Tài liệu Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ acetobacter xylinum

Lôøi caûm ôn LÔØI CAÛM ÔN Em chaân thaønh caûm ôn thaày Nguyeãn Vuõ Tuaân, thaày ñaõ höôùng daãn em suoát quaù trình thöïc hieän ñeà taøi naøy. Trong quaù trình laøm vieäc cuøng vôùi thaày, em ñaõ hoïc hoûi ñöôïc nhieàu ñieàu boå ích, khoâng chæ laø nhöõng kieán thöùc chuyeân moân maø coøn caû nhöõng kinh nghieäm khi laøm vieäc. Khi em gaëp khoù khaên trong quaù trình thöïc hieän ñeà taøi, thaày ñaõ kòp thôøi höôùng daãn, chæ baûo taän tình. Em göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán coâ Löu Thò Ngoïc Anh, nhöõng lôøi truyeàn ñaït cuûa coâ thaät söï boå ích cho em trong quaù trình em laøm luaän vaên taïi tröôøng. Em göûi lôøi caûm ôn ñeán coâ Toân Nöõ Minh Nguyeät, coâ ñaõ giuùp ñôõ chuùng em veà maët hoùa chaát phuïc vuï cho vieäc thöïc hieän ñeà taøi. Em caûm ôn coâ Thuøy Döông - boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc cuûa tröôøng Ñaïi hoïc Baùch khoa thaønh phoá Hoà Chí Minh ñaõ giuùp ñôõ em veà nguoàn vi sinh vaät söû duïng trong ñeà taøi. Em xin göûi lôøi caûm ôn ñeán caùc thaày coâ giaùo trong boä moân Coâng ngheä Thöïc phaåm, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch khoa thaønh phoá Hoà Chí Minh ñaõ taïo ñieàu kieän toát nhaát veà moïi maët giuùp chuùng em thöïc hieän ñeà taøi luaän vaên toát nghieäp. Toâi cuõng muoán baøy toû söï caûm ôn ñeán taát caû caùc baïn beø của tôi, họ ñaõ giuùp ñôõ, ñaëc bieät laø cho toâi thaáy ñöôïc söï gaén boù, söï chia seû, söï caûm thoâng cuõng nhö laø nhöõng giaây phuùt thö giaõn trong khi laøm vieäc. Toâi xin caûm ôn vôùi taát caû loøng chaân thaønh. Phan Anh Tuaán i Toùm taét luaän vaên TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN Acetobacter xylinum (A. xylinum) laø moät vi khuaån Gram aâm, coù theå saûn xuaát moät loaïi polysaccharide ngoaïi baøo ñöôïc goïi laø cellulose vi khuaån. Cellulose vi khuaån coù khaû naêng ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong coâng ngheä thöïc phaåm vaø caùc lónh vöïc khaùc. Ñeå öùng duïng cellulose vi khuaån moät caùch roäng raõi, ñoøi hoûi coù nguoàn nguyeân lieäu cellulose vi khuaån doài daøo vaø oån ñònh. Gaàn ñaây, öùng duïng cellulose vi khuaån laøm maøng bao thöïc phaåm ñaõ ñöôïc phaùt hieän vaø öùng duïng thöïc teá. Vôùi muïc ñích saûn xuaát cellulose vi khuaån phuïc vuï muïc ñích maøng bao thöïc phaåm, vôùi ñeà taøi “Nghieân cöùu saûn xuaát cellulose vi khuaån töø Acetobacter xylinum” döôùi ñieàu kieän tónh, chuùng toâi thöïc hieän khaûo saùt caùc yeáu toá sau: - Khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp cellulose töø A. xylinum treân moâi tröôøng Hestrin-Schramm (HS). - Caûi thieän hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose töø A. xylinum. Ñeå khaûo saùt söï sinh toång hôïp cellulose, A. xylinum ñöôïc nuoâi caáy döôùi ñieàu kieän tónh treân moâi tröôøng HS ôû caùc ñieàu kieän khaùc nhau nhaèm ruùt ra ñieàu kieän nuoâi caáy toát nhaát cho chuûng A. xylinum coù saün. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH ñoái vôùi quaù trình taïo cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum ñöôïc tieán haønh vaø thaáy raèng, trong khoaûng pH töø 4,0 ñeán pH 5,5, hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa chuûng A. xylinum naøy laø thích hôïp nhaát, löôïng cellulose ñaït ñöôïc coù theå ~5,2 gl-1. Beân caïnh ñoù, tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon baèng caùch thay ñoåi nguoàn carbon trong thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy, choïn ñöôïc nguoàn carbon thích hôïp nhaát cho chuûng A. xylinum sinh toång hôïp cellulose laø mannitol. Löôïng cellulose ñaït ñöôïc ~7,4 gl -1. Ñeå choïn ra nguoàn nitô toát nhaát cho söï toång hôïp cellulose, moät thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän vôùi nguoàn carbon laø mannitol, nguoàn nitô ñöôïc thay ñoåi, keát quaû cho thaáy cao naám men cho keát quaû taïo cellulose toát nhaát. Löôïng cellulose ñaït ñöôïc ~8 gl-1 g. Khi khaûo saùt aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa mannitol vaø cao naám men leân quaù trình toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum, haøm löôïng cellulose thu ñöôïc coù theå ñaït ñöôïc ~8,5 gl -1 khi thaønh phaàn moâi tröôøng HS ñöôïc