BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
PHẠM ÍCH TÙNG
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH CHẾ POLIOVIRUS PHỤC VỤ
PHÁT TRIỂN VẮC XIN BẠI LIỆT BẤT HOẠT
CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1.
PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG
2.
GS.TS. NGUYỄN ĐĂNG HIỀN
Hà Nội - Năm 2017
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng- CB150061
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus
phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất hoạt” là công trình nghiên cứu của tôi cùng
nhóm nghiên cứu sản xuất vắc xin bại liệt bất hoạt thuộc Trung tâm nghiên cứu sản
xuất vắc xin và sinh phẩm y tế thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trương
Quốc Phong và GS.TS Nguyễn Đăng Hiền. Tôi đã nhận được sự đồng ý của trưởng
nhóm và tất cả các thành viên trong nhóm nghiên cứu về việc công bố các nội dung
thực hiện và kết quả thu được. Các nội dung nghiên cứu và kết quả được trình bày
trong luận văn là trung thực và rõ ràng.
Học viên
Phạm Ích Tùng
Xác nhận của cơ quan
(Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế)
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Trương Quốc Phong.
Giám đốc - Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học - Đại học Bách
Khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành
luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn GS.TS. Nguyễn Đăng Hiền. Giám đốc trung tâm
nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế, đã tận tình chỉ bảo cho em trong
suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn.
Em xin cảm ơn các thầy, cô bộ môn Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực
phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong quá
trình học tập và rèn luyện.
Trong thời gian học tập và nghiên cứu tôi đã nhận được sự chỉ dạy tận tình
đầy trách nhiệm của tập thể cán bộ nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sản
xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, tôi xin chân thành cảm ơn những giúp đỡ quý báu
đó.
Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã
luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con đường học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 10 Năm 2017
Học viên
Phạm Ích Tùng
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ARN
Axit Ribonucleic
ATCC
American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ)
BS
Bovine serum (huyết thanh bê)
BTP
Bán thành phẩm
CCID50
Cell Culture Infective Dose 50 (liều gây hủy hoại 50% tế bào)
DU
D-antigen unit ( đơn vị kháng nguyên D)
FBS
Fetal Bovine serum (huyết thanh bê bào thai)
GMP
Good Manufacturing Practice (Thực hành sản xuất tốt)
IgA
Imuno globulin A
IgG
Imuno globulin G
IgM
Imuno globulin M
K
Mẫu đối chứng âm
MCB
Master Cell Bank (ngân hàng tế bào gốc)
MEM
Minimum Essential Medium (Môi trường cần thiết tối thiểu)
MS
Master Seed (chủng giống gốc)
PB
Phospate Buffer
POLYVAC
Center for Research and Production of Vaccines and Biologicals
(Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế)
TCMR
Tiêm chủng mở rộng
TGC
Thioglycolate
SCD
Soybean Casein Digest
Vero
Tế bào thận khỉ Cercopithecus aethiops
WCB
Working Cell Bank (ngân hàng tế bào sản xuất)
WHO/ TCYTTG
World Health Organization /Tổ chức y tế thế giới
WS
Working Seed (chủng sản xuất)
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Mục lục
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3
1.1. Vi rút Bại liệt ........................................................................................................ 3
1.1.1.Về hình thái học ........................................................................................... 3
1.1.2.Về thành phần hóa học của vi rút Bại liệt ................................................... 3
1.1.3.Về tính chất hóa lý ....................................................................................... 4
1.1.4.Về cấu tạo của kháng nguyên ...................................................................... 4
1.1.5.Về tính sinh miễn dịch ................................................................................. 5
1.2. Dịch tễ học bệnh bại liệt ....................................................................................... 5
1.2.1.Tình hình bệnh bại liệt ở Việt Nam ............................................................. 5
1.2.2.Tình hình bệnh bại liệt trên thế giới ............................................................ 6
1.3. Vắc xin Bại liệt ..................................................................................................... 7
1.3.1.Vắc xin Bại liệt sống giảm độc lực (OPV) .................................................. 7
1.3.2.Vắc xin Bại liệt bất hoạt (IPV) .................................................................... 7
1.4. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin IPV ..................................................... 8
1.4.1.Trên thế giới ................................................................................................ 8
1.4.2.Ở Nhâ ̣t Bản ................................................................................................ 10
1.4.3.Ở Việt Nam ................................................................................................ 10
1.5. Các phương pháp tinh chế virus ......................................................................... 11
1.6. Tiêu chuẩn của vắc xin IPV................................................................................ 13
1.6.1.Sản xuấ t ..................................................................................................... 13
1.6.2.Kiể m đinh
̣ vắ c xin thành phẩ m .................................................................. 13
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 15
2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 15
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 16
