Tài liệu Nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá

  • Số trang: 125 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 126 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 27127 tài liệu

Mô tả:

i MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU ...............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC ............................................................3 1.1.1. Mực ống (squid)....................................................................................3 1.1.2. Mực nang (cutlefish) .............................................................................4 1.1.3. Mực tuộc (octopus) ...............................................................................5 1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME ......................................................................6 1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN....................... 11 1.3.1. Quá trình thủy phân............................................................................. 11 1.3.2. Các phương pháp thủy phân protein .................................................... 13 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme .. 15 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ ỨNG DỤNG..................................................................................... 18 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 24 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU ............................................................................... 24 2.1.1. Phế liệu mực ....................................................................................... 24 2.1.2. Ezyme Protease ................................................................................... 25 2.1.3. Cá kèo :............................................................................................... 25 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 26 2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu ................................................... 26 2.2.2. Phương pháp phân tích hóa học:.......................................................... 26 2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu............................................................... 29 2.2.4. Một số thiết bị sử dụng trong đề tài ..................................................... 39 2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu................................................................... 40 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................... 41 3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU MỰC TUỘC ...................... 41 ii 3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN CỦA PHẾ LIỆU MỰC ........................................................ 41 3.2.1. Xác định loại enzyme protease ............................................................ 41 3.2.2. Xác định tỷ lệ enzyme Alcalase .......................................................... 45 3.2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân ........................................ 49 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân ................................ 53 3.2.5. Xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân .................. 56 3.2.6. Xác định tỷ lệ ẩm cho quá trình thủy phân .......................................... 58 3.2.7. Xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung làm chất phòng thối cho quá trình thủy phân ....................................................................................... 62 3.3. THỬ NGHIỆM DÙNG DỊCH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU MỰC LÀM THỨC ĂN BỔ SUNG CHO CÁ....................................................................... 67 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ................................................................... 