Tài liệu Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao

ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i MỤC LỤC ......................................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................. vi LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 4 1.1. Chitosan có độ deacetyl cao, tính chất và ứng dụng .............................. 4 1.1.1. Tính chất của chitosan. ............................................................... 6 1.1.2. Ứng dụng của chitosan ............................................................. 10 1.2. Quy trình sản xuất chitosan .................................................................. 12 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ deacetyl trong quá trình sản xuất chitosan ............................................................................................... 14 1.2.2. Ảnh hưởng của độ Deacetyl đến tính chất và ứng dụng của Chitosan .............................................................................................. 16 1.2.2.1. Ảnh hưởng của độ deacetyl đến tính chất của chitosan .... 16 1.2.2.2. Ảnh hưởng của độ deacetyl đến khả năng ứng dụng của chitosan ........................................................................................... 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 19 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................... 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 19 2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ............................................. 19 2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chi tiết.................................................. 20 2.2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quá trình deacetyl lần 1 ............... 20 2.2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm quá trình deacetyl lần 2 ............... 24 2.2.3.Các phương pháp phân tích. ...................................................... 25 iii 2.2.3.1. Xác định độ ẩm và hàm lượng khoáng[14] (phụ lục 3) ... 25 2.2.3.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp microbiuret[14] (phụ lục 3) .......................................................... 25 2.2.3.3. Xác định độ nhớt của chitosan bằng máy đo độ nhớt Brookfiel[22] (phụ lục 3) ................................................................ 25 2.2.3.4. Xác định độ deacetyl (DD) (Tao và cộng sự) (phụ lục 3) . 25 2.2.3.5. Xác định trong lượng phân tử theo phương pháp đo độ nhớt nội (phụ lục 3) ....................................................................... 25 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................ 25 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 26 3.1. Kết quả chất lượng chitin ban đầu ...................................................... 26 3.2. Kết quả nghiên cứu điều kiện Deacetyl lần 1 ...................................... 26 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến DD của chitosan ............. 26 3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến DD của chitosan ......................... 29 3.2.3. Ảnh hưởng của thời gian đến DD của chitosan ....................... 31 3.3. Kết quả nghiên cứu điều kiện deacetyl lần 2 ....................................... 33 3.4. Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl > 90% ................. 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................................. 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl (Trung và cộng sự, 2006) .................................................................................................... 6 Bảng 1.2. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan ......................... 