2.2.1.Phương pháp nuôi thu Poliovirus .............................................................. 16
2.2.2. Phương pháp tinh chế Poliovirus ............................................................ 20
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
2.2.3. Phương pháp đánh giá hiê ̣u quả sản xuấ t bán thành phẩ n vắ c xin IPV .. 26
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................... 38
3.1. Kế t quả nuôi thu Poliovirus ................................................................................ 38
3.2. Kết quả tinh chế Poliovirus ................................................................................ 40
3.2.1. Kết quả tinh chế Poliovirus bằ ng siêu lo ̣c .............................................. 40
3.2.2. Kết quả tinh chế Poliovirus bằ ng siêu ly tâm ......................................... 42
3.2.3. Kết quả tinh chế Poliovirus bằ ng sắ c ký................................................. 43
3.2.4. Kết quả bất hoạt Poliovirus .................................................................... 45
3.3. Kế t quả đánh giá hiê ̣u quả sản xuấ t bán thành phẩ m vắ c xin IPV ..................... 47
3.3.1. Kiể m tra vô trùng trong các giai đoa ̣n .................................................... 47
3.3.2. Kết quả thử nghiệm nhận dạng ............................................................... 49
3.3.3. Kiể m tra hàm lượng protein ................................................................... 49
3.3.4. Kiể m tra nồ ng đô ̣ formandehyd tồ n dư .................................................. 50
3.3.5. Kết quả tinh chế Poliovirus thông qua đánh giá hiệu suất, hiệu quả thu
được qua môi công đoạn .................................................................................... 51
3.4. Đề xuất quy trình sản xuất IPV bán thành phẩm ................................................ 53
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 54
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Danh mục các bảng, biểu đồ
Bảng 2.1: Kiểm tra vô trùng mẫu vắc xin sau ly tâm................................................ 26
Bảng 2.2: Pha mẫu chuẩ n BSA các nồ ng đô............................................................
32
̣
Bảng 2.3: Pha mẫu chuẩ n với thuố c thử Bradford 1X .............................................. 32
Bảng 2.4: Pha dung dich
̣ formandehyd chuẩ n .......................................................... 33
Bảng 2.5: Thực hiê ̣n phản ứng dung dich
̣ formandehyd chuẩ n, mẫu thử, mẫu trắ ng
với acetylaceton. ........................................................................................................ 34
Bảng 3.1: Kế t quả nuôi thu Poliovirus ...................................................................... 39
Biểu đồ 1: Thu nhận Poliovirus typ 1, 2, 3 từ dịch nuôi ........................................... 40
Bảng 3.2 Kế t quả tinh chế Poliovirus bằ ng siêu lo ̣c ................................................. 41
Bảng 3.3 Kế t quả tinh chế Poliovirus bằ ng phương pháp siêu ly tâm ...................... 42
Bảng 3.4: Kết quả tinh chế Poliovirus bằng sắc ký .................................................. 45
Bảng 3.5: Kết quả kiểm tra virus sống tồn dư .......................................................... 46
Bảng 3.6: Kết quả bất hoạt poliovirus....................................................................... 47
Bảng 3.7: Kết quả thử vô trùng trong các giai đoạn ................................................. 48
Bảng 3.8: Kết quả định typ Poliovirus bằng thử nghiệm nhận dạng ........................ 49
Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng protein .......................................................... 49
Bảng 3.10: Kết quả kiểm tra nồng độ formandehyd tồ n dư ...................................... 50
Bảng 3.11: Kết quả thu hồi Poliovirus qua các công đoạn ....................................... 52
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Danh mục các hình
Hình 1.1: Hình thái học Poliovirus[26 ] ...................................................................... 3
Hình 1.2: Đă ̣c điể m của màng siêu lo ̣c[37] ............................................................... 11
Hình 1.3: Phân loa ̣i màng siêu lo ̣c dựa vào kić h thước chấ t tan [37]. ...................... 12
Hình 2.1: Tuyp tế bào Vero từ ngân hàng tế bào Polyvac ........................................ 17
Hình 2.2: Thực hiện siêu lo ̣c mẫu Poliovirus ............................................................ 21
Hình 2.3: Thực hiện siêu ly tâm mẫu Poliovirus ...................................................... 22
Hình 2.4: Đồ thi ̣test cô ̣t ............................................................................................ 24
Hình 2.5: Đồ thi ̣đường “cond” ≈ 9 ms/cm .............................................................. 25
Hình 3.1: Tế bào bám kín 1 lớp ................................................................................ 38
Hình 3.2: Tế bào bi ̣hủy hoa ̣i do Poliovirus .............................................................. 39
Hình 3.3: Kết quả nhồi cột gel .................................................................................. 43
Hình 3.4: Sắc ký đồ tinh chế Poliovirus qua cột DEAE sepharose CL-6B .............. 44
Hình 3.5: Tiêu chuẩn và kết quả protein toàn phần trong mẫu poliovirus................ 50
Hình 3.6: Tiêu chuẩn và kết quả nồng độ formandehyd tồn dư................................ 51
Hình 3.7: Kết quả tinh sạch các typ Poliovirus qua các công đoạn .......................... 52
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
MỞ ĐẦU
Bệnh bại liệt do virus là một bệnh truyền nhiễm cấp tính. Thể điển hình của
bệnh có biểu hiện liệt mềm và để lại di chứng, có thể dẫn tới tử vong. Nguyên nhân
gây bệnh là do virus bại liệt (Poliovirus) týp 1, 2 và 3 [4].
