Tài liệu Nghiên cứu phương pháp xác định một số nitrosamin trong thịt nướng bằng sắc ký khí khối phổ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KHÁNH VY NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NITROSAMIN TRONG THỊT NƯỚNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KHÁNH VY MÃ SINH VIÊN: 1301482 NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NITROSAMINE TRONG THỊT NƯỚNG BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Trần Cao Sơn 2. TS. Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Trần Cao Sơn và TS. Đặng Thị Ngọc Lan đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, góp ý và giúp đỡ em thực hiện khóa luận này. Em xin gửi lời cám ơn tới ThS. Bùi Cao Tiến đã nhiệt tình hướng dẫn em trong quá trình hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích, trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thức cần thiết, quan trọng và bổ ích. Đồng thời, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS. Trần Cao Sơn và các cán bộ khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp e hoàn thành đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn ở bên quan tâm, động viên em trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực hiện đề tài, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn sinh viên. Em xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2018 Sinh viên Trần Khánh Vy i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ................................................................. vii ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................2 1.1. Giới thiệu về nitrosamin ....................................................................................2 1.1.1. Công thức cấu tạo của nitrosamin............................................................2 1.1.2. Sự tạo thành nitrosamin ...........................................................................2 1.1.3. Tính chất hóa lý của nitrosamin ...............................................................3 1.1.4. Độc tính....................................................................................................3 1.1.5. Nitrosamin trong thực phẩm ....................................................................4 1.1.6. Quy định hiện hành về nitrosamin ...........................................................4 1.2. Phương pháp xác định các nitrosamin trong thực phẩm ....................................5 1.2.1. Phương pháp xử lý mẫu ...........................................................................5 1.2.1.1. Chưng cất .............................................................................................5 1.2.1.2. Chiết lỏng – lỏng ..................................................................................6 1.2.1.3. Vi chiết pha rắn (SPME) ......................................................................6 1.2.1.4. Chiết pha rắn (SPE) ..............................................................................7 1.2.1.5. Kỹ thuật QuEChERS ...........................................................................7 1.2.2. Phương pháp phân tích ............................................................................8 1.2.2.1. Sắc ký lỏng ...........................................................................................9 1.2.2.2. Sắc ký khí .............................................................................................9 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......12 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................12 ii 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................12 2.2.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt nướng ........................................................................................12 2.2.1.1. Khảo sát các điều kiện xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS .........12 2.2.1.2. Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu ......................................................12 2.2.2. Thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong các sản phẩm thịt nướng ........................................................................................12 2.2.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng trên địa bàn Hà Nội ................................................................................................13 2.