8 Bảng 1.3. Mô tả một số quy trình deacetyl bằng phương pháp hóa học ........ 13 Bảng 2.1. Tính chất của chitin ........................................................................ 19 Bảng 3.1. Kết quả chất lượng chitin ban đầu ................................................. 26 Bảng 3.2. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan ................................................................................ 27 Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan ................................................................................ 30 Bảng 3.4. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan ................................................................................ 32 Bảng 3.5. Kết quả hàm lượng protein (%), hàm lượng khoáng (%) và độ nhớt (mpa.s) của chitosan ................................................................................ 36 Bảng 3.6. Kết quả chất lượng chitosan sau 2 lần deacetyl ............................. 38 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitosan. ......................................................... 5 Hình 1.2. Quá trình Deacetyl. ........................................................................... 13 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. .................................................... 20 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl của chitosan................................................................... 21 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ deacetyl của chitosan. ............................................................................. 22 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ deacetyl của chitosan. ............................................................................. 23 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến độ deacetyl của chitosan. ............................................................................. 24 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl (DD) và phân tử lượng (Mw) của chitosan. ...................................................................... 27 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ khử acetyl đến độ deacetyl (DD) và phân tử lượng (Mw) của chitosan. ....................................................................... 29 Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian khử acetyl đến độ deacetyl (DD) và phân tử lượng (Mw) của chitosan. ................................................................... 31 Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian và số lần deacetyl đến DD của chitosan. . 34 Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian và số lần deacetyl đến phân tử lượng của chitosan. .................................................................................................. 35 Hình 3.6. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan có độ Deacetyl >90%. ................ 37 vi DANH MỤC VIẾT TẮT CTS : Chitosan CT : chitin DD : Degree of deacetylation Mw : Molecular weight VSV : Vi sinh vật w/v : Weight/volume 1 LỜI MỞ ĐẦU Chitosan là một polymer sinh học, có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và cuộc sống, đặc biệt là trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Khi chế biến những loài thủy sản giáp xác (tôm, cua), lượng chất thải (có chứa chitin) chiếm tới 50% nguyên liệu đầu vào và con số trên thế giới là 5,11 triệu tấn/năm (theo www.chinhphu.vn), nó là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến môi trường sống của con người và thiên nhiên. Tuy nhiên, đây lại là nguồn nguyên liệu chính trong sản xuất chitosan. Vì vậy, ứng dụng chitosan vào trong bảo quản nguyên liệu, bán thành phẩm nhằm thúc