Sabin là người đã tìm ra vắc xin phòng bại liệt uống (OPV, vắc xin sống
uống giảm độc lực) vào năm 1957. Vắc xin này đã được sử dụng trên toàn thế giới
60 năm qua. Văc xin Sabin đã được các nhà khoa học đánh giá và thực tế kiểm
nghiệm là một loại vắc xin phòng bệnh bại liệt có nhiều ưu việt. Chính vắc xin
Sabin đã giúp nhiều nước trên thế giới thanh toán được bệnh bại liệt. Năm 1988 Tổ
chức Y tế Thế giới đã dựa vào những thành tựu do vắc xin đem lại để đưa ra
chương trình thanh toán bệnh bại liệt trên toàn thế giới vào năm 2000.
Ở Việt nam từ những năm 60 của thế kỷ thứ 20, trẻ em đã được dùng vắc xin
bại liệt. Đến năm 2000 Việt nam đã trở thành một trong số các nước trên thế giới
thanh toán được bệnh bại liệt. Tuy nhiên do còn nhiều nước trên thế giới vẫn chưa
thanh toán được bệnh bại liệt nên Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo việc phòng
bệnh bằng vắc xin cho trẻ em cần được tiếp tục thực hiện.
Vắc xin OPV có nhược điểm là chủng Sabin có nguồn gốc từ chủng hoang
dại được làm giảm độc lực, trong quá trình phát triển tự nhiên virus Sabin có thể bị
đột biến và quay trở lại dạng độc lực, có thể gây nên bệnh bại liệt liên quan đến việc
sử dụng vắc xin.
Vắc xin IPV (vắc xin bại liệt bất hoạt) ra đời từ rất sớm năm 1955 (Jonas
Salt) chế phẩm IPV có ưu điểm cao là rất an toàn, không gây ra hiện tượng bệnh bại
liệt liên quan đến sử dụng vắc xin. Trước tình hình đó tổ chức y tế thế giới đã
khuyến cáo các nước đang sử dụng OPV nên từng bước chuyển sang sử dụng vắc
xin IPV tiến tới sử dụng hoàn toàn bằng vắc xin này.
Yêu cầu của vắc xin IPV cần độ tinh khiết cao, không chứa các tạp chất, các
protein lạ… Poliovirus tinh khiết thu được cần có hiệu giá cao, sau đó được bất hoạt
bằng formandehyd, lượng formandehyd tồn dư không quá 0.02% thể tích bán thành
1
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
phẩm thu được. Để đảm bảo tính an toàn của vắc xin thành phẩm, đạt yêu cầu theo
quy định của Dược điển Việt Nam IV và theo tiêu chuẩn của WHO chúng tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất
hoạt”
Mục tiêu của đề tài:
-
Xây dựng được quy trình tinh chế virus bại liệt sản xuất trên tế bào vero.
Nội dung nghiên cứu bao gồm:
-
Nuôi thu Poliovirus
-
Nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế Poliovirus.
-
Nghiên cứu bất hoạt Poliovirus và đánh giá hiệu quả sản xuất bán thành
phẩm vắc xin IPV.
2
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1.
Vi rút Bại liệt
1.1.1. Về hình thái học
Dưới kính hiển vi điện tử, vi rút Bại liệt có
dạng hình khối cầu đường kính khoảng 2730nm bao gồm 1 protein capsit có cấu
trúc bền vững bao bọc lấy ARN của vi rút.
Capsit bao gồm 60 tiểu đơn vị giống hệt
nhau xếp đối xứng 20 mặt, mỗi tiểu đơn vị
gồm 4 chuỗi polypeptit là VP1; VP2; VP3;
và VP4. Bằng phương pháp chiếu xạ tia X
người ta biết chi tiết cấu trúc của hạt vi rút
Hình 1.1: Hình thái học Poliovirus[26 ]
hoàn chỉnh [4,7,24,26, 29].
1.1.2. Về thành phần hóa học của vi rút Bại liệt
•
Vật liệu di truyền của Poliovirus: Là ARN một sợi dương, có chiều dài
2,4m, trọng lượng phân tử 2,5 x 106 dalton cuộn lại nằm gọn trong vỏ capsit. Đầu
5’ có một đoạn polypeptit được gọi là VPg gồm 11 axit amin gắn vào còn đầu 3’ bị
polyadenyl hóa. ARN của vi rút được chia thành 3 vùng chủ yếu: Vùng không mã
hóa đầu 5’ bao gồm 740 nucleotide, chiếm khoảng 10% vật liệu di truyền. Khung
đọc mở đơn bao gồm 6635 nucleotide chiếm khoảng 89% vật liệu di truyền. Vùng
không mã hóa 3’ bao gồm 75 nucleotide, chiếm khoảng 1% vật liệu di truyền [4].
