấm men rất nhỏ từ 5-10µm, nó thường có dạng hình trứng hoặc hình bầu dục. Hình thái cũng như thành phần hóa học của nấm men phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy, thành phần dinh dưỡng và trạng thái sinh lý của tế bào. Người ta thường chia các hợp chất trong tế bào nấm men ra thành nước và các chất khô gồm: protein, vitamin, carbonhydrat, lipit các nguyên tố vi lượng tro và một số chất có hoạt tính sinh học [5]. 2.1.2. Thành phần hóa học của nấm men Saccharomyces cerevisiae 2.1.2.1. Nước Trong tế bào nấm men nước chiếm tỷ lệ khá cao khoảng 75-85% trọng lượng tế bào. Nước trong tế bào gồm 2 dạng: nước tự do và nước liên kết. Nước tự do trong tế bào có tác dụng hòa tan các chất vô cơ, hữu cơ. Hàm lượng nước tự do có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện bên ngoài, trạng thái tế bào, lứa tuổi. Sự mất nước tự do có thể làm rối loạn sự trao đổi chất của tế bào nấm men Nước ở dạng liên kết nằm trong tế bào chất, đóng vai trò quan trọng trong đời sống tế bào. Nước này liên kết với các hợp chất thể keo của tế bào bằng hấp thụ hoặc nối hóa học, còn gọi là nước cấu tạo. Nước cấu tạo khó tách khỏi tế bào và khi mất đi sẽ phá vỡ cấu tạo tế bào, tế bào nấm men sẽ bị chết. 3 2.1.2.2. Protein và các loại axit amin Protein là thành phần quan trọng nhất trong tế bào nấm men, chiếm chủ yếu trong phần chất khô của tế bào, thường là 50-70% trọng lượng chất khô, gồm protein đơn giản và phức tạp (lipoprotein và nucleoprotein ). Protein có ở hầu hết các bộ phận tế bào nấm men trong đó tập trung ở các tế bào và ở màng nguyên sinh chất của tế bào ( chiếm 10% trọng lượng khô của vách tế bào và 50% trọng lượng khô của màng nguyên sinh chất).Vềtính chất protein của nấm men gần giống protein nguồn gốc động vật, có chứa khoảng 20 loại axitamin, trong đó có đủ các loại axitamin không thay thế với thành cân đối[50]. 2.1.2.3. Carbonhydrat Carbonhydrat chiếm 10-30% chất khô tế bào nấm men, trong đó 2-3% là ribose, còn lại phấn lớn là các polisaccarit thường gặp như glucozen, trehaloza, manan, glucan, xenluloza, hemixenluloza và D-mannoza…, manan, glucan là 2 thành phần hóa học chủ yếu của các tế bào[50]. 2.1.2.4. Lipit Lipit phụ thuộc vào thành phần môi trường thức ăn và các loài nấm men khác nhau. Có khoảng 1-3% lipit ở dạng trung tính như: các este phức tạp của glyxerin, lipit, photpholipit, steroid và các axit béo bậc cao. Lipit trong tế bào ở dạng tự do hay kết hợp, chúng đóng vai trò quan trọng vì trong nguyên sinh chất chúng liên kết với nhau tạo thành hệ sợi mixel hay kết hợp với protein tạo thành lipoprotein, cơ sở chính để xây dựng nên tế bào[5]. 2.1.2.5.  - Glucan  - Glucanlà một trong những polysacharit nhiều nhất trong thành tế bào nấm men, -glucan tồn tại như một homopolymer của glucoza, liên kết với nhau qua cầu nối -(1,3) hoặc -(1,6)-D-glycosidic, chịu trách nhiệm cho hình dạng và độ bền cơ học của thành tế bào. Thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae gồm có (1,3)-D-glucan, -(1,6)-D-glucan, chitin và mannoprotein. Cả 4 thành phần cấu trúc của thành tế bào liên kết hoá trị với nhau. Mannoprotein (khối lượng protein khoảng 100 Kda) liên kết với -(1,6)-D-glucan qua glycosyl-phosphatidyl-inositol có chứa 5 gốc mannosyl liên kết . Đầu khử của -(1,6)-D-glucan liên kết với đầu glucoza không khử của -(1,3)-glucan. Chitin gắn thẳng vào nhánh -(1,6)-glucan. Những 4 năm gần đây, -glucan phân lập từ thành tế bào nấm men ngày càng được chú ý. Các hợp chất này có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như tăng cường miễn dịch, kháng khối u và là tác nhân bảo vệ phóng xạ, kích thích hệ thống miễn dịch [18]. 2.1.2.6. Các nguyên tố khoáng và nguyên tố vi lượng Ngoài các nguyên tố hữu cơ C,H,N,O trong tế bào nấm men còn có các nguyên tố tro P,S,K,Ca, Mg,Fe, Na, Cl,Ba và các nguyên tố vi lượng B, Mo,Zn ,Cu, I. Các nguyên tố này tuy chỉ chiếm 2-14% tổng lượng chất khô trong tế bào nấm men nhưng đóng vai trò vô cùng quan trọng [10]. 