đẩy ngành công nghệ sản xuất chitosan phát triển, tăng giá trị sản phẩm, làm giảm ô nhiễm môi trường do phế thải trong quá trình chế biến các sản phẩm thủy sản giáp xác, đồng thời làm tăng thời gian bảo quản sản phẩm. Ở nước ta sản phẩm tôm đông lạnh chiếm một sản lượng rất lớn (theo ước tính ở nước ta chỉ riêng tôm nuôi đã có khoảng hơn 1 triệu ha diện tích với năng suất bình quân 1 – 1,5 tấn/ha), chính vì vậy vỏ tôm phế liệu là nguồn nguyên liệu dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên rất thuận tiện cho việc cung cấp chitin và chitosan. Tính cấp thiết của đề tài: Qua khảo sát và tìm hiểu nhiều tài liệu nghiên cứu thấy được chitosan có rất nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, tuy nhiên khả năng ứng dụng của chitosan còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có mức độ deacetyl của chitosan. Mức độ deacetyl của chitosan có ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng ứng dụng của chitosan đặc biệt là chitosan có độ deacetyl cao. Theo nhiều nghiên cứu cho biết chitosan có độ deacetyl cao có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa rất tốt. Theo Dương và cộng sự (2009), chitosan có độ deacetyl càng cao, nồng độ dung dịch càng cao thì khả năng tiêu diệt VSV tổng số càng lớn. Bên cạnh đó, thực phẩm ta dùng hằng ngày như cá, thịt, 2 trái cây,… có thể nói rất dễ bị hư hỏng bởi sự xâm nhập của các loại vi khuẩn, dễ bị oxy hóa bởi không khí khi ta chỉ bảo quản ở các điều kiện thông thường, thời gian bảo quản lại ít, do đó việc bổ sung chất bảo quản nhằm giảm thiểu hư hỏng đối với các nguyên liệu thực phẩm đang được rất nhiều người quan tâm. Tuy nhiên, hiện nay với sự phát triển của khoa học, việc lạm dụng hóa chất bảo quản vào trong thực phẩm đang là vấn đề rất được quan tâm, và việc sử dụng chất bảo quản vào trong thực phẩm là một vấn đề rất nhạy cảm, như là “con dao hai lưỡi” và rất tốn kém. Dựa vào sự tạo màng và khả năng kháng khuẩn của chitosan ta có thể sử dụng chitosan để bảo quản thực phẩm mà không gây hại đến người tiêu dùng và kéo dài thời gian bảo quản. Chitosan có độ deacetyl trung bình 75 – 85% có thể được ứng dụng làm màng bao trong bảo quản các loại thực phẩm nhưng khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa kém hơn chitosan có độ deacetyl cao với một số loại thực phẩm dễ bị hư hỏng bởi vi khuẩn, vì vậy cần phải sản xuất ra chitosan có độ deacetyl cao để nâng cao khả năng ứng dụng vào thực phẩm, đảm bảo thực phẩm sạch và an toàn. Vấn đề được đặt ra ở đây là làm thế nào để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao để đáp ứng nhu cầu trên? Xuất phát từ thực tế trên, được sự đồng ý của Chủ nhiệm Khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Nha Trang, tôi xin thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao” để phục vụ trong bảo quản thực phẩm. Mục tiêu của đề tài Xác định được các điều kiện deacetyl thích hợp nhất để tạo ra sản phẩm chitosan có DD cao. 3 Tính mới của đề tài Hiện nay trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều nghiên cứu về chitosan, tuy nhiên có ít tài liệu nghiên cứu để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao, và chưa có công bố chính thức về quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao. Nội dung của đề tài - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ khử acetyl và thời gian khử acetyl của chitosan trong quá trình deacetyl lần 1. - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử acetyl của chitosan trong quá trình deacetyl lần 2. - Đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao. Tính khoa học Xác định được các nồng độ NaOH thích hợp, nhiệt độ và thời gian khử acetyl thích hợp để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao. Tính thực tiễn Sản xuất được chitosan có độ deacetyl cao và mở rộng ứng dụng nó vào việc bảo quản thực phẩm. Phù hợp với điều kiện sản xuất của phòng thí nghiệm và cho các nhà máy sau này. 