ñieàu chænh vôùi haøm löôïng mannitol 15,5 gl -1 vaø haøm löôïng cao naám men laø 6,5 gl-1, pH moâi tröôøng ñöôïc chænh xung quanh giaù trò 5,0. ii Toùm taét luaän vaên Vôùi keát quaû thu ñöôïc trong caùc thí nghieäm, moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån A. xylinum coù taïi Phoøng Thí nghieäm Sinh hoïc tröôøng Ñaïi hoïc Baùch khoa thaønh phoá Hoà Chí Minh vôùi muïc ñích thu nhaän cellulose neân bao goàm caùc thaønh phaàn sau: 15,5 gl -1 mannitol; 6,5 gl-1 cao naám men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pH ñöôïc ñieàu chænh veà 5,0 laø thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy. Caùc keát quaû quaû thí nghieäm naøy cung caáp nhöõng thoâng tin höõu ích cho söï phaùt trieån khaû naêng saûn xuaát cellulose vi khuaån treân quy moâ coâng nghieäp. iii Muïc luïc MUÏC LUÏC LÔØI CAÛM ÔN.............................................................................................................................i TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN...........................................................................................................ii MUÏC LUÏC ............................................................................................................................iv DANH MUÏC HÌNH.................................................................................................................vi DANH MUÏC BAÛNG...............................................................................................................vii DANH MUÏC VIEÁT TAÉT......................................................................................................viii CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU............................................................................................................1 CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU...............................................................................3 2.1 CELLULOSE VI KHUAÅN VAØ VI SINH VAÄT TOÅNG HÔÏP CELLULOSE........................3 2.1.1 Lòch söû nghieân cöùu söï sinh toång hôïp cellulose vi khuaån.............................3 2.1.2 Cellulose vi khuaån vaø tính chaát cuûa cellulose vi khuaån..............................3 2.1.3 Vi sinh vaät toång hôïp cellulose.......................................................................6 2.2 SINH TOÅNG HÔÏP CELLULOSE TÖØ VI KHUAÅN A. XYLINUM...................................10 2.2.1 Quaù trình sinh toång hôïp cellulose ôû A. xylinum..........................................10 2.2.2 Cô cheá sinh toång hôïp cellulose vi khuaån....................................................11 2.2.3 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình toång hôïp cellulose...........................13 2.3 ÖÙNG DUÏNG CUÛA CELLULOSE VI KHUAÅN............................................................24 2.3.1 Thöïc phaåm....................................................................................................24 2.3.2 Y hoïc.............................................................................................................25 2.3.3 Caùc ngaønh coâng nghieäp khaùc......................................................................25 CHÖÔNG 3: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP......................................................28 3.1 NGUYEÂN LIEÄU.....................................................................................................28 3.1.1 Chuûng vi sinh vaät.........................................................................................28 3.1.2 Moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät..................................................................28 3.2 THIEÁT KEÁ THÍ NGHIEÄM......................................................................................29 3.2.1 Khaûo saùt quaù trình nhaân gioáng....................................................................29 3.2.2 Khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp cellulose................................................30 3.2.3 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum.....................................................................................................30 iv Muïc luïc 3.2.4 Khaûo saùt