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ...............................................................................13 2.3.1. Thiết bị ...................................................................................................13 2.3.2. Dụng cụ ..................................................................................................13 2.3.3. Hóa chất, chất chuẩn ..............................................................................13 2.3.4. Pha dung dịch chuẩn ..............................................................................14 2.3.4.1. Dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrosamin 10 µg/mL và 1 µg/mL ...........14 2.3.4.2. Dung dịch nội chuẩn gốc 1000 µg/mL ..............................................14 2.3.4.3. Dung dịch nội chuẩn 10 µg/mL và 1 µg/mL .....................................14 2.3.4.4. Dung dịch chuẩn làm việc ..................................................................14 2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................15 2.4.1. Quy trình xử lý mẫu ...............................................................................15 2.4.2. Phương pháp phân tích bằng GC-MS/MS .............................................17 2.4.3. Phương pháp thẩm định .........................................................................17 2.4.3.1. Tính chọn lọc......................................................................................17 2.4.3.2. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) .................17 2.4.3.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ...................................................17 2.4.3.4. Độ lặp lại và độ thu hồi ......................................................................18 2.4.4. Phương pháp xử lý kết quả ....................................................................18 iii 2.4.5. Phương pháp lấy mẫu ............................................................................18 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................19 3.1. Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong thịt nướng .........................................................................................................................19 3.1.1. Khảo sát điều kiện GC-MS/MS .............................................................19 3.1.1.1. Điều kiện MS/MS ..............................................................................19 3.1.1.2. Điều kiện GC......................................................................................20 3.1.2. Xây dựng quy trình xử lý mẫu ...............................................................22 3.1.2.2. Khảo sát phương pháp chiết ...............................................................24 3.1.2.3. Khảo sát thời gian chiết......................................................................25 3.1.2.4. Khảo sát bột làm sạch ........................................................................26 3.1.2.5. Khảo sát khối lượng bột làm sạch ......................................................26 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng nền ........................................................................28 3.2. Thẩm định phương pháp ..................................................................................29 3.2.1. Tính chọn lọc .........................................................................................29 3.2.1.1. Tính số điểm Index Period .................................................................29 3.2.1.2. Tỷ lệ ion .............................................................................................29 3.2.1.3. Phân tích mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn ........................30 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ....................31 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ....................................................32 Độ lặp lại và độ thu hồi ..........................................................................34 3.3. Sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng trên địa bàn Hà Nội ...........................................................................................................37 3.4. Bàn luận ...........................................................................................................38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................1 PHỤ LỤC ........................................................................................................................5 iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ACN AOAC Giải nghĩa Acetonitril Association of Official Analytical Communities (Hiệp hội các cộng đồng phân tích chính thức) CE Collision energy (Năng lượng va chạm) CI Chemical ionization (Ion hóa hóa học) DCM Dichloromethan d-SPE Dispersive solid phase extraction (Chiết pha rắn phân tán) EI GC-MS/MS LC-MS/MS Electron impact (va chạm electron) Gas chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký khí khối phổ hai lần) Liquid chromatography tandem mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối phổ hai lần) LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of Qualification (Giới hạn định lượng) ME Matrix effect (Ảnh hưởng nền) NDMA N-Nitroso dimethyl amine NDPA N-Nitroso dipropyl amine NDPhA N-nitroso diphenyl amine IP PSA QuEChERS Identification point (Điểm nhận dạng) Primary secondary amine (amin bậc 1 2) Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe (Nhanh, dễ, rẻ, hiệu quả, ổn định, an toàn) SPE Solid phase extraction (Chiết pha rắn) TEA Thermal energy analyser (Bộ phân tích năng lượng nhiệt) v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số nitrosamin thường gặp ...................................................................... 2 Bảng 1.2. Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin ............................................. 4 Bảng 1.3. Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống ............................. 5 Bảng 1.4. So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS .... 8 Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS……...11 Bảng 2.1. Các nitrosamin được sử dụng trong nghiên cứu………………………….12 Bảng 2.2. Pha dung dịch chuẩn làm việc…………………………………………….15 Bảng 3.1. Các điều kiện MS/MS phân tích nitrosamin ................................................. 19 Bảng 3.2. Chương trình nhiệt độ xác định nitrosamin .................................................. 21 Bảng 3.3. Tỷ lệ ion và sai số cho phép .......................................................................... 29 Bảng 3.4. Khoảng làm việc và độ chệch ....................................................................... 34 Bảng 3.5. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDMA ............................................................. 34 Bảng 3.6. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPA .............................................................. 34 Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi của NDPhA ............................................................ 36 Bảng 3.8. So sánh độ lặp lại của phương pháp với tiêu chuẩn AOAC ......................... 36 Bảng 3.9. So sánh độ thu hồi của phương pháp với tiêu chuẩn AOAC ........................ 37 Bảng 3.10. Kết quả phân tích mẫu thực tế .................................................................... 37 Bảng 3.11. Tóm tắt kết quả phân tích mẫu thực ............................................................ 39 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của nitrosamin ...................................................... 2 Hình 2.1. Quy trình chiết mẫu dự kiến .......................................................................... 16 Hình 3.1. Sắc ký đồ khi phân tích nitrosamin với cột DB5-MS và cột DB1701 .......... 20 Hình 3.2. Sắc ký đồ tổng ion (TIC) của các nitrosamin nghiên cứu ............................. 21 Hình 3.3. Sắc ký đồ các nitrosamin trong dung môi ACN và ACN:DCM (1:1/v:v) .... 22 Hình 3.4. Tóm tắt quy trình xử lý mẫu dự kiến cùng một số yếu tố cần khảo sát ........ 23 Hình 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của muối chiết .............................................................. 24 Hình 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết ................................................. 25 Hình 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết ........................................................ 25 Hình 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của bột làm sạch ........................................................... 26 Hình 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của khối lượng bột làm sạch......................................... 26 Hình 3.10. Quy trình xử lý mẫu tối ưu .......................................................................... 27 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nền mẫu .............................................................................. 29 Hình 3.12. Tỷ lệ ion của các nitrosamin (mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn) .................. 30 Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn ....................... 31 Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn tại mức nồng độ LOQ = 0,5 ng/g .................... 32 Hình 3.15. Đường chuẩn các nitrosamin nghiên cứu .................................................... 