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Chitosan có độ deacetyl cao, tính chất và ứng dụng Tên hóa học của chitosan là: Poly-β-1,4-D-glucosamine, hay còn gọi là Poly-β-1,4-2-amino-2-deoxy-D-glucose. Qua đây ta thấy chitosan là một polymer hữu cơ, có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị β-D Glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid[5, 6, 10, 12], là dẫn xuất của chitin sau khi đã được deacetyl, có cấu trúc mạch thẳng, được hình thành từ hai monomer là N-acetyl-glucosamine (GlcNAc – tiểu phần A) và glucosamine (GlcN – tiểu phần D), với một tỷ lệ phần trăm thấp hơn của tiểu phần A (0 – 40%). Trong tự nhiên, chitosan tồn tại trong vách tế bào của các loài nấm nhưng với một tỷ lệ thấp hơn đáng kể so với chitin. Chitosan là tên gọi chung của các polymer là dẫn xuất từ chitin với độ deacetyl (DD) trên 60%. Tùy thuộc vào mức độ deacetyl, hàm lượng nitơ trong chitosan sẽ dao động từ 7-9,5% và chitosan sẽ có sự khác nhau về hoạt tính sinh học, tính chất lưu biến ngoại trừ tính chất chung là đều có thể tan trong dung dịch acid hữu cơ có pH thấp hơn 6,0 như acid acetic, acid formic, acid lactic, acid citric[8]. DD của chitosan thể hiện hàm lượng -NH2 trong phân tử chitosan. Các thí nghiệm đều chứng tỏ chitosan với DD cao thể hiện tính kháng khuẩn và khả năng làm sạch nước hiệu quả. Điều này có thể được giải thích là do sự tăng lên về khả năng ion hóa và tạo phức của chitosan[4]. Khi chitosan có độ DD càng lớn thì nhóm NH3+ càng nhiều dẫn đến khả năng kháng khuẩn lớn hơn. Đồng thời độ DD lớn thì sự tạo phức với nhóm NH2 có trong phân tử chitosan với các ion kim loại của tế bào vi sinh vật, làm tăng khả năng ức chế sự phát triển của VSV do sự mất cân bằng. Theo kết quả của Lê Tùng Dương (2009), ứng dụng chitosan trong bảo quản cá Đổng Quéo thì với chitosan có nồng độ càng cao, độ DD càng lớn thì khả năng tiêu diệt vi 5 sinh vật càng mạnh và ngược lại. Cụ thể với CTS có DD = 95%, nồng độ 2% thì tiêu diệt được 90,21%, trong khi đó CTS với DD = 85% tiêu diệt được 88,345%; CTS với DD = 75% tiêu diệt được 87,31% VSV tổng số[7]. Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan mạch ngắn, khối lượng phân tử thấp, độ deacetyl cao có hoạt tính sinh học cao hơn so với chitosan được sản xuất theo quy trình thông thường. Một trong số những tính chất đó là hoạt tính chống oxy hóa[1]. Một số tài liệu cho rằng độ deacetyl trong khoảng 55% – 70% gọi là mức độ deacetyl thấp, khoảng 70% – 80% gọi là mức độ deacetyl trung bình và 85% – 95% được gọi là mức độ deacetyl cao của chitosan[25]. Còn có tài liệu cho thấy độ deacetyl thấp nhất tương ứng với chitosan có độ deacetyl dao động từ 40% đến 60%. Phần lớn các mẫu chitosan thương mại có độ deacetyl trung bình từ 70% đến 90%. Đối với một số ứng dụng sinh học đặc biệt, chitosan có độ deacetyl cao trên 95% (Tolaimatea et al., 2003)[21]. Công thức cấu tạo của chitosan: Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitosan. Công thức phân tử: (C6H11O4N)n 6 1.1.1. Tính chất của chitosan. Độ deacetyl của chitosan Quá trình deacetyl là quá trình tách nhóm acetyl ra khỏi phân tử chitin. DD là thông số quan trọng, đặc trưng cho tỉ lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-Dglucopyranose với 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose trong phân tử chitin và chitosan. Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino[1]. Tính chất của chitosan như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang DNA… phụ thuộc rất lớn vào độ deacetyl hóa. Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại tốt hơn. Tương tự, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan cao hơn ở các mẫu chitosan có độ deacetyl cao. Cụ thể, khả năng kháng khuẩn tốt đối với chitosan có độ deacetyl trên 90%. Tuy nhiên, khả năng hút nước của chitosan thì giảm đi khi tăng độ deacetyl. Kết quả nghiên cứu của Trung và công sự (2006) cho thấy khả năng hút nước của chitosan có độ deacetyl hóa thấp (75%) đạt đến 659% cao hơn nhiều so với chitosan có độ deacetyl hóa cao chỉ đạt 486% (Bảng 1.1) Bảng 1.1. Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl (Trung và cộng sự, 2006) Chitosan với độ deacetyl khác nhau Tính chất 75% 87% 96% 111,2 ± 9,5 103,4 ± 7,9 107,3 ± 9,6 Tính thấm nước (%) 659 ± 33 472 ± 35 486 ± 29 Độ tan (%) 99,4 ± 0,1 99,6 ± 0,3 99,5 ± 0,2 Độ nhớt (cP) Phân tử lượng của chitosan 7 Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, nó quyết định tính chất của chitosan như khả năng tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Thông thường, phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng từ 100.000 dalton đến 1.200.000 dalton (Li và cộng sự, 1997). Phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin, điều kiện deacetyl và thường rất khó kiểm soát. Chitosan có phân tử lượng thấp thì thường có hoạt tính sinh học cao hơn, thường có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có phân tử lượng lớn có khả năng tạo màng tốt và màng chitosan tạo thành có sức căng tốt. Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng. Chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30 – 200 cps và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3000 – 4000 cps. Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, cường độ ion, pH, nhiệt độ[1]. Tính tan của chitosan Không giống như chitin chỉ tan trong một số ít hệ dung môi, chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic. pKa (hằng số phân ly) của chitosan có giá trị từ 6,2 đến 6,8. Khi hòa tan chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo dương. Đây là một điểm rất đặc biệt vì đa số các keo polysaccharite tự nhiên tích điện âm. Chitosan tích điện dương sẽ có khả năng bám dính bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại và tương tác tốt với các polymer tích điện âm. Chitosan có DD càng cao thì khả năng tan càng tốt. Một số dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan được trình bày ở Bảng 1.2. Chitosan không hòa tan trong nước, kiềm, cồn[1]. 8 Bảng 1.2. Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan Dung môi Nồng độ thường sử dụng (%) Acid acetic 1–2 Acid formi 1–2 Acid lactic 1–2 Acid propionic 1–2 Acid HCl 0,25 – 0,5 Acid citric 5 – 10 Acid glutamic 1–3 Acid ascorbic 1–2 Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của chitosan Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram dương và vi nấm. Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào DD và Mw. So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương ở vị trí C thứ ở pH nhỏ hơn 6. Chitosan có độ deacetyl cao trên 85% thì có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chitosan có Mw ≤ 2000 dalton thì khả năng ức chế vi sinh vật kém. Chitosan có Mw ≥ 9000 dalton thì có khả năng ức chế vi sinh vật cao (Jeon và cộng sự, 2000). Tuy nhiên, chitosan có phân tử lớn thì khả năng kháng khuẩn cũng thấp. Chitosan được hòa tan trong các dung môi hữu cơ như acid acetic, acid lactic và được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm. Chitosan có khả năng ức chế Staphylococus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula glutensis, Botrytis cinerea, Rhizopus 9 stolonifer, Aspergillus niger. Nồng độ ức chế của chitosan phụ thuộc vào loại chitosan, loài vi sinh vật, điều