aûnh höôûng ñoäc laäp cuûa nguoàn carbon vaø nitô leân hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum........................................................31 3.2.5 Khaûo saùt aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa nguoàn carbon vaø nitô leân hieäu suaát toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum...............................................31 3.3 CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH.........................................................................33 3.3.1 Soá löôïng vi khuaån........................................................................................33 3.3.2 Hieäu suaát cellulose......................................................................................33 3.3.3 Phaân tích thoáng keâ.......................................................................................34 CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN........................................................................35 4.1 KHAÛO SAÙT QUAÙ TRÌNH NHAÂN GIOÁNG VI KHUAÅN A. XYLINUM...........................35 4.2 KHAÛO SAÙT QUAÙ TRÌNH SINH TOÅNG HÔÏP CELLULOSE........................................36 4.3 KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA PH LEÂN HIEÄU SUAÁT SINH TOÅNG HÔÏP CELLULOSE CUÛA VI KHUAÅN 4.4 A. XYLINUM................................................................................38 KHAÛO SAÙT AÛNH HÖÔÛNG CUÛA NGUOÀN CARBON VAØ NITÔ LEÂN HIEÄU SUAÁT SINH TOÅNG HÔÏP CELLULOSE CUÛA VI KHUAÅN A. XYLINUM.........................................40 4.4.1 AÛnh höôûng cuûa nguoàn carbon.....................................................................40 4.4.2 AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô..........................................................................43 4.5 TOÁI ÖU HOAÙ NOÀNG ÑOÄ NGUOÀN CARBON VAØ NITÔ...............................................45 CHÖÔNG 5: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ.........................................................................49 5.1 KEÁT LUAÄN...........................................................................................................49 5.2 ÑEÀ NGHÒ..............................................................................................................49 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO......................................................................................................51 PHUÏ LUÏC ...........................................................................................................................55 v Danh muïc hình DANH MUÏC HÌNH Hình 2.1: Caáu truùc cuûa cellulose vi khuaån................................................................................4 Hình 2.2: Cellulose vi khuaån (a) vaø cellulose thöïc vaät (b)......................................................6 Hình 2.3: SEM cuûa A. xylinum................................................................................................ 8 Hình 2.4: Con ñöôøng toång hôïp cellulose trong A. xylinum...................................................11 Hình 2.5: Cô cheá sinh toång hôïp cellulose vi khuaån..............................................................12 Hình 2.6: Söï giaûi phoùng cellulose ra moâi tröôøng ngoaøi töø A. xylinum...................................13 Hình 2.7: Cellulose ñược tạo thaønh trong ñieàu kieän nuoâi caáy tónh vaø coù khuaáy ñaûo..........15 Hình 2.8: Caáu truùc trong ñieàu kieän nuoâi caáy tónh vaø nuoâi caáy coù khuaáy ñaûo ......................16 Hình 4.1: Ñöôøng cong sinh tröôûng của A. xylinum.................................................................35 Hình 4.2: Ñoà thò bieåu dieãn troïng löôïng cellulose thu ñöôïc vaø giaù trò pH taïi caùc ngaøy leân men thöù 4, 5, 6, 7 ....................................................................................................36 Hình 4.3: AÛnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum ..........39 Hình 4.4: Troïng löôïng cellulose thu ñöôïc khi nguoàn carbon thay ñoåi..................................42 Hình 4.5: Troïng löôïng cellulose thu ñöôïc khi nguoàn nitô thay ñoåi.......................................44 vi Danh muïc baûng DANH MUÏC BAÛNG Baûng 2.1 