2.1.2.7. Vitamin Nấm men rất giàu vitamin chủ yếu là vitamin nhóm B và vitamin nhóm D trong 1g chất khô của nấm men chứa 300µg vitamin B1, 40µg vitamin B2, 50µg vitamin B6, 600µg vitamin PP, 80µg axit pantoteic, 25µg axit foleic, 1µg biotin và 500µg inozit.Ngoài ra trong nấm men còn có vitamin E và nhiều hợp chất khác. Tất cả các chất hoạt tính sinh học này được chứa trong nấm men với 1 tỷ lệ hết sức phù hợp, chính vì thế mà tác dụng của chúng đến trạng thái sinh lý của các cơ thể sống là rất rõ nét [10]. 2.1.2.8. Enzyme Tế bào nấm men chứa một tập hợp enzyme rất phong phú, đa dạng như Enzyme dehydrogenaza, photphoglyxerat kinaza, alcohol dehydrogenaza… Enzyme trong tế bào gồm 2 loại chính: enzyme nội và ngoại bào. Enzyme nội bào làm tăng các phản ứng hóa học của các quá trình hô hấp, lên men và các phản ứng dẫn đến tạo thành nguyên sinh chất của tế bào. Enzyme ngoại bào chuẩn bị thức ăn cho môi trường xung quanh, chuyển các hợp chất không hòa tan thành các hợp chất hòa tan và dễ đồng hóa [5]. 2.2. Cấu tạo thành tế bào nấm men Thành tế bào nấm men tạo thành một biên giới xác định kích thước tế bào nấm men và bảo vệ các cơ quan của tế bào khỏi những ảnh hưởng tiêu cực của môi trường. Các thành phần cấu tạo nên thành tế bào nối với nhau bằng liên kết hóa trị hình thành một siêu phân tử polymer sinh học duy nhất. Để tìm hiểu bản chất của những liên kết này, cũng như các cấu trúc của từng polysaccharid, tất cả các yếu tố cấu tạo phải được phân cắt, hòa tan, tinh sạch và phân tích. Trong quá trình này gần như không thể không làm tổn hại đến các yếu tố cấu trúc và tiếp theo sau đó là làm 5 sao để phân biệt giữa các thành phần ban đầu của thành tế bào và các polysaccharid hòa tan có thể có mặt trong tế bào chất hoặc có thể là bị mắc kẹt (chất hấp thu) trong thành tế bào. Hơn 50 năm nghiên cứu đã thiets lập được cấu trúc của các homopolysaccharide chính, trọng lượng phân tử cao ở nấm men [53]. Các Mannoprotein chủ yếu tập trung trên bề mặt bên ngoài của thành tế bào (Osumi, 1998). Có chức năng thụ quan cho các chất dinh dưỡng, hóa học và độc tố vi khuẩn/virus, tích cực tham gia vào việc vận chuyển chất dinh dưỡng và các chất chuyển hóa qua thành tế bào, và cũng tham gia giao phối [54]. Một số enzyme thành tế bào như glucanase, mannanase, invertase, alkaline phosphatase và lipase là các mannoprotein thủy phân chất dinh dưỡng và tham gia vào các việc tái tạo các polysaccharid của tế bào trong quá trình tăng trưởng tế bào và phân chia tế bào mới. Quá trình tách glucan thành tế bào nấm men (phần không tan) khỏi các mannan nấm men đã được sử dụng trên quy mô công nghiệp (Sedmak,2006). Phần hòa tan, phân đoạn giàu mannan, có thẻ được thêm trở lại thành tế bào (chỉ chứa 10-17% mannan tính theo trọng lượng), để tăng hàm lượng của các mannan đến 30%[55]. Thành tế bào của Saccharomyces cerevisiae chiếm khoảng 25-30% tổng trọng lượng khô tế bào, trong đó chứa khoảng 30-60% lượng glucan [41]. 2.3. Các phương pháp thủy phân tế bào nấm men 2.3.1.Phương pháp hóa học - Tác nhân thủy phân Người ta thường sử dụng axit HCl để thủy phân. Axit có tác dụng thủy phân phức hệ glucan, protein và lipid gây hư hỏng mạng lưới cấu trúc của thành và màng tế bào, do đó các chất nội bào được chiết ra môi trường ngoài một cách dễ dàng. Tuy nhiên khi sử dụng axit quá nhiều có thể dẫn đến những thay đổi về bản chất hóa học hoặc tính chất vật lý của các sản phẩm có trong tế bào. Theo các tài liệu nghiên cứu cho thấy dùng HCl có nhiều ưu điểm hơn so với các axit khác hay các bazơ khác vì khi thủy phân bằng HCl sẽ cho sản phẩm có mầu sắc tươi đẹp, đạm hư ít và ít tổn thất axít amin.Nếu dùng NaOH cũng nhanh nhưng cũng khử đi một số các axit amin. - Nồng độ axit thủy phân: 6 Lượng axit ít, tác nhân xúc tác trong quá trình thủy phân sẽ yếu, thời gian thủy phân dài, thủy phân không triệt để, tốn nước và nhiệt.Lượng axit nhiều sẽ gây lãng phí hóa chất (HCl, NaOH trung hòa) lượng muối sinh ra