kiện áp dụng và thường sử dụng trong khoảng 0,0075% đến 1,5%. Ngoài ra, các dẫn xuất của chitosan cũng có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn tốt. N-carboxymethylchitosan ở nồng độ 0,1 – 5 mg/ml trong môi trường pH 5,4 làm giảm khả năng sinh độc tố aflatoxin của Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus (Shahidi và cộng sự, 1999)[1, 13]. Khả năng tạo màng của chitosan Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt. Tính chất cơ lý của màng chitosan như độ chịu kéo, độ rắn, độ ngấm nước, phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng và độ deacetyl hóa của chitosan[1]. Chitosan có độ deacetyl cao có ứng suất kéo và độ giãn dài giới hạn cao hơn màng chitosan độ deacetyl thấp, tuy nhiên chúng có độ trương nở thấp hơn (Phụ lục 1, Bảng 1). Các tính chất khác của chitosan: Ngoài các tính chất nêu trên, chitosan còn có khả năng chống oxy hóa. Khả năng chống oxy hóa của chitosan cũng phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan. Chitosan có độ nhớt thấp thì có khả năng chống oxy hóa cao. Hơn nữa, chitosan có thể gắn kết tốt với lipid, protein, các chất màu. Do chitosan không tan trong nước nên chitosan ổn định hơn trong môi trường nước so với các polymer tan trong nước như alginate, agar. Khả năng tạo phức, hấp phụ với lipid, protein và chất màu phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng, độ deacetyl hóa, độ rắn và độ tinh khiết của chitosan và thường biến động lớn với các mẫu chitosan (Bảng 1.5). Chitosan có độ deacetyl cao thường hấp phụ màu tốt. 10 Chitosan phản ứng với acid đậm đặc hình thành muối khó tan. Chitosan phản ứng với iod và các acid sulfuric cho phản ứng màu tím nên người ta dùng để phân tích định tính. 1.1.2. Ứng dụng của chitosan Trong nông nghiệp: Chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm chống lại sự tấn công của nấm gây hư hỏng hạt trong đất, đồng thời có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nảy mầm cho hạt. Ngoài ra, chitosan còn được sử dụng trong việc bảo quản kéo dài thời gian sử dụng của các sản phẩm sau thu hoạch từ nông nghiệp. Trong y dược: Chitosan được sử dụng làm chỉ tiêu tự hủy là do chitosan là một polymer hữu cơ có thời gian phân hủy nhanh hơn nhiều so với các hợp chất tổng hợp. Mặt khác, nó có tính kháng khuẩn không độc hại làm cho vết thương mau lành. Chitosan được sử dụng để tạo da nhân tạo chống nhiễm khuẩn và cầm máu. Chitosan có đặc tính làm giảm cholesterol. Theo một số nghiên cứu thì tác dụng hạ cholesterol của IMS (N,N,N-Trimethychitosan) là do có chứa phân tử N+(CH3)3 các nhóm này có khả năng kết hợp với gốc Cl- của acid béo và được đào thải khỏi cơ thể. Ngoài ra chitosan là một keo dương, có khả năng “bẫy” lượng mỡ và đào thải ra ngoài vì vậy đã có nhiều loại thuốc giảm béo với sự có mặt của chitosan đã có mặt trên thị trường. Trong công nghệ thực phẩm: chitosan là hợp chất polymer dương do đó nó có khả năng bắt các keo âm có trong dịch quả, bia, rượu vang, nước giải khát nên chúng được sử dụng như là một chất trợ lọc mang lại hiệu quả cao. Chitosan được sử dụng bảo quản thực phẩm tươi sống để thay thế một số chất bảo quản gây ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. Với tính ưu việt của 11 chitosan là kháng nấm, kháng khuẩn, chống mất nước trong quá trình bảo quản, không gây hại đối với người sử dụng. Năm 2001 trường Đại Học Nha Trang đã ứng dụng thành công việc sử dụng chitosan trong bảo quản thịt bò, kết quả kéo dài thời gian bảo quản và chất lượng thịt ít biến đổi. Năm 2004 trường Đại Học Nha Trang đã ứng dụng thành công chitosan trong bảo quản cá, kết quả kéo dài thời gian bảo quản và giữ được chất lượng của cá. Ngày nay các nhà công nghệ thực phẩm đã nghiên cứu và sản