Caùc vi sinh vaät coù khaû naêng toång hôïp cellulose.......................................................7 Bảng 2.2: Đặc tính cấu truùc St-BC vaø Ag-BC ......................................................................16 Bảng 2.3: Tính chất St-BC vaø Ag-BC cuûa A. xylinum IFO 13693 ......................................17 Baûng 2.4: Aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon leân söï toång hôïp cellulose cuûa...............................23 Baûng 2.5: Caùc öùng duïng trong nhieàu lónh vöïc cuûa cellulose vi khuaån.................................26 Baûng 3.1: Baûng thieát keá thí nghieäm toái öu nguoàn carbon vaø nguoàn nitô..............................33 Baûng 3.2: Baûng maõ hoaù caùc yeáu toá aûnh höôûng caàn khaûo saùt................................................34 Baûng 4.1: Baûng keát quaû thí nghieäm toái öu .............................................................................47 Baûng 4.2: Baûng maõ hoaù caùc yeáu toá aûnh höôûng caàn khaûo saùt................................................47 vii Danh muïc vieát taét DANH MUÏC VIEÁT TAÉT - Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuaån thu nhaän ñöôïc döôùi ñieàu kieän nuoâi caáy coù khuaáy ñaûo) - A. xylinum: Acetobacter xylinum - A. xylinus: Acetobacter xylinus - ATP: adenosine triphosohate - BASYC®: bacterial synthesised cellulose - Cel-: non-producing mutants – chuûng vi khuaån ñoät bieán khoâng toång hôïp cellulose. - cfu: cololy-forming units – khuaån laïc - CS: cellulose synthase - CSL: corn steep liquor - DAP: diamon phosphate - DP: degree of polymerization - FK: Fructosekinase - FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase - Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate - Fru-6-P: Fructose-6-phosphate - GK: Glocosekinase - G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase - Glc-6-P: Glucose-6-phosphate - Glc-1-P: Glucose-1-phosphate - HS: Hestrin-Schramm viii Danh muïc vieát taét - HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance. - PGI: Phosphoglucoisomerase - PGM: Phosphoglucomutase - PTS: Phosphatransferase - PGA: Phosphogluconic acid - S/V: surface/volume ratio - tæ leä dieän tích/theå tích - SEM: Scanning electronic microscopy - St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuaån thu nhaän ñöôïc döôùi ñieàu kieän nuoâi caáy tónh) - SA: Sulfate amon - UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase - UDPG: Uridine diphosephoglucose - YPM: Yeast extract Peptone Mannitol - YE: Yeast extract – cao naám men ix Chöông 1. Môû ñaàu Chöông 1: MÔÛ ÑAÀU Cellulose laø moät hôïp chaát hoùa hoïc thöôøng ñöôïc bieát ñeán vôùi vai troø laø boä khung xöông quan troïng trong cô theå thöïc vaät. Khoâng nhöõng cellulose ñöôïc toång hôïp bôûi thöïc vaät, maø cellulose coøn ñöôïc toång hôïp neân bôûi vi sinh vaät, vôùi teân goïi laø cellulose vi khuaån. Moät trong nhöõng loaøi vi sinh vaät coù khaû naêng toång hôïp cellulose raát toát ñoù laø A. xylinum. Cellulose vi khuaån ngaøy caøng ñöôïc quan taâm nhieàu hôn bôûi khaû naêng öùng duïng roäng raõi trong nhieàu ngaønh khoa hoïc: coâng nghieäp thöïc phaåm, y hoïc, myõ phaåm, khoa hoïc vaät lieäu, aâm thanh, xöû lyù nöôùc thaûi, baûo veä moâi tröôøng… Gaàn ñaây, khaû naêng öùng duïng cellulose vi khuaån khoâng ngöøng ñöôïc nghieân cöùu, caûi tieán bôûi caùc nhaø khoa hoïc treân theá giôùi (Otomo et al., 2000). Trong coâng ngheä ñoà uoáng vaø thöïc phaåm, cellulose vi khuaån ñaõ ñöôïc öùng duïng laøm nhieàu saûn phaåm nhö: nöôùc traùi caây, thöïc phaåm chöùc naêng… Ñaëc bieät, moät öùng duïng cuûa cellulose vi khuaån môùi ñöôïc phaùt hieän gaàn ñaây laø khaû naêng öùng duïng laøm maøng bao thöïc phaåm choáng vi sinh vaät raát hieäu quaû (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993). Vieäc öùng duïng cellulose vi khuaån vaøo saûn xuaát coâng nghieäp noùi chung vaø laøm maøng bao thöïc phaåm noùi rieâng ñoøi hoûi phaûi coù ñöôïc caùc nguoàn nguyeân lieäu cellulose vi khuaån doài daøo, oån ñònh, vaø phuø hôïp vôùi tính chaát cuûa caùc öùng duïng. Nhieàu keát quaû nghieân cöùu ñaõ cho thaáy khi nuoâi caáy döôùi ñieàu kieän coù khuaáy ñaûo thì hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum seõ cao hôn khi nuoâi caáy tónh. Tuy nhieân, vôùi muïc ñích söû