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 72 iii DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN TÊN BẢNG Trang Bảng 2.1. Điều kiện làm việc của Neutrase, Alcalase và Protamex..........................25 Bảng 2.2. Giá trị các hằng số , ß, htotal, của protein từ các vật liệu khác nhau (Adler-Nissen 1986, trích từ P.M. Nielsen và cộng sự, 2001) .........................28 Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của mực (%) ......................................................41 Bảng 3.2. Thành phần hóa học của phế liệu mực (%) ............................................41 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của loại enzyme tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian của các mẫu thủy phân . ...................................................................42 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian của các mẫu thủy phân . ...................................................46 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian của các mẫu thủy phân ...................................................................................50 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian của các mẫu thủy phân . ..........................................................................54 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian của các mẫu thủy phân . ..........................................................................59 Bảng 3.8. Kết quả phân tích cảm quan, DH (%) và hàm lượng Naa, NNH3 của dịch thủy phân dưới ảnh hưởng của NaCl và sorbitol bổ sung. .......................63 Bảng 3.9. Kết quả phân tích cảm quan, DH (%) và hàm lượng Naa, NNH3 của dịch thủy phân phế liệu mực theo thời gian. ...................................................67 iv DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN TÊN HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1. Mực ống Trung Hoa................................................................................. 4 Hình 1.2. Mực nang vân hổ ..................................................................................... 5 Hình 1.3. Mực tuộc.................................................................................................. 5 Hình 1.4. Biểu đồ xuất khẫu mực tuộc năm 2000-2004 ........................................... 6 Hình 2.1. Mực tuộc.................................................................................................24 Hình 2.2. Phế liệu mực tuộc thu gom từ xí nghiệp chế biến ....................................24 Hình 2.3. Cá kèo.....................................................................................................25 Hình 2.4. Bể nuôi thử nghiệm cá kèo......................................................................25 Hình 2.5. Phản ứng tạo phức của thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm amino (H2N-R) ...............................................................................................27 Hình 2.6. Qui trình thủy phân phế liệu mực ............................................................29 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân.........................................................................................30 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho quá trình thủy phân.........................................................................................31 Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân........................................................................................................32 Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân ...............................................................................................33 Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân ...............................................................................................34 Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình thủy phân........................................................................................................35 Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung thích hợp cho quá trình thủy phân...................................................................36 v Hình 2.14. Qui trình nuôi thử nghiệm cá kèo bằng các dịch thủy phân phế liệu mực ................................................................................................................37 Hình 2.15. Thiết bị xác định protein theo phương pháp Kejldahn ...........................39 Hình 2.16. Máy so màu UV/VIS............................................................................39 Hình 2.17. Thiết bị điện di......................................................................................39 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân................................................43 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến hàm lượng Naa theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................................43 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến hàm lượng NNH3 theo thời gian của các mẫu thủy phân ....................................................44 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân .......................................47 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm lượng Naa theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................47 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm lượng NNH3 theo thời gian của các mẫu thủy phân ..........................................48 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................51 Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Naa theo thời gian của các mẫu thủy phân ...................................................................................51 Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng NNH3 theo thời gian của các mẫu thủy phân............................................................................52 Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................................55 Hình 3.11. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Naa theo thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................55 Hình 3.12. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng NNH3 theo thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................56 vi Hình 3.13. Đồ thị mặt đáp ứng DH (%) theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân ....57 Hình 3.14. Đồ thị đường mức DH (%) theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân ......57 Hình 3.15. Đồ thị mặt đáp ứng Naa theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân............58 Hình 3.16. Đồ thị đường mức Naa theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân .............58 Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến độ thủy phân (DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân .............................................................60 Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến hàm lượng Naa theo thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................60 Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến hàm lượng NNH3 theo thời gian của các mẫu thủy phân.....................................................................61 Hình 3.20. Đồ thị mặt đáp ứng DH(%) theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân ...............................................................................................................64 Hình 3.21. Đồ thị đường mức DH (%) theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân ...............................................................................................................64 Hình 3.22. Đồ thị mặt đáp ứng Naa theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân .........64 Hình 3.23. Đồ thị đường mức Naa theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân...........65 Hình 3.24. Đồ thị mặt đáp ứng NNH3 theo NaCl và sorbitol tại thời điểm 6 giờ thủy phân........................................................................................................65 Hình 3.25. Đồ thị đường mức NNH3 theo NaCl và sorbitol tại thời điểm 6 giờ thủy phân........................................................................................................65 Hình 3.26: Dịch phế liệu mực sau 6 giờ thủy phân (mẫu 7) ....................................66 Hình 3.27: Phổ điện di của phế liệu mực theo thời gian thủy phân..........................68 Hình 3.28: Biểu đồ tổng lượng thức ăn (viên) cá kèo sử dụng ở 30 phút đầu cho ăn của các bể trong thời gian 10 ngày thí nghiệm ...........................................69 Hình 3.29: Biểu đồ khối lượng tăng trung bình hằng ngày của cá kèo ở các bể trong thời gian 10 ngày thí nghiệm .................................................................69 vii DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Kí hiệu viết tắt Diễn giải DH : Độ thủy phân DTP : Dịch thủy phân ĐC : Đối chứng Naa : Nitơ acid amin NF : Nitơ foocmol NNH3 : Nitơ amoniac NTS : Nitơ tổng số pHopt : pH tối thích pHth : pH thích hợp topt : Nhiệt độ tối thích tth : Nhiệt độ thích hợp TLK : Trọng lượng chất khô 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngành chế biến thủy sản được coi là ngành mũi nhọn và được xem là nhiệm vụ chiến lược của nước ta. Theo Tổng cục Thống kê, năm 2009 kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt khoảng 4,2 tỷ USD, đó là nguồn ngoại tệ đáng kể trong ngân sách nhà nước. Các mặt hàng xuất khẩu rất đa dạng, bao gồm các mặt hàng đông lạnh, đồ hộp, các mặt hàng chế biến khô,…Các đối tượng dùng sản xuất thường là các loài tôm, cá, mực,… Bên cạnh các mặt hàng xuất khẩu có giá trị lớn như tôm và cá thì mực cũng