xuất màng chitosan trong đó có sự phối trộn chitosan, polyetylen và sorbitol tạo màng bền, dai, bóng, đẹp sử dụng để bao bọc sản phẩm như xúc xích. Màng này dễ bị phân hủy khi ta loại bỏ do đó giải quyết tốt vấn đề ô nhiễm môi trường. Mặt khác, chitosan có thể được sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm trong sản xuất giò chả để thay thế hàn the. Trong mỹ phẩm: Do chitosan có thể dễ dàng cố định trên lớp biểu bì của da nhờ các nhóm NH4, các nhóm này liên kết với tế bào sừng hóa của da. Nhờ vậy khoa học đã nghiên cứu sử dụng chitosan làm kem dưỡng da chống nắng bằng cách ngăn chặn tia cực tím. Chitosan là một polymer mang điện tích dương có thể kết hợp với protein của tóc nhờ độ keo của nó khi khô làm cho tóc cứng và giữ được nếp tóc. Trong lĩnh vực khác: Do cấu trúc tương tự cenllulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào trong quá trình sản xuất giấy, làm tăng độ bóng, bền, dai của giấy. 12 Ngoài ra, người ta còn sử dụng chitosan để thay thế tinh bột trong quá trình hồ hóa vải, kết quả làm tăng độ bền của sợi, tạo độ bóng đẹp, cố định hình in trên vải được rõ nét. Chitosan có DD trong khoảng 75 – 85%: thường được sử dụng để làm màng bao trong bảo quản thực phẩm. Nguyễn Thị Hằng Phương đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của độ deaectyl chitosan đến khả năng bảo quản na, tác giả cho rằng với chitosan có DD = 75%, nhúng na vào dung dịch chitosan 1% kết hợp bao gói bằng màng film PE (polyetylen) có độ dày 0,04 mm, bảo quản ở 10oC có thể làm chậm quá trình chín, giảm cường độ hô hấp và có thể kéo dài thời gian bảo quản đến 12 ngày[10]. Ứng dụng của chitosan có độ deacetyl cao: Chitosan có độ deacetyl cao thường được ứng dụng trong thực phẩm, y dược, sinh học, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chien và cộng sự (2006) bảo quản được các lát thanh long trong 7 ngày ở 8oC khi đã nhúng vào chitosan 1% (MW = 12,36 kDal, DD = 95 – 98%). Durango và cộng sự (2005) dùng chitosan 1,5% (MW = 48,5 kDal, DD = 88,76%) để đánh giá lượng vi sinh vật trên trên carrot cắt lát dày 5mm, bảo quản ở 10oC trong 15 ngày. Với nồng độ chitosan 1,5% đã ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn lactic và coliform tổng số - các vi khuẩn có liên quan đến sự hư hỏng của carrot trong thời gian bảo quản[16]. 1.2. Quy trình sản xuất chitosan Quá trình sản xuất chitosan từ chitin được thực hiện bởi công đoạn deacetyl (deacetylation), đây là quá trình tách nhóm acetyl khỏi phân tử chitin. Thông thường quá trình deacetyl được thực hiện bằng cách ngâm chitin trong dung dịch NaOH hoặc KOH đậm đặc. Nồng độ thường sử dụng từ 40 – 50%, ở nhiệt độ 100oC hoặc cao hơn. Công đoạn deacetyl được thực hiện ở các chế 13 độ rất đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin và yêu cầu về tính chất của chitosan[3, 23] (Phụ lục 1, Bảng 2). Quá trình deacetyl theo phản ứng sau: Hình 1.2. Quá trình Deacetyl. Một số quy trình sản xuất chitin-chitosan bằng phương pháp hóa học: Bảng 1.3. Mô tả một số quy trình deacetyl bằng phương pháp hóa học STT 1 2 3 Nồng độ NaOH 15M 50% 40% Thời gian (giờ) Nhiệt độ (oC) 1 150 120 Nhiệt độ phòng (26 – 29) 5 o 80 ± 2 C Độ deacetyl (%) Nguồn tài liệu >70% Yamashaki và Nakamichi (Nhật Bản) 80.22 Trần Thị Luyến và cộng sự (2004) 76.25 Trần Thị Luyến, ĐH Thủy Sản 14 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ deacetyl trong quá trình sản xuất chitosan Độ deacetyl của chitosan: là khả năng cắt mạch nhóm acetyl của chitin để tạo thành chitosan, sự cắt nhóm acetyl càng nhiều thì độ deacetyl càng lớn, hay nói cách khác độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng đặc trưng cho tỉ lệ giữa 2-acetamido-2-deoxy-Dglucopyranose với 2-amino-2deoxy-Dglucopyranose