trong dịch thủy phân nhiều, đồng thời dưới tác dụng của nhiệt độ và nồng độ axit cao, axit amin sẽ bị phân hủy mạnh [10]. - Thời gian thủy phân: Khi thời gian thủy phân ngắn, các mạch protit chưa phân giải hết làm cho hiệu suất thu hồi thấp. Nếu thời gian quá dài: đạm amin sẽ bị phân hủy, nhiều hợp chất màu nâu sẫm được hình thành, ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau này [10]. - Nhiệt độ thủy phân: Nếu nhiệt độ quá cao sẽ làm protit trong nguyên liệu phân giải mạnh dẫn đến các axit amin bị giảm mạnh tạo thành nhiều sản phẩm phụ.Nếu nhiệt độ quá thấp thì thời gian thủy phân kéo dài [10]. 2.3.2. Phương pháp sinh học Phương pháp sinh học được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sử dụng enzyme. Người ta dùng enzyme tương ứng với cơ chất có trong thành tế bào, thủy phân cơ chất và như vậy thành tế bào sẽ bị phá vỡ kết quả thu được tế bào nấm men. Enzyme chủ yếu tham gia vào quá trình thủy phân protein nấm men là proteaza. Đây là nhóm enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử protein. Proteaza được chia thành proteinaza (endoproteaza) và peptitdaza (exoproteaza)[38]. Proteinaza: chủ yếu phân hủy các liên kết peptit nằm trong phân tử protein. Chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng. Dưới tác dụng của chúng, protein bị phân cắt thành những đoạn peptit có trọng lượng phân tử nhỏ (pepton, polipeptit). Peptidaza: phân hủy chủ yếu là các liên kết peptit ở cuối mạch polypeptit, tách các gốc axit amin thành các axit amin tự do. Các peptidaza có tính đặc hiệu hẹp hơn. Chúng chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở vị trí nhất định. Ví dụ như aminopeptidaza chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở đầu mạch polypeptit có nhóm amin tự do, còn cacboxypeptidaza chỉ tác dụng lên liên kết peptit ở cuối mạch có nhóm cacboxyl tự do [5,10] . 7 Như vậy, quá trình thủy phân protein xảy ra dưới tác dụng của proteaza theo một trật tự nhất định. Lúc đầu, endoproteaza phân hủy protein thành các thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn là polypeptit, pepton, albumin. Tiếp đó, các sản phẩm này lại trực tiếp chịu tác dụng của exoproteaza để tạo thành các axit amin tự do. Sản phẩm do endoproteaza lại là cơ chất cho exoproteaza [10]. 2.3.3. Phương pháp tự phân Tự phân là quá trình tự xảy ra khi tế bào nấm men chết và vách tế bào không có khả năng tự vệ sẽ bị phá hủy bởi các enzyme trong tế bào. Lúc này chất trong tế bào như: protein, nucleotic, cacbohydrate…cũng bị hệ thống enzyme này tấn công và phân hủy. Quá trình tự phân bắt đầu khi tế bào nấm men chết lúc đó màng tế bào và các bào quan khác không hoạt động lúc này enzyme nội sinh bắt đầu hoạt động, các enzyme có nhiệm vụ phân giải protein thành các đơn vị nhỏ hơn như peptide và các axit amin. Tương tự như vậy, enzyme nuclease phân hủy RNA và DNA tạo thành hợp chất như nucleoside, mononucleotides, và polynucleotides. Các enzyme glucanase và proteinase phân hủy các thành phần vách tế bào như glucan và mannoprotein, khiến các tế bào trở nên xốp. Các thành phần chính hình thành trong quá trình tự phân bao gồm các hợp chất đạm, polysaccharide, các thành phần nucleic axit, axit béo, các loại vitamin khác nhau. Quá trình tự phân của nấm men chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau như: nồng độ nấm men trong dung dịch, các yếu tố thúc đẩy quá trình tự phân như ethyl acetate, chitosan.., nhưng yếu tố quan trọng nhất vẫn là nhiệt độ, pH, thời gian, đối với từng loại nấm men khác nhau thì yếu tố chi phối cũng khác nhau[32]. Nồng độ nấm men trong dung dịch: ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tự phân. Nồng độ nấm men càng thấp thì hiệu quả tự phân càng cao, tuy nhiên nếu dung dịch tự phân quá loãng vì vậy dung dịch tự phân sẽ được pha loãng ở nồng độ từ 1015% sinh khối nấm men[50]. Nhiệt độ: Nấm men bia tự phân ở nhiệt độ 450C[50], trong khi đó nấm men bánh mì đạt hiệu quả cao nhất ở nhiệt độ 510C. 8