là một trong những sản phẩm có đóng góp rất lớn cho sức tăng trưởng xuất khẩu chung của thủy sản Việt Nam trong nhiều năm qua (Vasep). Các mặt hàng chế biến của mực phần lớn dưới dạng đông lạnh Block, IQF, semi-IQF, đông lạnh khay hoặc đóng gói hút chân không. Hình thức các sản phẩm chế biến như phi lê, cắt miếng, tỉa hoa, chế biến sẵn để nấu hoặc dưới dạng sản phẩm sushi, sashimi để ăn gỏi, tẩm bột hay các sản phẩm phối chế khác. Cùng với sự gia tăng của khối lượng mực xuất khẩu, lượng phế liệu từ mực cũng tăng lên dẫn đến sự tồn tại nhiều vấn đề như làm tăng chi phí xử lý nước thải, làm tăng ô nhiễm môi trường. Lượng phế liệu mực thải ra từ các qui trình sản xuất mực là rất lớn, chiếm khoảng 40% nguyên liệu. Hàm lượng protein trong phế liệu mực chiếm từ 72-77% trong thành phần chất khô [46]. Theo theo Takaoka, 1995 và Meyers, 1989 (trích từ P. Z. Lian, 2005) [46] trong thành phần protein của mực có chứa betain, các acid amin tự do và khoảng 1,5% các peppid có trọng lượng phân tử thấp là các chất gây kích thích bắt mồi cho tôm. Theo Jobling, 1998 hàm lượng protein trong phế liệu mực đủ cao cho quá trình thủy phân tạo ra các peptid và các acid amin, nó có chứa hầu hết các acid amin cần thiết cho sự phát triển và tăng tỷ lệ sống của cá nuôi. Nhưng nhìn chung hiện nay ở nước ta phế liệu mực là đối tượng chưa được tận dụng tốt. Đó là do phế liệu mực (bao gồm da và nội tạng…) khó phơi khô và nhanh ôi thối, dẫn đến phế liệu mực làm khô (dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi) thu được có chất lượng không cao. Vì vậy, nếu chúng ta đem thủy phân lượng phế liệu này để thu hồi nguồn chất dinh dưỡng sau đó bổ sung vào thức ăn cho vật 2 nuôi thì sẽ nâng cao được giá trị của nguyên liệu trong qui trình sản xuất mực và còn có tác dụng giảm tải rất lớn cho quá trình xử lý nước thải, hạn chế sự ô nhiễm môi trường. Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng Enzyme Protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá” là một hướng nghiên cứu cần thiết. Ý nghĩa khoa học: Là tìm ra chế độ thủy phân thích hợp phế liệu mực làm nền tảng cho việc nghiên cứu ở qui mô pilot và sản xuất công nghiệp sau này. Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần vào việc xây dựng công nghiệp tận dụng các phế liệu mực mang lại giá trị gia tăng cho ngành thủy sản, sử dụng nguồn nguyên liệu hiệu quả hơn, tạo ra mặt hàng mới, giảm ô nhiễm môi trường… 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC Mực thuộc ngành động vật thân mềm (Mollusca), bao gồm các loài mực ống, mực nang, mực tuộc là nguồn lợi hải sản xuất khẩu rất quan trọng của Việt Nam sau tôm và cá. Nhuyễn thể chân đầu phân bố khắp các vùng biển của Việt Nam, bao gồm vùng Vịnh Bắc bộ, vùng biển miền Trung và vùng biển Đông, Tây Nam bộ. Trong đó, một số loài có vùng phân bố hẹp trong phạm vi một, hai vùng biển, song cũng có những loài có mặt ở khắp các vùng biển. Những loài phổ biến và có giá trị kinh tế cao nhất là mực nang vân hổ (Sepia pharaonis) mực nang mắt cáo (S.lycidas), mực nang lửa (S.latimanus), mực nang vàng (S. esculenta), mực lá (Sepioteuthis lessoniana), mực ống Đài Loan (Loligo chinensis), mực thẻ (L. edulis), mực tuộc (Octopus dollfusi), mực tuộc Ôxen (Octopus ocellatus), mực tuộc đốm trắng (O. vulgaris) [61]. Sản lượng nhuyễn thể chân đầu đã xuất khẩu hàng năm đạt khoảng 50.00060.000 tấn, trị giá khoảng 150 triệu USD. Theo Viện Nghiên cứu Hải sản, 10 tháng đầu năm 2007, xuất khẩu mực và bạch tuộc đạt trên 67,7 nghìn tấn, trị giá 231 triệu USD, tăng 21% về khối lượng và 31% về giá trị so với cùng kỳ năm 2006, chiếm 7,7% tổng giá trị XKTS của nước ta [60]. 1.1.1. Mực ống (squid) Theo số liệu điều tra mới nhất, ở vùng biển Việt Nam có tới 25 loài mực ống (mực lá), thuộc bộ Teuthoidea. Đa số mực ống sống ở độ sâu <100m nước, tập trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50m. Ngoài ra còn có một số loài thường sống ở các vùng biển khơi với độ sâu >100m nước. Trong các tháng mùa khô (tháng 12-tháng 3 năm sau), mực ống di chuyển đến các vùng nước nông hơn, ở độ sâu <30m. Trong các tháng mùa mưa (tháng 6-9), mực ống di chuyển đến các vùng nước sâu 30-50m. 4 Hình 1.1. Mực ống Trung Hoa Theo số liệu điều tra mới nhất, ở vùng biển Việt Nam có tới 25 loài mực ống (mực lá), thuộc bộ Teuthoidea. Đa số mực ống sống ở độ sâu <100m nước, tập trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50m. Ngoài ra còn có một số loài thường sống ở các vùng biển khơi với độ sâu >100m nước. Trong các tháng mùa khô (tháng 12-tháng 3 năm sau), mực ống di chuyển đến các vùng nước nông hơn, ở độ sâu <30m. Trong các tháng mùa mưa (tháng 6-9), mực ống di chuyển đến các vùng nước sâu 30-50m. Sản lượng khai thác mực ống trên toàn vùng biển Việt nam hằng năm khoảng 24.000 tấn, trong đó vùng biển miền Nam có sản lượng cao nhất là khoảng trên 16.000 tấn (chiếm 70%), vịnh Bắc Bộ chiếm sản lượng lớn thứ nhì, khoảng 5000 tấn (20%), còn biển miền Trung có sản lượng thấp nhất khoảng 2.500 tấn (10%) [62]. 