33 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm trở lại đây, đồ nướng đang được giới trẻ rất ưa chuộng. Một phần chịu ảnh hưởng từ xu hướng ẩm thực Hàn Quốc và quan trọng hơn cả là đồ nướng hội tủ rất nhiều yếu tố như thơm – ngon – rẻ. Số lượng các quán nướng vỉa hè đang tăng lên với tốc độ chóng mặt. Tuy nhiên, đáng buồn là theo ước tính, mỗi năm Việt Nam có khoảng 7.000 người được chuẩn đoán mắc bệnh ung thư, trong đó có 5.000 ca tử vong và thực phẩm được cho là một trong những nguyên nhân chính gây ra tình trạng này Nitrosamin là một nhóm hóa chất có khả năng gây ung thư cho con người khi tiếp xúc với môi trường và một số loại thực phẩm, trong đó có thịt chế biến. Để bảo quản, thịt thường được tiêm chất bảo quản có chứa muối nitrit, nitrat. Amin từ quá trình phân hủy protein trong khi nấu sẽ kết hợp với nitrit tạo thành nitrosamin. Mức độ tạo thành nitrosamin phụ thuộc vào các yếu tố: phương pháp nấu, nhiệt độ, thời gian, nồng độ của nitrit/nitrat, quy trình sơ chế, điều kiện bảo quản. Vấn đề cấp bách đang được đặt ra là phải kiểm soát hàm lượng nitrosamin trong các sản phẩm chế biến từ thịt, đặc biệt là thịt nướng để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng. Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác định nitrosamin trong thực phẩm. Tuy nhiên, ở Việt Nam sự quan tâm cho vấn đề này vẫn còn khá hạn chế. Khóa luận “Nghiên cứu phương pháp xác định một số nitrosamin trong thịt nướng bằng sắc ký khí khối phổ” được thực hiện không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn. Mục tiêu của khóa luận như sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời một số nitrosamin trong thịt nướng 2. Ứng dụng phương pháp để sơ bộ đánh giá hàm lượng nitrosamin trong một số sản phẩm thịt nướng trên địa bàn Hà Nội. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về nitrosamin 1.1.1. Công thức cấu tạo của nitrosamin Nitrosamin là hợp chất hóa học có cấu trúc R1-N(-R2)-N=O, trong đó một nhóm nitroso liên kết với một amin bậc 2 hoặc muối amoni bậc 4. Công thức cấu tạo chung của nitrosamin và công thức cấu tạo của một số nitrosamin được nghiên cứu trong khóa luận này được giới thiệu ở hình 1.1 và bảng 1.1 [31]. Hình 1.1. Công thức cấu tạo chung của nitrosamin Bảng 1.1. Một số nitrosamin thường gặp Khố i TT Công thức cấ u ta ̣o Nitrosamin lươ ̣ng phân tử 1. N-Nitrosodimethyl amine (NDMA) 2. N-Nitrosodipropyl amine (NDPA) 3. N-nitroso diphenyl amine (NDPhA) N N O N N O N N O 74 130 198 1.1.2. Sự tạo thành nitrosamin Trong thực phẩm, nitrosamin được tạo bởi nitrit và các amin bậc 2, là các chất thường gặp trong protein, trong các điều kiện nhất định như môi trường acid mạnh như trong dạ dày người. Theo các nghiên cứu, khoảng pH tối ưu cho sự tạo thành nitrosamin từ nitrit là 2,5 – 3,5. Nhiệt độ cao như khi chiên thực phẩm cũng thúc đẩy sự tạo thành nitrosamin. Có thể nhận biết nitrosamin bằng phản ứng Liebermann nitroso. 2 Trong môi trường acid, nitrit tạo thành acid nitrous (HNO2), acid này nhận thêm proton và phân chia thành cation nitrosonium N≡O+ và nước: H2NO2+ → H2O + NO+ Sau đó, cation nitrosonium phản ứng với amin tạo thành nitrosamin. 1.1.3. Tính chất hóa lý của nitrosamin Các nitrosamin thường tồn tại ở dạng lỏng, màu vàng nhạt. Có khoảng 20 nitrosamin được xác định trong các sản phẩm thịt. Nitrosamin bao gồm nitrosamin không bay hơi và nitrosamin bay hơi, phụ thuộc vào các nhóm thế (R1 và R2). Các nitrosamin bay hơi (thường chỉ < 5 µg/kg) là đối tượng nghiên cứu của hầu hết các nghiên cứu trước đây. Các nghiên cứu này thường chỉ tập trung nghiên cứu 5 nitrosamin, đặc biệt là NDMA và NPYR. Nhiệt độ bay hơi của các nitrosamin nhóm này dao động trong khoảng 120-180oC ở điều kiện thường. Các nitrosamin bay hơi thường là các chất có tính phân cực trung bình, có thể tan được trong nước và một số dung môi phân cực như methanol, ethanol, acetonitril. Các nitrosamin thể hiện tính chất chung của nhóm N-nitroso (-N-N=O). Đây là nhóm chất có hoạt tính cao và là tác nhân có thể gây ung thư hoặc phá hủy tế bào trên người [4]. 1.1.4. Độc tính Nitrosamin đã được chứng minh gây ung thư trên động vật, Hiện nay các bằng chứng dịch tễ học từ các nghiên cứu bệnh chứng cho thấy sự xuất hiện của nitrosamin tỷ lệ thuận với nguy cơ mắc ung thư dạ dày, ung thu phổi, ung thư thực quản. Một số nhà nghiên cứu tin rằng nitrosamin đóng một phần vai trò trong sự thoái hóa não của bệnh Alzheimer. Ngoài ra một số thí nghiệm cũng cho thấy một lượng nhỏ nitrosamin cũng có thể gây đái tháo đường, các bệnh về gan và béo phì. Chúng cũng được cho là có liên quan đến Parkinson. Nitrosamin có thể gây thương tổn DNA, gây chết tế bào và liên quan đến tình trạng kháng insulin [31]. Các nitrosamin đã được nhiều tổ chức phân loại là các chất có thể gây ung thư. NDEA có khả năng gây ung thư lớn nhất, sau đó là NDMA, NPYR, NPIP. NPRO, NHPRO không gây ung thư. Độc tố di truyền và ung thư của một số nitrosamin vẫn chưa được làm rõ: NTCA, NMTCA. Hiện nay, NDMA và NDEA đã được tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) xếp vào nhóm 2A, còn NDPA được xếp vào nhóm 2B là nhóm có nguy cơ gây ung thư trên người [31]. 