trong phân tử chitin và chitosan. Chitin có độ deacetyl thấp còn chitosan có độ deacetyl cao, tức là chứa nhiều nhóm amino[13]. Nhiệt độ của quá trình deacetyl: Nhiệt độ càng cao thì quá trình deacetyl diễn ra càng nhanh. Sản phẩm chitosan thu được có độ deacetyl cao. Tuy nhiên, nhiệt độ cao ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng của chitosan. Thời gian và nồng độ kiềm: Quá trình deacetyl diễn ra nhanh ở giai đoạn đầu. Theo Wu và Bough (1978), quá trình deacetyl đạt được 68% trong thời gian 1 giờ khi thực hiện deacetyl với nồng độ NaOH 50% ở nhiệt độ 100oC. Tuy nhiên, quá trình deacetyl diễn ra chậm lại, sau 5 giờ chitosan chỉ đạt được 78% DD. Kết quả của nghiên cứu này cũng cho thấy, sau 2 giờ xử lý độ deacetyl không thay đổi nhiều so với 1 giờ mà chỉ có phân tử lượng của chitosan xử lý sau 2 giờ giảm đáng kể, điều đó cho thấy, từ sau 1 giờ đến hết 2 giờ, chủ yếu diễn ra quá trình cắt mạch chitosan. Ngoài ra, nồng độ kiềm cũng ảnh hưởng đến chất lượng chitosan. Nếu nồng độ kiềm quá cao thì sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt và phân tử lượng của chitosan. Tuy nhiên, nếu nồng độ kiềm xử lý nhẹ dẫn đến sản phẩm chitosan sẽ không tan hoặc tan không hoàn toàn. Tỷ lệ giữa chitin và dung dịch kiềm: Tỷ lệ chitin: dung dịch NaOH thường dùng là 1:10, trong một số nghiên cứu sử dụng tỷ lệ 1:15. Ảnh hưởng của chất lượng chitin ban đầu: nếu chitin ban đầu không được chiết rút trong điều kiện phù hợp (ví dụ: xử lý tách khoáng ở nồng độ acid HCl quá cao, thời gian dài) thì chitin bị cắt mạch dẫn đến chitosan thu được có phân tử lượng và độ nhớt thấp. Kích thước của chitin ban đầu, kích thước hạt càng nhỏ 15 thì quá trình deacetyl hóa diễn ra nhanh và sản phẩm chitosan thu được có chất lượng cao hơn (độ nhớt, phân tử lượng, độ tan tốt hơn). Điều kiện môi trường xử lý: Để hạn chế sự cắt mạch chitin trong quá trình deacetyl hóa, người ta thực hiện công đoạn này trong môi trường khí nitơ để hạn chế sự tiếp xúc với oxy không khí. Kết quả nghiên cứu của Bough và cộng sự (1978) khẳng định deacetyl hóa trong môi trường khí nitơ thì tạo ra sản phẩm chitosan có phân tử lượng và độ nhớt cao hơn sản phẩm chitosan được deacetyl hóa trong môi trường không khí[21]. Quá trình deacetyl diễn ra chậm, đặc biệt ở nhiệt độ thấp, vì vậy muốn rút ngắn thời gian sản xuất thì công đoạn deacetyl nên thực hiện ở nhiệt độ cao. Độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu được phụ thuộc nhiều vào các yếu tố nồng độ NaOH sử dụng, nhiệt độ, thời gian xử lý và tỷ lệ. Nồng độ NaOH và nhiệt độ xử lý càng cao thì độ deacetyl đạt càng cao. Tuy nhiên, phân tử lượng của sản phẩm chitosan thu được sẽ thấp (Phụ lục 1, Bảng 3). Để đạt được độ deacetyl cao trên 90% thì một thì cần thực hiện quá trình deacetyl nhiều lần. Kết quả nghiên cứu của Trung và cộng sự (2006) cho thấy muốn chitosan thành phẩm đạt được độ deacetyl 96% khi sử dụng chitin từ phế liệu tôm thì cần phải thực hiện công đoạn deacetyl ở nhiệt độ 65oC và xử lý 2 lần (Phụ lục 1, Bảng 4). Thực hiện quá trình deacetyl một lần khó đạt được độ deacetyl cao trên 90% vì giai đoạn cuối của quá trình deacetyl thì tốc độ tách nhóm acetyl diễn ra rất chậm. Tuy nhiên, sau khi rửa sạch mẫu và tiếp tục deacetyl thì quá trình deacetyl diễn ra nhanh hơn và đạt được độ deacetyl cao. Tuy nhiên, cần phải lưu ý là chế độ deacetyl ảnh hưởng lớn đến phân tử lượng và độ nhớt của chitosan của sản phẩm chitosan, chế độ deacetyl càng cao (nồng độ NaOH cao, nhiệt độ cao, thời gian dài) thì chitosan thu được có phân tử lượng thấp (Phụ lục 1, Bảng 5). Do đó, để đạt được độ nhớt cao, phân tử lượng lớn thì thực hiện quá trình deacetyl ở chế độ phù hợp, không nên sử dụng nồng độ NaOH quá cao, nhiệt độ quá cao.