1.1.2. Mực nang (cutlefish) Đã xác định được 15 loài mực nang thuộc lớp phụ Coleoidea, bộ Sepiodea họ Sepiidea ở vùng biển Việt Nam. Nhìn chung, các loài mực nang đều sống tập trung chủ yếu ở các vùng nước sâu khoảng 50m-200m. Đến mùa xuân (tháng 1,2,3) chúng thường di cư vào gần bờ để đẻ trứng. Do đó, chúng đã trở thành sản phẩm khai thác truyên thống lâu đời của người dân Việt Nam ở ven bờ. Tuy nhiên, việc 5 mở rộng khai thác xa bờ đã và đang giúp cho nghề khai thác mực của Việt nam có nhiều triển vọng tăng sản lượng. Hình 1.2. Mực nang vân hổ Mực nang là thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ chế biến và được làm thành nhiều món ăn ngon, vừa mang tính nghệ thuật vừa có giá trị xuất khẩu cao trên thị trường quốc tế. Sản lượng khai thác mực nang hằng năm của Việt Nam khoảng 26.000 tấn, phần lớn ở vùng biển Nam Bộ đạt khoảng 20.000 tấn, chiếm khoảng 76% tổng sản lượng mực nang. Miền Trung chiếm sản lượng khoảng 5.000 tấn (21%) và miền Bắc khoảng 1.000 tấn (3 %) [63]. 1.1.3. Mực tuộc (octopus) Hình 1.3. Mực tuộc 6 Hiện nay đã xác định được 17 loài mực tuộc, như: Mực tuộc (Octopus dollfusi), bạch tuộc Ôxen (Octopus ocellatus), mực tuộc đốm trắng (Octopus vulgaris), … thuộc bộ Octopoda với hai bộ phụ là Incirrata & Cirrata và 3 họ là Octodidae gồm 12 loài , họ Argonauthidae gồm 4 loài và 1 loài thuộc họ Opisthoteuthidae. Thị trường xuất khẩu mực tuộc của Việt Nam mở rộng hơn qua các năm. Hiện nay các mặt hàng mực tuộc của Việt Nam đã xuất sang 25 thị trường. Theo số liệu thống kê xuất khẩu năm 2004, thị trường Nhật Bản chiếm giá trị xuất khẩu lớn nhất (41%), tiếp theo lần lượt thứ tự là các thị trường Hàn Quốc (35,6%), Italia (6,9%), Trung Quốc (3,6%), Tây Ban Nha (3,6%), Ôxtrâylia (2,5%) và Mỹ (1,8%) [59]. Nguồn: http://opac.lrc.ctu.edu.vn/pdoc/61/muctuoc.pdf Hình 1.4. Biểu đồ xuất khẫu mực tuộc năm 2000-2004 1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME Trong sự phát triển của hóa sinh học, bước nhảy vọt đã đạt được khi người ta thực hiện thành công việc tách chiết các chất xúc tác sinh học ra khỏi tế bào và nghiên cứu tính chất của chúng, lúc đó người ta nhận biết rằng enzyme có bản chất 7 protein. Năm 1926, Sumner là người đầu tiên thu được urease ở dạng kết tinh. Cho đến nay đã có khoảng hơn 150 enzyme được rút ra ở dạng tinh khiết. Trong số các enzyme đó, một số đã được biết trọn vẹn về cấu trúc bậc I như ribonuclease, trypsin, chymotrypsin, … Enzyme, cũng như những protein khác, có trọng lượng phân tử khoảng 12.000 đến hơn 1000.000. Một số enzyme cấu tạo gồm toàn những phân tử L amino acid liên kết với nhau tạo thành, gọi là enzyme một thành phần. Đa số enzyme là những protein phức tạp gọi là enzyme hai thành phần. Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme. Khi đặt vấn đề nghiên cứu về cơ chế xúc tác của enzyme người ta xuất phát từ giả thiết cho rằng trong các phản ứng được enzyme xúc tác, phức tạm thời “Enzyme – Cơ chất” được tạo thành. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: E- + S+ ES P + E Trong đó: E: Enzyme S: Cơ chất ES: Phức hợp của enzyme-cơ chất P: Sản phẩm - Ở giai đoạn 1 phản ứng xảy ra tương đối nhanh cơ chất được liên kết với enzyme nhờ các liên kết yếu. Giai đoạn này có sự hình thành phức hợp trung gian ES, sự tạo thành phức hợp này có thể theo hai kiểu sau: + Kiểu cơ chế thứ nhất: Là kiểu hình thành đơn giản, tâm ái nhân (–) của enzyme tương tác nhanh với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết nhị dương (dipositive bond). Sau khi tương tác sẽ làm thay đổi mật độ electron (e) và làm suy yếu liên kết nhị dương tạo điều kiện cắt đứt liên kết. Các nhà nghiên cứu cho rằng kiểu cơ chế này xảy ra khi tâm ái nhân của enzyme mạnh và sự khuyết điện tử của liên kết nhị dương lớn [17]. + Kiểu cơ chế thứ hai: Lúc đầu các nguyên tử khuyết điện tử trong liên kết nhị dương chưa thể đính trực tiếp vào tâm ái nhân của trung tâm hoạt động của 8 enzyme mà cơ chất gắn vào tâm ái nhân bằng một phản ứng hóa học nào đó giữa tâm ái nhân ở trung tâm hoạt động enzyme với một nhóm hóa học ở vị trí gần kề với liên kết nhị dương trong cơ chất. Dưới ảnh hưởng của trung tâm hoạt động