duïng cellulose vi khuaån laøm maøng bao choáng vi sinh vaät trong coâng ngheä thöïc phaåm, yeâu caàu cellulose thu ñöôïc phaûi ôû daïng maøng. Vôùi muïc ñích ñoù, chuùng toâi thöïc hieän ñeà taøi “Nghieân cöùu saûn xuaát cellulose vi khuaån töø Acetobacter xylinum” döôùi ñieàu kieän nuoâi caáy tónh vôùi mong muoán thu ñöôïc caùc keát quaû höõu ích cho caùc nghieân cöùu trong töông lai. Trong noäi dung thöïc hieän, chuùng toâi taäp trung khaûo saùt caùc yeáu toá sau: - Khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum treân moâi tröôøng HS. 1 Chöông 1. Môû ñaàu - Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum treân moâi tröôøng HS. - Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. - Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nguoàn nitô leân hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. - Toái öu hoaù thaønh phaàn moâi tröôøng leân men thu nhaän cellulose vi khuaån nhaèm naâng cao hieäu suaát sinh toång hôïp cellulose töø A. xylinum. Vôùi keát quaû thu ñöôïc, phaàn naøo seõ cung caáp nhöõng thoâng tin höõu ích cho caùc nghieân cöùu tieáp theo, ñaày ñuû hôn ñeå coù theå öùng duïng saûn xuaát cellulose vi khuaån treân quy moâ coâng nghieäp. 2 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu Chöông 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 2.1 Cellulose vi khuaån vaø vi sinh vaät toång hôïp cellulose 2.1.1 Lòch söû nghieân cöùu söï sinh toång hôïp cellulose vi khuaån. Söï toång hôïp lôùp maøng cellulose ngoaïi baøo cuûa vi khuaån A. xylinum laàn ñaàu tieân ñöôïc baùo caùo bôûi Brown et al. (1986). Theo ñoù, khi nghieân cöùu veà vi khuaån acetic, Brown ñaõ phaùt hieän vaø quan saùt thaáy moät khoái raén maø theo oâng luùc ñoù khoái raén naøy khoâng naèm trong caùc keát quaû nghieân cöùu oâng döï ñònh tröôùc. Khoái raén naøy khoù bò phaân huûy vaø gioáng vôùi moâ ñoäng vaät. Hôïp chaát ñoù sau naøy ñöôïc xaùc ñònh laø cellulose vaø vi khuaån toång hôïp ra noù laø Bacterium xylinum (Brown et al., 1986). Ñeán nöûa theá kyû XX caùc nhaø khoa hoïc môùi thöïc söï nghieân cöùu nhieàu veà cellulose vi khuaån. Ñaàu tieân, Hestrin et al. (1954) ñaõ nghieân cöùu veà khaû naêng toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum. OÂng ñaõ chöùng minh raèng vi khuaån naøy coù theå söû duïng ñöôøng ñeå toång hôïp cellulose. Sau ñoù, Next vaø Colvin (1957) chöùng minh raèng cellulose ñöôïc A. xylinum toång hôïp trong moâi tröôøng coù ñöôøng vaø ATP. Cuøng vôùi söï tieán boä cuûa khoa hoïc kyõ thuaät, caáu truùc cuûa cellulose vi khuaån ngaøy caøng ñöôïc hieåu khaù roõ, ñoù laø caùc chuoãi polymer do caùc glucopyranose noái vôùi nhau baèng lieân keát β-1,4-glucan. Saxena (1990) ñaõ giaûi thích cô cheá toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum baèng vieäc giaûi trình töï ñoaïn gen toång hôïp cellulose. OÂng ñaõ taùch chieát ñöôïc ñoaïn polypeptide lieân quan ñeán quaù trình toång hôïp cellulose tinh khieát daøi 83kDa. Töø ñoù ñeán nay ñaõ coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu giuùp hieåu roõ theâm caáu truùc, cô cheá toång hôïp, öùng duïng… cuûa cellulose vi khuaån. 3 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu 2.1.2 Cellulose vi khuaån vaø tính chaát cuûa cellulose vi khuaån 2.1.2.1 Cellulose vi khuaån Cellulose vi khuaån laø moät chuoãi polymer do caùc glucopyranose noái vôùi nhau baèng lieân keát β-1,4-glucan. Nhöõng chuoãi glucan ñöôïc vi khuaån toång hôïp noái laïi vôùi nhau thaønh thôù sôïi thöù caáp, coù beà roäng 1,5 nm. Ñaây laø nhöõng thôù sôïi töï nhieân maûnh nhaát khi so saùnh vôùi sôïi cellulose sô caáp trong töôïng taàng ôû moät vaøi loaøi thöïc vaät. Caùc thôù sôïi thöù caáp keát laïi thaønh nhöõng vi sôïi, nhöõng vi sôïi taïo thaønh boù sôïi, nhöõng boù sôïi taïo thaønh daûi. Daûi coù chieàu daøy 3 – 4 nm, vaø chieàu daøi 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000). Caùc daûi sieâu mòn cuûa cellulose vi khuaån coù chieàu daøi töø 1 µm ñeán 9 µm taïo thaønh caáu truùc maét löôùi daøy ñaëc, ñöôïc oån ñònh nhôø caùc lieân keát hydro, ñoù laø lôùp maøng film (Bielecki et al., 2001) Hình 2.1: Caáu truùc cuûa cellulose vi khuaån (Yamanaka et al., 2000) 2.1.2.2 Möùc ñoä polymer hoaù (Degree of polymerization - DP) Cellulose vi khuaån vaø cellulose thöïc vaät töông töï nhau veà maët hoùa hoïc, cellulose bao goàm caùc lieân keát β-1,4-glucan, nhöng möùc ñoä polymer hoaù khaùc nhau. DP cuûa cellulose thöïc vaät khoaûng 13000 – 14000, vaø cuûa cellulose vi khuaån khoaûng 2000 – 6000. 