•
Protein: Protein capsit của vi rút Bại liệt bao gồm 4 chuỗi polypeptit. VP1
bao gồm 306 axit amin có trọng lượng phân tử 35,5 KDa; VP2 bao gồm 272 axit
amin có trọng lượng phân tử 30,0 kDa; VP3 gồm 238 axit amin có trọng lượng
phân tử 26,4 KDa và VP4 gồm 69 axit amin, trọng lượng phân tử 7 KDa. Trong đó
VP1, VP2, VP3 tạo nên cấu trúc bề mặt của virus còn VP4 nằm trong vỏ capsit và
liên kết với axit nhân (ARN). Các Protein bề mặt tạo nên các vị trí kháng nguyên
3
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
trung hòa. Ngoài ra vỏ capsit còn có tác dụng bảo vệ axit nhân và quyết định khả
năng hấp phụ của virus lên bề mặt tế bào thông qua các thụ thể đặc hiệu [4].
•
Lipit: Virus Bại liệt không chứa lipit nên không nhạy cảm với tác động của
ete, cồn, phenol 1% và các thuốc tẩy thông thường. Dựa vào đặc tính này người ta
sử dụng cloroform để xử lý bệnh phẩm trước khi phân lập virus mà không làm mất
hoạt tính của virus [4].
1.1.3. Về tính chất hóa lý
Virus Bại liệt rất nhạy cảm với nhiệt độ. Ở 56oC virus bị bất hoạt hoàn toàn
trong vòng 30 phút. Ở nhiệt độ 20-24oC virus bị bất hoạt vào cuối tháng thứ 3. Ở
nhiệt độ 37oC vius giảm hiệu giá hàng ngày vào khoảng 0,15 lg [5].
Virus Bại liệt tăng tính chịu nhiệt khi có mặt của của ion canxi hoặc ion
magie ở nồng độ 1M.
Virus Bại liệt bền vững với dải pH rộng từ 2-10, nhưng pH thích hợp nhất tại
pH 6,5-7,2.
Ngoài ra virus Bại liệt bị bất hoạt hoàn toàn bởi formandehyd nhưng tính
kháng nguyên vẫn bảo tồn nguyên vẹn [2].
1.1.4. Về cấu tạo của kháng nguyên
Kháng nguyên của hạt virus hoàn chỉnh có khả năng gây nhiễm trùng gọi là
kháng nguyên D (hay còn gọi là kháng nguyên N). Khi hạt virus bị đun nóng 50600C hình thái của hạt virus bị thay đổi và kháng nguyên D chuyển thành kháng
nguyên C (hay còn gọi là kháng nguyên H). Kháng nguyên D có hằng số lắng là
160S còn kháng nguyên C có hằng số lắng là 80-90S [4,24].
Kháng nguyên D là hạt virus hoàn chỉnh bao gồm cả ARN và vỏ capsit, còn
kháng nguyên C chỉ là vỏ capsit không có axit nhân và VP4. Kháng nguyên D và C
không có phản ứng miễn dịch chéo. Hai kháng nguyên này được phát hiện bằng
phản ứng kết hợp bổ thể và phản ứng kết tủa trên thạch.
Kháng nguyên D có khả năng tạo kháng thể trung hòa đặc hiệu typ và bám
vào thụ thể của tế bào cảm thụ, nhờ chức năng này mà virus có thể xâm nhập vào
bên trong tế bào cảm thụ để nhân lên.
4
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Kháng nguyên C là kháng nguyên chung cho tất cả các typ, nó kích thích cơ
thể tạo ra kháng thể kết hợp bổ thể nhưng nếu dùng kháng nguyên này để chế tạo
kháng huyết thanh thì sẽ không thu được kháng thể trung hòa [4,5,24].
1.1.5. Về tính sinh miễn dịch
Miễn dịch thụ động được truyền từ mẹ sang con. Kháng thể này chỉ xuất hiện
ở trẻ sơ sinh sau đó giảm dần và biến mắt khi trẻ được 6 tháng tuổi.
Miễn dịch chủ động là sự đáp ứng miễn dịch khi cơ thể bị nhiễm virus tự
nhiên hoặc sử dụng vắc xin. Đây là loại miễn dịch quan trọng mà loài người đã biết
ứng dụng để phòng bệnh bằng cách dùng vắc xin. Khi bị nhiễm virus Bại liệt hoang
dại hoặc virus vắc xin, cơ thể tạo ra miễn dịch đặc hiệu chống lại virus Bại liệt.
Kháng thể đặc hiệu chủ yếu là miễn dịch dịch thể bao gồm IgM, IgG và IgA.
Kháng thể IgM và IgG phát hiện được sau khi nhiễm vi rút 2-3 ngày. Hiệu
giá kháng thể cao ở những ngày đầu và hết sau 2-3 tháng. Hiệu giá kháng thể IgG
tăng và tồn tại lâu nhất trong cơ thể có thể tới 40 năm, đây là kháng thể trung hòa có
khả năng chống lại vi rút Bại liệt đến hệ thần kinh trung ương. Hiệu giá kháng thể
IgA phát hiện 2-6 tuần sau khi nhiễm vi rút nhưng hiệu giá thấp, tăng chậm trong 3
tháng đầu sau khi nhiễm vi rút và tồn tại trong 6 năm [2,4].