của enzyme sẽ dần dần làm tăng mức độ khuyết điện tử vốn đã tồn tại trước đó, bằng cách tạo liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí gần gũi với liên kết nhị dương. Nhờ vậy, làm cho sự phân bố điện tử trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo chiều hướng cần thiết, khiến cho liên kết nhị dương được tăng cường và có thể tương tác với các tác nhân ái nhân của trung tâm hoạt động của enzyme và tiến hành làm yếu liên kết và tiến đến liên kết bị thuỷ phân khi có yếu tố nước tham gia [17]. - Ở giai đoạn 2 xảy ra sự biến đổi của cơ chất (S) có liên quan tới việc phá vỡ hay hình thành các liên kết cộng hóa trị. Ở giai đoạn này, cơ chất được hoạt hóa (một hoặc vài phức chất ES chuyển tiếp được hoạt hóa). Ở đây, cấu trúc bậc 3 của enzyme luôn biến đổi tạo khả năng tiếp xúc giữa các nhóm hoạt động của enzyme với cơ chất đang biến đổi. Enzyme đã làm biến đổi phần tử cơ chất làm cho các liên kết bên trong phân tử trở nên “lỏng lẻo” hơn, do đó chỉ cần một lượng năng lượng nhỏ cũng đủ làm cho cơ chất biến thành các sản phẩm (P) khác nhau. Người ta đã chứng minh rằng trong khi hình thành phức chất ES có 2 quá trình đồng thời xảy ra nhanh chóng đó là: + Sự thay đổi mật độ điện tử gây nên sự phân cực hóa các liên kết. + Sự biến dạng về mặt hóa học của các liên kết “kéo căng” trong phân tử cơ chất. Cả hai yếu tố này (biến hình và phân cực hóa các liên kết đồng hóa trị) đều làm tăng thế năng nhiệt động của các liên kết này, nghĩa là xúc tiến việc vượt qua “hàng rào” năng lượng hoạt hóa của quá trình chuyển tiếp phức “Enzyme-Cơ chất”. - Giai đoạn cuối tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do. Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước. 9 Nguồn thu nhận enzyme Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống. Việc điều chế chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và đầy tốn kém nếu không muốn nói là điều không tưởng, nên người ta thường thu nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng. Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một loại tế bào cũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme khác. Đối với tế bào vi sinh vật, lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát triển của sinh vật và tùy theo loài nên chúng ta phải chọn nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme. Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản: Các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật. - Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tuỵ, màng nhầy dạ dày, tim... dùng để tách enzyme rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng có chứa amylase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác. Ví dụ như từ ngăn tư của dạ dày bê nghé người ta có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Trong động vật thủy sản, thường gặp một số enzyme protease quan trọng như: + Pepsin: Pepsin là enzyme do màng nhầy dạ dày tiết ra, phân tử lượng của Pepsin 4200, điểm đẳng điện ở pH = 3,7. Tùy vào mỗi loài thủy sản mà Pepsin của chúng có pH và nhiệt độ thích hợp khác nhau, pHopt = 1,6 - 3,8; topt = 31 – 550C [5]. + Trysin: Loại enzyme này ở trong dịch tụy tạng, trong ruột non, gan…Tác dụng tự phân giải trong tổ chức cơ thịt hầu như chủ yếu là do loại này. Trysin là loại protein tính kiềm, phân tử lượng khoảng 23.800, điểm đẳng điện ở pH = 10,5. Đa số Trysin hoạt động ở pH tối ưu là 8, khả năng tác dụng của Trysin khá mạnh với các loại protit, với các phân tử thấp không chỉ ở mối liên kết peptid mà còn cả mối liên 10 kết amit và cả liên kết este. Nhiệt độ thích hợp của trysin cá minh thái và cá tuyết là 38 – 500C và pH = 6,4 – 8,2 [5]. + Peptidase, Ereptase (Erepsin) và các loại khác: Khả năng tác dụng cũng như tính đặc hiệu của các enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm kề bên liên kết peptid. Qua thí nghiệm cho thấy Ereptase có hoạt lực rất mạnh, điều kiện làm việc của mực nang là pH = 6,1; của carboxypolypeptidase pH = 5,5; của dipeptidase là pH = 8,2; của cathepsin trong mực tuộc là pH = 4,7; của aminopolypeptidase là pH = 8,2 [5]. - Ở thực vật, thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt, củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy. Ví dụ trong hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu tương có nhiều enzyme Urease. Trong thóc nảy mầm chứa nhiều  - amylase, ở củ khoai lang lại có nhiều  – Amylase. Papain thu được từ mẫu nhựa đu đủ xanh, Bromelain thu được từ các bộ phận (lá, thân, quả) cây dứa, còn ficin được tách từ dịch ép thân và lá cây Ficus [7]. - Đối với vi sinh vật, đây là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme và cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, tốc độ sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn. Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực vật không tổng hợp được. Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác đồng thời vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo những chủng đột biến cho ta hàm lượng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Đối với enzyme protease từ vi sinh vật, nguồn thu nhận chủ yếu là từ vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men [7]. 11 Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. mesentericus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất [7]. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus và một số giống thuộc chi Clostridium. Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát. Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus... 1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN 1.3.1. Quá trình thủy phân Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương (dipositive bond) trong hợp chất hữu cơ thành các thành phần đơn giản dưới tác dụng của các chất xúc tác và có sự tham gia của yếu tố nước trong phản ứng [17]. 12 Cơ chất của quá trình thủy phân là tập hợp những hợp chất cao phân tử và chứa đựng liên kết nhị dương như: tinh bột, protein, xenluloza, pectin, glucoza và một số hợp chất hữu cơ như lipit, ATP,…các chất này thường là các thành phần cấu tạo của nguyên liệu. Sơ đồ quá trình thủy phân protein: Xúc tác Protein Xúc tác Polypeptid Xúc tác Peptid Acid amin Quá trình thủy phân protein là quá trình phân cắt mạch peptid tại các liên kết peptid qua các dạng trung gian như pepton, polypeptid, peptid và cuối cùng là acid amin theo phản ứng sau: H R2 Xúc tác … – NH – CH – C+ – N+ – CH – C – … + R1 O– H2O O R2 … – NH – CH – C – OH R1 O + NH2 – CH – C – … O Như vậy sản phẩm thủy phân của protein là bao gồm các pepton, polypeptid, peptid và các acid amin. Trong hầu hết các acid amin thu nhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng L-α amino acid. Vị của acid amin phụ thuộc vào cấu trúc không gian, Dạng L có vị đắng, dạng D có vị ngọt, còn acid amin có gốc R mạch vòng có cả vị đắng và vị ngọt. Cường độ vị phụ thuộc vào giá trị “ngưỡng nồng độ”, là nồng độ thấp nhất để có thể cảm nhận sự có mặt của acid amin. Ngưỡng này lại phụ thuộc vào tính kỵ nước của gốc R trong phân tử acid amin. L-tryptophan và L-tyrosine có vị đắng nhất. Acid Lglutamit acid ở nồng độ cao có vị ngọt của thịt, ở nồng độ thấp là chất tăng vị cho sản phẩm thực phẩm [1]. 13 Đối với dipeptid ngoại trừ dipeptid của acid aspartic có vị ngọt, các dipeptid còn lại có vị đắng hoặc vị trung dung [1]. Sự thủy phân có thúc đẩy thường giải phóng ra các peptid kỵ nước có dính các gốc lơxin hoặc phenylalanin ở cuối nên có vị đắng [27]. Vị của peptid không phụ thuộc cấu hình không gian L hoặc D như acid amin. Cường độ vị cũng phụ thuộc vào tính kỵ nước của các gốc R mà không phụ thuộc vào trình tự của acid amin [1]. 1.3.2. Các phương pháp thủy phân protein * Thủy phân bằng acid Trong sản xuất thường dùng HCl ngoài ra có thể dùng H2SO4. Acid phân ly càng mạnh thì phản ứng thủy phân xảy ra càng nhanh. Acid clohydric (HCl) có hoạt độ lớn nhất nên được sử dụng phổ biến nhất, ngoài ra sau khi thủy phân phản ứng trung hoà tạo thành NaCl có lợi cho sản phẩm thực phẩm. Phương pháp này là dùng acid HCL 6N dư thừa ở nhiệt độ 100-120oC trong khoảng 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin tự do dưới dạng hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá huỷ một phần, tryptophan bị phá huỷ hoàn toàn, glutamine và asparagine phân ly thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+. * Thuỷ phân bằng kiềm Người ta cũng có thể thu nhận các amino acid bằng phương pháp thuỷ phân với NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các amino acid nhưng đều bị racemic hóa, các amino acid cysteine, serine và treonine bị phá huỷ nhưng tryptophan không bị phá huỷ. Vì vậy, phương pháp thuỷ phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan. * Thuỷ phân bằng enzyme Để thu nhận chế phẩm acid amin ngày nay việc thuỷ phân bằng enzyme protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau bởi sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm là không có sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc hiệu cao, thủy phân trong điều kiện nhiệt độ thấp nên ít ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, ít tốn năng lượng.
- Xem thêm -