4 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu Tuy nhieân, trong moät soá tröôøng hôïp DP cuûa cellulose vi khuaån coù theå ñaït 16000 ñeán 20000 phaân töû glucose (Watanabe et al., 1998). Ñöôøng kính cuûa bacterial cellulose chæ vaøo khoaûng 1/100 ñöôøng kính cuûa cellulose thöïc vaät (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2). 2.1.2.3 Caáu truùc keát tinh cuûa cellulose vi khuaån. Ngaøy nay nhôø vaøo caùc kyõ thuaät coâng ngheä hieän ñaïi ngöôøi ta ñaõ xaùc ñònh ñöôïc caáu truùc cuûa cellulose vi khuaån. Chaúng haïn nhö kyõ thuaät nhieãu xaï tia X giuùp xaùc ñònh ñöôïc kích thöôùc vaø phaân bieät caáu truùc cellulose vi khuaån. Nhöõng kyõ thuaät khaùc nhö phoå hoàng ngoaïi, phoå Raman, vaø phoå coäng höôûng töø haït nhaân giuùp xaùc ñònh caùc daïng keát tinh cuûa cellulose (Bielecki et al., 2001). Nhö caùc cellulose töï nhieân khaùc, cellulose vi khuaån ñöôïc taïo thaønh bôûi hai loaïi caáu truùc tinh theå rieâng bieät, cellulose I α vaø Iβ. Trong vi sôïi cellulose ñeàu coù söï tham gia cuûa hai loaïi caáu truùc tinh theå naøy (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi haàu heát tinh theå Iβ tinh khieát thu ñöôïc töø cellulose thöïc vaät thì vaãn chöa coù caùch naøo thu nhaän ñöôïc caùc tinh theå Iα tinh khieát töø nguoàn naøy. Caáu truùc cuûa cellulose ñöôïc toång hôïp töø vi khuaån A. xylinum chöùa nhieàu tinh theå Iα hôn cellulose thöïc vaät, haøm löôïng loaïi tinh theå naøy coù theå leân ñeán hôn 60%. Tæ leä naøy coù theå dao ñoäng trong khoaûng 64% ñeán 71% tuyø vaøo chuûng vi sinh vaät vaø nhieät ñoä moâi tröôøng (Yamamoto & Horii, 1994). Ngöôïc laïi Iβ chuû yeáu coù trong thaønh phaàn cellulose hình thaønh neân thaønh teá baøo cuûa moät soá loaøi thöïc vaät baäc cao nhö cotton vaø gai. ÔÛ ñoù, cellulose Iα chæ chieám khoaûng 20%. Nhìn chung, caáu truùc tinh theå ñöôïc coi nhö laø moät yeáu toá quan troïng trong vieäc xaùc ñònh caùc tính chaát cuûa cellulose maëc duø cho ñeán baây giôø vaãn coù raát ít caùc nghieân cöùu veà söï töông quan giöõa caáu truùc tinh theå vaø nhöõng ñaëc tính rieâng bieät cuûa cellulose ñöôïc thöïc hieän. 2.1.2.4 Tính chaát cuûa cellulose vi khuaån (El-Saied et al., 2004; Bielecki et al., 2001) - Cellulose vi khuaån laø cellulose raát trong suoát, caáu truùc maïng tinh theå mòn, thaønh phaàn tæ leä Iα cao. 5 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu - Kích thöôùc oån ñònh, söùc caêng vaø ñoä beàn sinh hoïc cao, ñaëc bieät laø cellulose I. - Khaû naêng giöõ nöôùc vaø haáp thuï nöôùc cöïc toát, tính xoáp choïn loïc. - Coù ñoä tinh saïch cao so vôùi caùc loaïi cellulose khaùc, khoâng chöùa ligin vaø hemicellulose. - Coù theå bò phaân huûy hoaøn toaøn bôûi moät soá vi sinh vaät, laø nguoàn taøi nguyeân coù theå phuïc hoài. - Khaû naêng keát sôïi, taïo tinh theå toát. - Tính beàn cô toát, khaû naêng chòu nhieät toát: tinh theå cellulose vi khuaån coù ñoä beàn cao, öùng suaát daøi lôùn, troïng löôïng nheï, tính beàn raát cao. - Lôùp maøng cellulose ñöôïc toång hôïp moät caùch tröïc tieáp, vì vaäy vieäc saûn xuaát moät soá saûn phaåm töø cellulose vi khuaån khoâng caàn qua böôùc trung gian. Ñaëc bieät vi khuaån coù theå toång hôïp ñöôïc cellulose döôùi daïng maøng moûng hoaëc döôùi daïng caùc sôïi chæ cöïc nhoû. - Coù theå kieåm soaùt ñöôïc ñaëc ñieåm lyù hoïc cuûa cellulose theo mong muoán baèng caùch taùc ñoäng vaøo quaù trình sinh toång hôïp cellulose cuûa A. xylinum. Töø ñoù coù theå kieåm soaùt caùc daïng keát tinh vaø troïng löôïng phaân töû cellulose. Hình 2.2: Cellulose vi khuaån (a) vaø cellulose thöïc vaät (b) (Bielecki et al., 2001) 6 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu 2.1.3 Vi sinh vaät toång hôïp cellulose. Cellulose vi khuaån ñöôïc nhieàu loaøi vi sinh vaät toång hôïp trong ñoù chuûng A. xylinum ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát, ñaây cuõng laø loaøi vi khuaån sinh toång hôïp cellulose hieäu quaû nhaát vaø ñöôïc taäp trung nghieân cöùu nhieàu nhaát. Caáu truùc cuûa cellulose ñöôïc toång hôïp bởi caùc vi sinh vaät