1.2.
Dịch tễ học bệnh bại liệt
1.2.1. Tình hình bệnh bại liệt ở Việt Nam
Năm 1952 vụ dịch bại liệt lớn đầu tiên được phát hiện ở Hà Nội có khoảng
1500 người mắc. Trong 3 năm liên tục 1957,1958,1959 đã xảy ra 3 vụ dịch lớn ở Hà
Nội và Miền bắc Việt Nam với hàng ngàn người mắc trong đó 80-90% là trẻ < 3tuổi.
Vụ dịch năm 1959 với tỷ lệ mắc trên toàn miền bắc là 44,99/100.000 dân , còn riêng
Hà Nội tỷ lệ mắc là 226/100.000 dân. Vắc xin bại liệt (Sabin) được sử dụng đầu tiên
ở Miền Bắc từ tháng 12 năm 1959 do Liên Xô cung cấp với số lượng ít. Từ cuối
năm 1961 đầu năm 1962 bắt đầu dùng vắc xin Sabin do Việt Nam sản xuất và dùng
liên tục cho đến ngày nay [8].
Sau khi giải phóng miền nam thống nhất đất nước năm 1975 bệnh bại liệt
xuất hiện ở nhiều nơi trong cả nước nhất là các tỉnh phía nam.
5
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Năm 1981 Việt Nam tiến hành chương trình TCMR cho trẻ dưới 1 tuổi. Đến
năm 1986 chương trình được mở rộng trên phạm vi cả nước. Chương trình uống vắc
xin phòng Bại liệt đã đạt được kết quả cao. Trong những năm 80 đạt 87% và trong
những năm 90 đạt trên 90%. Kể từ năm 1993 hàng năm còn tổ chức 2 đợt những
ngày tiêm chủng toàn quốc cho trẻ dưới 5 tuổi uống 2 liều vắc xin bại liệt đạt trên
99%. Do đó tình hình mắc bệnh bại liệt giảm đi rõ rệt. Năm 1993, năm bắt đầu
chiến dịch những ngày TCTQ, có 152 ca bại liệt trong toàn quốc. Năm 1994 còn 31
ca. Năm 1995 còn 12 ca, đến 1996 chỉ còn 2 ca và năm 1997 chỉ còn 1 ca. Đến năm
2000 Việt Nam đã công bố thanh toán được bệnh bại liệt, đến nay chưa phát hiện
thêm ca mắc mới nào [8].
1.2.2. Tình hình bệnh bại liệt trên thế giới
Năm 1887 một vụ dịch lớn sảy ra ở Stôckhôm, đây là vụ dịch bại liệt đầu
tiên được người ta biết đến.
Từ cuối thế kỷ 19 và nửa đầu thế kỷ 20 nhiều vụ dịch lớn xảy ra ở châu Âu
và Mỹ. Đặc biệt sau chiến tranh thế giới lần thứ II bệnh bại liệt đã lan tràn khắp thế
giới.
Vắc xin phòng bệnh bại liệt được sử dụng đầu tiên ở Mỹ ( IPV-1955) và
Liên Xô vào năm 1959 (OPV). Đến năm 1974 TCYTTG bắt đầu thực hiện
CTTCMR trong đó có bại liệt. Năm 1985 TCYTTG khu vực Mỹ La tinh đưa ra
chương trình thanh toán bại liệt trong khu vực. Năm 1988 TCYTTG đưa ra chương
trình thanh toán bại liệt toàn cầu vào năm 2000. Số trẻ dưới 1 tuổi được tiêm chủng
vắc xin phòng Bại liệt đạt tới 85%. Hàng năm các nước còn tổ chức 2 đợt những
ngày tiêm chủng toàn quốc cho toàn bộ số trẻ dưới 5 tuổi đạt trên 95% [7, 35].
Năm 1992 cả thế giới có 14.467 trường hợp thì vùng Đông và Nam Á
chiếm 9.184 (Gồm các nước Ấn Độ, Pakistan, Bangladet) và khu vực Tây Thái
Bình Dương có 1.890 ca ( gồm Trung quốc, Nhật Bản, Philipin). Ở Braxin nơi có tỷ
lệ mắc rất cao thì đến năm 1992 số ca do virus hoang dại đã không còn nữa. Châu
Mỹ tuyên bố không còn bệnh bại liệt năm 1994 [11, 25].
6
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Năm 2000, bệnh bại liệt được tuyên bố đã loại bỏ chính thức ở 37 quốc gia
phía tây Thái Bình Dương, bao gồm cả Trung Quốc và Úc [10].
Châu Âu tuyên bố không còn bệnh năm 2002.