khaùc nhau laø khaùc nhau. Sau ñaây laø baûng toång quan veà caùc loaøi vi sinh vaät coù khaû naêng toång hôïp cellulose. Baûng 2.1 Caùc vi sinh vaät coù khaû naêng toång hôïp cellulose (Jonas et al., 1998) Vi sinh vaät Acetobacter Caáu truùc cellulose Lôùp maøng ngoaïi baøo Vai troø sinh hoïc Ñeå giöõ vi khuaån trong moâi tröôøng Daûi cellulose hieáu khí Achromobacter Sôïi cellulose Söï keát boâng trong nöôùc thaûi Aerobacter Sôïi cellulose Söï keát boâng trong nöôùc thaûi Sôïi ngaén Agrobacterium Sôïi cellulose Söï keát boâng trong nöôùc thaûi Caùc sôïi khoâng taùch bieät Söï keát boâng trong nöôùc thaûi Alcaligenes Pseudomonas Sôïi ngaén Rhizobium Cellulose dò hình Sarcina Zoogloea Tham gia vaøo moâ thöïc vaät Chöa xaùc ñònh roõ caáu truùc Tham gia vaøo haàu heát thöïc vaät Khoâng roõ Söï keát boâng trong nöôùc thaûi Trong ñoù, Acetobacter ñöôïc söû duïng roäng raõi vaø phoå bieán nhaát trong vieäc saûn xuaát cellulose. Ñaëc bieät laø A. xylinum vì nhöõng ñaëc ñieåm öu vieät cuûa noù nhö: naêng suaát taïo cellulose cao, caáu truùc cellulose phuø hôïp cho caùc muïc ñích söû duïng… 2.1.3.1 Phaân loaïi A. xylinum A. xylinum laø moät vi khuaån acetic thuoäc hoï Acetobacteraceae, hoï naøy bao goàm caùc gioáng sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter vaø Kozakia. Caùc loaøi vi khuaån naøy tröôùc ñaây ñöôïc goïi vôùi caùc teân goïi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau ñoù ñöôïc xeáp laïi vaøo gioáng Gluconacetobacter vôùi teân goïi Gluconacetobacter xylynus. 7 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu A. xylinum coù theå ñöôïc phaân laäp töø caùc nguoàn khaùc nhau nhö töø nöôùc quaû (Kahlon & Vyas, 1971), hay töø moät soá loaøi thöïc vaät nhö laù cuûa caây coï (Faparusi et al., 1974), töø giaám (Passmore & Carr, 1975), töø thaïch döøa (Bernado et al., 1998), töø naám Kombucha vaø traø (Hermann et al., 1928). 2.1.3.2 Ñaëc ñieåm hình thaùi cuûa A. xylinum.  A. xylinum coù daïng hình que, thaúng hay hôi cong, coù theå di ñoäng hay khoâng di ñoäng, khoâng sinh baøo töû. Laø vi khuaån Gram aâm, chuùng coù theå ñöùng rieâng reõ hay xeáp thaønh chuoãi.  Neáu A. xylinum phaùt trieån treân moâi tröôøng thieáu chaát dinh döôõng, chuùng bieán ñoåi thaønh daïng coù hình thaùi ñaëc bieät nhö: daïng teá baøo phình to, keùo daøi, phaân nhaùnh hoaëc khoâng phaân nhaùnh vaø daàn daàn seõ gaây thoaùi hoùa gioáng laøm giaûm hoaït tính moät caùch ñaùng keå.  Khuaån laïc cuûa A. xylinum coù kích thöôùc nhoû, beà maët nhaày vaø trôn, phaàn giöõa khuaån laïc loài leân, daøy hôn vaø saãm maøu hôn caùc phaàn xung quanh, rìa meùp khuaån laïc nhaün. Hình 2.3: SEM cuûa A. xylinum (Forge & Preston, 1977) 8 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu 2.1.3.3 Ñaëc ñieåm sinh lyù cuûa A. xylinum (Jonas et al., 1998)  Oxy hoùa ethanol thaønh acid acetic, CO2, H2O.  Phaûn öùng catalase döông tính: taïo boït khí trong dung dòch leân men.  Khoâng taêng tröôûng treân moâi tröôøng Hoyer.  Chuyeån hoùa glucose thaønh acid gluconic.  Chuyeån hoùa glycerol thaønh dihydroxyaceton.  Khoâng sinh saéc toá naâu.  Toång hôïp cellulose. Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa A. xylinum Lôùp maøng cellulose taïo ra gaây trôû ngaïi ñeán khaû naêng bieán döôõng, vaän chuyeån chaát dinh döôõng vaø oxi ñeán teá baøo. Tuy nhieân lôùp maøng naøy coù theå giöõ nöôùc neân giuùp vi khuaån coù theå phaân huûy chaát dinh döôõng ñeå söû duïng vaø giuùp teá baøo choáng laïi tia UV. A. xylinum coù theå söû duïng nhieàu nguoàn cacbon khaùc nhau vaø tuøy thuoäc vaøo chuûng vi khuaån maø nguoàn ñöôøng naøo ñöôïc söû duïng toát nhaát. Chaúng haïn chuûng A. xylinum BPR 2001 söû duïng fructose toát nhaát (Matsuoka et al., 1993) trong khi chuûng A. xylinum IFO 13693 söû duïng glucose hieäu quaû hôn (Masaoka et al., 1993)… A. xylinum coù theå chuyeån hoùa glucose thaønh acid gluconic, ñieàu naøy laø nguyeân nhaân laøm cho pH cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy giaûm töø 1 ñeán 2 ñôn vò trong quaù trình nuoâi caáy. Nhieät ñoä toái öu ñeå A. xylinum phaùt trieån töø 250C ñeán 300C vaø pH töø 5,4 ñeán 6,3. Theo Hestrin (1947) thì pH toái öu ñeå A. xylinum phaùt trieån laø 5,5 vaø khoâng phaùt trieån ôû nhieät ñoä 370C ngay caû trong moâi tröôøng dinh döôõng toái öu. Theo Maccormide et al. (1996) cho raèng A. xylinum coù theå phaùt trieån trong phaïm vi pH töø 3 ñeán 8, nhieät ñoä töø 12 0C ñeán 350C vaø coù theå phaùt trieån trong moâi tröôøng coù noàng ñoä ethanol leân tôùi 10%. Khi nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch, luùc coøn non khuaån laïc moïc rieâng leû, khuaån laïc nhaày vaø trong suoát, xuaát hieän sau 3 ñeán 5 ngaøy. Khi giaø teá baøo moïc dính thaønh cuïm, vaø chuùng moïc theo ñöôøng caáy gioáng. 