Cho đến năm 2012, bại liệt chỉ còn phổ biến ở 3 quốc gia là Nigeria, Pakistan,
và Afghanistan. Song, trong thời gian gần đây, bệnh bại liệt đã vượt ra khỏi biên
giới của 3 quốc gia này và tiến sang các đất nước láng giềng. Có tới 7 quốc gia đã
từng "xóa sổ" bệnh bại liệt ghi nhận nhiều trường hợp mắc bệnh trở lại sau nhiều
năm: Cameroon, Guinea, Ethiopia, Iraq, Israel, Somalia và Syria. WHO đã từng hy
vọng có thể công bố xóa sổ bệnh bại liệt trên toàn cầu vào năm 2000. Cột mốc này
sau đó bị chuyển thành 2005, 2008, 2012, 2015 và giờ là 2018[6].
1.3.
Vắc xin Bại liệt
1.3.1. Vắc xin Bại liệt sống giảm độc lực (OPV)
Vắc xin sống giảm độc lực còn gọi là vắc xin Sabin được sản xuất trên tế bào
thận khỉ tiên phát hoặc thứ phát (Vero)[12]. Chủng của 3 typ dùng để sản xuất vắc
xin Sabin được nhận từ chủng giảm độc lực do Sabin cấy truyền và cải tạo từ chủng
hoang dại. Virus vắc xin Sabin là virus giảm độc lực nên virus kích thích cơ thể tạo
cả miễn dịch tại chỗ và miễn dịch dịch thể. Vì vậy OPV vừa ngăn chặn virus hoang
dại vào hệ thống thần kinh trung ương vừa ngăn chặn virus Bại liệt hoang dại xâm
nhập và nhân lên tại đường xâm nhập. OPV tạo miễn dịch sớm và tồn tại lâu dài,
giá thành rẻ, dễ sử dụng nên sử dụng rộng rãi trên toàn cầu đặc biệt là các đang và
kém phát triển [8,10].
1.3.2. Vắc xin Bại liệt bất hoạt (IPV)
Vắc xin bại liệt bất hoạt hay còn gọi là vắc xin Salk được sản xuất trên tế bào
thận khỉ tiên phát hoặc thứ phát, chủng của 3 typ dùng để vắc xin là chủng hoang
dại Mahoney (đối với týp 1), MEF (týp 2) và Saukett (týp 3). Hầu hết các nhà sản
xuất trên thế giới đều dùng những chủng này trừ Thuỷ Điển họ dùng chủng
Brunenders cho týp 1. Đòi hỏi đầu tiên của văcxin Bại liệt bất hoạt là việc bất hoạt
hoàn toàn tính gây bệnh của virus mà không ảnh hưởng đến khả năng gây ĐƯMD
của chúng. Vắc xin IPV chỉ có thể tạo ra được ĐƯMD dịch thể, chúng chỉ có thể
7
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
ngăn ngừa sự lan toả của virus từ hầu họng và ruột non đến hệ thần kinh trung ương
chứ không thể bất hoạt và ngăn ngừa sự nhân lên của virus ở hầu họng và ruột
được. Khi bị nhiễm virus Bại liệt hoang dại những người được tiêm IPV vẫn đào
thải virus ra ngoài và trở thành một nguồn lây nguy hiểm. Hay nói cách khác IPV
chỉ có thể bảo vệ cho từng cá nhân riêng lẻ [5,12].
1.4.
Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin IPV
1.4.1. Trên thế giới
Năm 1936, Brodie, Park và Kolmer đã dùng phương pháp hóa học để bất
hoạt hỗn dịch virus thu được sau khi gây nhiễm virus vào hệ thống thần kinh trung
ương của khỉ. Nhưng do khả năng kiểm tra tính an toàn của vắc xin chưa được tốt
nên vắc xin gây ra nhiều tai biến và không được sử dụng.
Năm 1948 Morgan đã chứng minh hỗn dịch virus Bại liệt typ II được bất
hoạt bằng Formandehyd có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên khỉ. Cũng theo
phương pháp đó, người ta đã thực hiện với virus typ I. Nghiên cứu trên chuột đã
khẳng định rằng virus Bại liệt typ II gây được miễn dịch trên loài gặm nhấm. Năm
1952 tiến hành thử nghiệm trên đười ươi và 6 người tình nguyện cho thấy kháng thể
tồn tại trên 6 tháng. Những kết quả nghiên cứu này cho thấy virus bất hoạt bằng
Formandehyd có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể khỏi bị bệnh Bại
liệt [31,35].
Một phát hiện có tính đột phá là virus Bại liệt có khả năng nhân lên trên các
nuôi cấy tế bào mô thần kinh của người và khỉ, sau đó người ta biết được rằng virus
Bại liệt có khả năng nhân lên trên nuôi cấy tế bào thận khỉ. Hỗn dịch gặt được từ
nuôi cấy tế bào thận khỉ được bất hoạt bằng Formandehyd có khả năng gây đáp ứng
miễn dịch. Hiệu lực bảo vệ của cả 3 typ vắc xin bất hoạt bằng Formandehyd đã
được chứng minh qua một thử nghiệm lớn trên thực địa của Thomas Francis năm
1954. Kết quả của thử nghiệm này cho thấy vắc xin có hiệu lực bảo vệ đạt 80-90%
trong đó typ I là 60-70%, typ II và typ III là 90 và trên 90%. Sự khác biệt giữa các
typ và hiệu lực thấp hơn so với dự kiến là do sự có mặt của Thimerosal một chất
dùng làm chất bảo quản trong đó hàm lượng của chất này trong typ I lớn hơn typ II
8
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
và typ III. Vấn đề này được chứng minh một cách rõ ràng khi người ta thay thế
Thimerosal bằng chất khác. Vắc xin bất hoạt còn gọi là vắc xin Salk, được sản xuất
trên tế bào thận khỉ tiên phát, bất hoạt virus bằng formandehyd có nồng độ cuối
cùng là 1/4000 [32,34].
Tháng 4/1955, vắc xin Bại liệt bất hoạt đã được sử dụng trước mùa dịch Bại
liệt tại Mỹ. Đến năm 1961 số trẻ mắc bệnh giảm xuống tới 90% so với giai đoạn
trước khi dùng vắc xin. Kết quả này đạt được khi 54% dân số đã nhận đủ 3 hoặc
hơn 3 liều vắc xin bất hoạt chủ yếu là trẻ em [35].
Tiếp theo đó IPV đã được sản xuất và sử dụng ở nhiều nước trên thế giới,
phương pháp sản xuất, tinh chế, kiểm định vắc xin bại liệt bất hoạt đã có nhiều tiến
bộ và thay đổi so với phương pháp được sử dụng trong thời gian đầu.
Ban đầu vắc xin được sản xuất trên NCTB thận khỉ tiên phát trong những
chai nhỏ ( Chai dẹt, dung tích 1,2-1,5 lít). Nhưng ngày nay nó đã được nuôi cấy trên
những bình lớn (Tank) với những vật mang vi thể (Microcarier) [31,33]. Bước tiếp
theo của qui trình sản xuất là cô đặc nước nổi, tinh chế và bất hoạt bằng
formaldehyde để loại bỏ tính gây bệnh của virus mà vẫn giữ được tính kháng
nguyên [35]. Đòi hỏi đầu tiên của vắc xin bại liệt bất hoạt là việc bất hoạt hoàn toàn
tính gây bệnh của virus mà không ảnh hưởng đến khả năng gây đáp ứng miễn dịch
của chúng. Đó là kết quả của quá trình nghiên cứu quá trình virus bị bất hoạt tại
những nhiệt độ khác nhau cũng như là tại các nồng độ formandehyd khác nhau. Với
những điều kiện thích hợp kháng nguyên vẫn còn tính miễn dịch tốt như thời điểm
mà virus chưa bị bất hoạt [32,35].
Để tránh nhiễm trùng trong quá trình sản xuất một số kháng sinh đã được sử
dụng như Streptomycin, Neomycin, Polymycin B. Trong quá trình tinh chế các
kháng sinh này sẽ được làm giảm đến mức không thể chuẩn độ được ở vắc xin
thành phẩm. Lượng nhỏ formandehyd và 2-phenoxyethamol còn lại trong vắc xin
được coi như là chất bảo quản.
Hiện nay hầu hết các cơ sở sản xuất văc xin IPV như Mỹ và các nước Châu
Âu sử dụng chủng virus hoang dại [35].
9
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
1.4.2. Ở Nhật Bản
Xuấ t phát từ viê ̣c sử du ̣ng vắ c xin OPV đã ngăn chă ̣n đươ ̣c các vu ̣ dich
̣ lớn
trong năm 1960- 1961 từ 5606 trường hơ ̣p bi ̣ ba ̣i liê ̣t xuố ng còn 20 trường hơ ̣p năm
1963. Nhưng những năm sau đó các báo cáo sau đó chỉ ra rằ ng bê ̣nh ba ̣i liê ̣t có liên
quan đế n virus vắ c xin, viê ̣c sử du ̣ng vắ c xin an toàn hơn để không còn virus vắ c
xin lưu hành là yêu cầ u cấ p thiế t. Những nghiên cứu đầ u tiên người ta nhâ ̣n thấ y sử
du ̣ng chủng virus hoang da ̣i để sản xuấ t vắ c xin bấ t hoa ̣t thì hiê ̣u quả bảo vê ̣ tương
tự như sử du ̣ng chủng giảm đô ̣c lực của Sabin. Song viê ̣c sử du ̣ng chủng đô ̣c lực để
sản xuấ t là rấ t nguy hiể m với các cơ sở sản xuấ t không đủ đảm bảo, dễ dàng đưa
virus hoang da ̣i ra ngoài cô ̣ng đồ ng [19, 22, 23]. Xuấ t phát từ tình hình trên từ cuố i
những năm 70 viê ̣n nghiên cứu ba ̣i liê ̣t Nhâ ̣t Bản đã sử du ̣ng chủng giảm đô ̣c lực
của Sabin để sản xuấ t vắ c xin ba ̣i liê ̣t bấ t hoa ̣t [14,15, 18, 21].