9 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu A. xylinum coù khaû naêng chòu ñöôïc pH thaáp, vì theá ngöôøi ta thöôøng boå sung theâm acid acetic hay acid citric vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy ñeå haïn cheá söï nhieãm khuaån laï vaø taêng hieäu suaát toång hôïp cellulose. 2.1.3.4 Vai troø cuûa cellulose vi khuaån ñoái vôùi A. xylinum. Maøng cellulose ñöôïc saûn xuaát bôûi A. xylinum ñoùng nhieàu vai troø cho söï phaùt trieån vaø toàn taïi cuûa vi sinh vaät trong töï nhieân.  Cung caáp chaát dinh döôõng cho vi khuaån trong ñieàu kieän thieáu thöùc aên (Bielecki et al., 2001).  Söï toång hôïp vaø tieát cellulose bôûi A. xylinum giuùp teá baøo lô löûng vaø tôùi ñöôïc beà maët giaøu khí oxy vì ñaây laø vi khuaån hieáu khí. Do ñoù chæ nhöõng teá baøo gaàn ranh giôùi loûng khí cuûa moâi tröôøng môùi saûn xuaát cellulose (Krystynowicz et al., 2002; Watanabe et al., 1998)  Maøng cellulose xuùc tieán söï hình thaønh taäp ñoaøn cuûa A. xylinum treân cô chaát vaø baûo veä vi khuaån tröôùc nhöõng ñoái thuû caïnh tranh söû duïng cuøng cô chaát.  Vì ñoä nhôùt vaø ñaëc tính öa nöôùc cuûa lôùp cellulose neân khaû naêng choáng chòu vôùi nhöõng thay ñoåi baát lôïi (thay ñoåi pH, söï coù maët cuûa chaát ñoäc vaø vi sinh vaät gaây beänh…) trong moâi tröôøng soáng taêng leân.  Sôïi cellulose giuùp choáng aûnh höôûng gaây cheát cuûa tia UV. 23% vi khuaån acetic ñöôïc bao boïc bôûi maøng cellulose coù theå soáng soùt hôn 1 giôø khi bò chieáu tia UV (Bielecki et al., 2001). 2.2 Sinh toång hôïp cellulose töø vi khuaån A. xylinum 2.2.1 Quaù trình sinh toång hôïp cellulose ôû A. xylinum Theo Ross et al. (1991), con ñöôøng sinh toång hôïp cellulose vi khuaån töø glucose thaønh caùc sôïi keát tinh ñoøi hoûi phaûi coù söï toång hôïp uridine diphosphoglucose (UDPGlucose), sau ñoù laø moät phaûn öùng toång hôïp cellulose vaø cuoái cuøng laø söï taäp hôïp laïi thaønh sôïi cellulose nhoû ñeå hình thaønh neân caùc daûi tinh theå cellulose. 10 Chöông 2. Toång quan taøi lieäu UDP-Glucose laø moät nucleotide tieàn thaân cuûa söï toång hôïp cellulose trong A. xylinum. Nhö sô ñoà duôùi ñaây, quaù trình sinh toång hôïp UDP-Glucose töø glucose laø moät quaù trình traûi qua 3 böôùc coù söï tham gia cuûa 3 loaïi enzyme. Nhöõng böôùc naøy laø söï phosphoryl hoaù cuûa glucose bôûi xuùc taùc cuûa enzyme glucokinase thaønh glucose-6-phosphate, söï izomer hoaù cuûa glucose-6-phosphate thaønh glucose-1-phosphate bôûi phosphoglucomutase, vaø söï toång hôïp UDP-Glucose bôûi UDP-Glucose pyrophosphorylase. UDP-Glucose pyrophosphorylase ñoùng vai troø then choát trong söï sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån A. xylinum trong khi caùc chuûng A. xylinum ñoät bieán khoâng coù khaû naêng toång hôïp cellulose bò thieáu enzyme naøy (Valla & Kjosbakken, 1981). Hình 2.4: Con ñöôøng toång hôïp cellulose trong A. xylinum (Canon & Anderson, 1991) 2.2.2 Cô cheá sinh toång hôïp cellulose vi khuaån Quaù trình sinh toång hôïp cellulose töø A. xylinum treân ñöôïc chia thaønh hai giai ñoaïn chính: giai ñoaïn polymer hoùa vaø giai ñoaïn keát tinh. 2.2.2.1 Giai ñoaïn polymer hoùa Ñaàu tieân enzyme glucokinase (GK) xuùc taùc phaûn öùng phosphoryl hoùa chuyeån glucose thaønh glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau ñoù enzyme phosphoglucomutase (PGM) tieáp tuïc chuyeån hoùa glucose-6-phosphate thaønh glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thoâng qua phaûn öùng isomer hoùa. Glucose-1-phosphate ñöôïc enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyeån hoùa thaønh UDP-Glucose. Cuoái cuøng, UDP-Glucose ñöôïc polymer hoùa thaønh cellulose vaø cellulose ñöôïc tieát ra moâi tröôøng ngoaïi baøo nhôø moät phöùc hôïp protein maøng laø cellulose synthase (Iguchi et al., 2000). 11