Vắ c xin của Nhâ ̣t Bản sử du ̣ng tế bào Vero nuôi theo hê ̣ thố ng đô ̣ng bình lớn
có những ha ̣t rấ t nhỏ mang tế bào ( microcarrier system- celligen plus) chủng 3 typ
của Sabin đươ ̣c gây nhiễm trên tế bào Vero nuôi cấ y trong hê ̣ thố ng này đề u cho
hiê ̣u giá cao. Phầ n trăm thu hồ i poliovirus tiń h theo nồ ng đô ̣ kháng nguyên D qua
các giai đoa ̣n như siêu lo ̣c, siêu ly tâm, cha ̣y qua cô ̣t sắ c ký trao đổ i ion và bấ t hoa ̣t
là 30-50% [33].
Hiê ̣n nay ở Nhâ ̣t Bản vắ c xin ba ̣i liê ̣t bấ t hoa ̣t chủ yế u dùng ở da ̣ng vắ c xin
phố i hơ ̣p DTaP- sIPV đươ ̣c sử du ̣ng vào tiêm chủng tử năm 2012 [25].
1.4.3. Ở Việt Nam
Việt Nam là một trong những nước sản xuất văcxin sống giảm độc lực từ
những năm 1960, đã khống chế được những vụ dịch lớn và đã thanh toán được bệnh
Bại liệt vào tháng 10 năm 2000. Hiện nay Việt Nam chưa sản xuất được văc xin
Bại liệt bất hoạt. Theo khuyến cáo của TCYTTG (WHO) trong thời gian tới Việt
Nam phải dùng văc xin Bại liệt bất hoạt. Trong khi nếu nhập văc xin thì nhà nước
không đủ kinh phí. Chính vì vậy việc nghiên cứu và sản xuất IPV là rất cần thiết
cho sức khoẻ cộng đồng [1, 17, 20].
10
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Trung tâm khoa học và sản xuất vắc xin Sabin –Bộ Y tế được sự tài trợ của
Bộ Khoa Học Công Nghệ và Bộ Y Tế đã bắt đầu nghiên cứu ứng dụng qui trình
công nghệ sản xuất vắc xin Bại liệt bất hoạt từ chủng Sabin từ năm 2003 nhưng
hiệu quả còn thấp.
1.5.
Các phương pháp tinh chế virus
1.5.1. Siêu lọc
Phương pháp siêu lọc được sử dụng để cô đặc, làm sạch, đổi đệm, loại bỏ các
tạp chất có trọng lượng phân tử thấp hơn kích thước màng lọc. Siêu lọc là quá trình
lọc dòng chảy tiếp tuyến, công nghệ sử dụng màng lọc có tính thẩm thấu ngược,
những chất được giữ lại quay trở về bình chứa mẫu, chất thấm qua màng được thải
ra ngoài.
Hình 1.2: đặc điể m của màng siêu lọc[37]
Người ta phân chia cho lọc, siêu lọc dựa vào kích thước của phân tử chất tan,
virus...Tính chất của siêu lọc được quyết định bởi màng lọc và mục đích của người
sử dụng. Nếu cô đặc thì thu lại tại bình chứa mẫu và trên dây lưu hồi, nếu lấy dung
dịch được làm sạch giữ lại các gel, hạt lơ lửng thì sản phẩm thu hồi là dung dịch ở
đường thải.
11
Luận văn thạc sĩ Khoa học
Phạm Ích Tùng – CB150061
Hình 1.3: Phân loại màng siêu lọc dựa vào kích thước chấ t tan [37].
Sử du ̣ng màng siêu lọc loại 100KDa kích thước lỗ màng 0,01 µm để cô đă ̣c
Poliovirus. Poliovirus có kić h thước 27-30 nm tương đương 0,027 - 0,03µm, như
vâ ̣y màng siêu lo ̣c kích thước 0,01 µm phù hợp cho thực hiện siêu lọc Poliovirus
[13].
1.5.2. Siêu ly tâm
Phương pháp siêu ly tâm sử dụng máy siêu ly tâm với số vòng quay rất lớn,
sự quay tạo ra lực ly tâm nó tác động khác nhau vào các thành phần khác nhau, các
chất có trọng lượng khác nhau trong dung dịch cần ly tâm. Công dụng của siêu ly
tâm là tách hỗn hợp các chất có trọng lượng phân tử khác nhau[13].
1.5.3. Sắc ký
Sắc ký có nhiều phương pháp khác nhau như sắc ký lọc gel, sắc ký giấy, sắc
ký trao đổi ion... dùng để tách các tạp chất trong một hỗn hợp. Nguyên tắc chung
của các phương pháp sắc ký là cho mẫu chứa chất cần phân tách trong pha động di
chuyển qua pha tĩnh. Sự phân tách phụ thuộc vào bản chất của phương pháp sắc ký
nó phụ thuộc vào trong lượng phân tử, độ mang điện của các chất cần phân tách.
Pha tĩnh ngăn cản sự chuyển động của các thành phần trong mẫu, khi các chất này
di chuyển qua hệ thống với tốc độ khác nhau, chúng sẽ tách được nhau theo thời
gian.
12
- Xem thêm -