3 1.1.5. Nitrosamin trong thực phẩm Bên cạnh những nguồn chứa nitrosamin từ môi trường, khói thuốc lá, nước uống, một số sản phẩm thực phẩm cũng có nguy cơ lớn có chứa nitrosamin. Bảng 1.2 tóm tắt một số đối tượng thực phẩm thường có chứa nitrosamin [17],[29]. Bảng 1.2. Một số thực phẩm thường có chứa nitrosamin Thực phẩm Loại nitrosamin Khoảng nồng độ (µg/kg) Thịt hun khói NDMA, NPYR, NDPA, NDPhA 1-100 Thịt cà ri NDMA, NPYR, NPIP KPH -50 Cá muối NDMA, NDEA KPH -1000 Cá kho NDMA, NDEA KPH -50 Bia NDMA KPH-5 Ghi chú: KPH là Không phát hiện Trong nhóm đối tượng sản phẩm chế biến từ thịt, hiện chưa có các thông tin về hàm lượng nitrosamin trong thịt nướng đặc biệt là thịt nướng có tẩm ướp gia vị. Với tác động của nhiệt độ, nguy cơ tạo thành nitrosamin trong các đối tượng này khá rõ rệt. Mặc dù tiềm ẩn nguy cơ gây ung thư, tuy nhiên nitrit vẫn được sử dụng để làm chất bảo quản trong các sản phẩm thịt để ngăn cản sự phát triển của Clostridium botulinum, từ đó giảm nguy cơ ngộ độc. Để giảm sự tạo thành nitrosamin trong thực phẩm, người ta có thể sử dụng acid ascorbic hoặc α-tocopheral do các chất này phản ứng với N2O3. Trong những năm 1980, Dịch vụ kiểm tra và an toàn thực phẩm của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (FSIS) đã tiến hành đánh giá nitrosamin và kết luận rằng nitrosamin trong thịt nướng không gây ảnh hưởng đáng kể tới sức khỏe. Tuy nhiên, cùng với sự ưa chuộng của các sản phẩm thịt nướng trong thị hiếu người dân trong những năm gần đây mà lượng hấp thụ nitrosamin đang có xu hướng tăng trở lại. 1.1.6. Quy định hiện hành về nitrosamin Hiện nay, đã có các quy định về hàm lượng tối đa của nitrosamin trong nước ăn uống, và một số đối tượng thực phẩm. 4 Bảng 1.3. Quy định về hàm lượng các nitrosamin trong nước uống[9] Mức tối đa trong nước uống STT Quố c gia, khu vực 1 Mỹ 2 Canada 0,04 μg/L (tổ ng nitrosamin) 3 Châu Âu Âm tính 4 Đức 10 ng/L (tổ ng nitrosamin) 5 Việt Nam Chưa quy định 100 ng/L (NDEA), 300 ng/L (NDMA), và 500 ng/L (NDPA) Bô ̣ Nông nghiê ̣p Mỹ gầ n đây đã có những nghiên cứu về nguy cơ của các nitrosamin trong thiṭ hun khói và khuyế n cáo hàm lươ ̣ng tố i đa trong thiṭ hun khói đố i với NPYR (chất có hàm lượng cao nhất) là 10 µg/kg. Đối với các nitrosamin khác, mặc dù hàm lượng khuyến cáo đến nay chưa được đưa ra nhưng đối với nhiều nghiên cứu đánh giá nguy cơ hiện nay đòi hỏi phương pháp phân tích phải đạt được mức LOQ đến 0,5 µg/kg [9],[21]. 1.2. Phương pháp xác định các nitrosamin trong thực phẩm Về nguyên tắc, đầu tiên các nitrosamin được tách ra khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp. Sau đó, một kỹ thuật phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng nitrosamin trong dịch chiết từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu. 1.2.1. Phương pháp xử lý mẫu Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được nghiên cứu để chiết nitrosamin trong thực phẩm. Trong khóa luận này sẽ đề cập đến các phương pháp bao gồm chưng cất, chiết lỏng – lỏng, vi chiết pha rắn, chiết pha rắn và QuEChERS. 1.2.1.1. Chưng cất Theo kết quả của Sen và Seaman, mẫu thịt hun khói được kiềm hóa và chưng cất với dầu khoáng trong thiết bị chưng cất chân không và thu nitrosamin vào một thiết bị bẫy hơi, sau đó bẫy được chiết lại bằng DCM. DCM sau đó được cô để làm giàu và phân tích bằng sắc ký khí [30]. Kỹ thuật chưng cất này có hiệu quả tốt đối với nitrosamin đặc biệt là NDMA là chất có nhiệt độ bay hơi thấp. Phương pháp này sau đó đã được AOAC chấp nhận và trở thành phương pháp chuẩn AOAC 982.22 [6]. 5 Al-Kaseem và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật chưng cất hơi nước để cất các nitrosamin. Mẫu thịt được đồng nhất trong nước sau đó chưng cất nitrosamin vào pha nước. Mẫu sau chưng cất được chiết lại bằng DCM và làm sạch bằng SPE [3]. Tuy nhiên, hiện nay phương pháp này ít được áp dụng do sự phức tạp của hệ thống chưng cất (yêu cầu hệ thống chưng cất đặc biệt và cần có N2 để làm mát). Việc sử dụng sắc ký khí với bộ phân tích TEA cũng ít phổ biến ngày nay. 1.2.1.2. Chiết lỏng – lỏng Đối với một số mẫu dạng lỏng như bia, nước uống, kỹ thuật chiết lỏng lỏng có thể được áp dụng để chiết nitrosamin. Ngày nay, kỹ thuật chiết lỏng lỏng với chất nhồi Celite hay Extrelut có thể được sử dụng. Nitrosamin được hấp phụ vào lớp nước bao quanh các hạt nhồi, sau đó được chiết lại bằng dung môi hữu cơ thích hợp như DCM hay hỗn hợp DCM và n-hexan. Phương pháp này có thể đạt độ thu hồi từ 74-85% với giới hạn phát hiện 0,5 µg/L. Một trong những phương pháp này sau đó đã trở thành phương pháp chính thức của AOAC, áp dụng cho nền mẫu bia [7]. Kỹ thuật chiết lỏng lỏng này cũng đã được nghiên cứu trên những nền mẫu thực phẩm khác như thịt và dầu ăn. Theo Yurchenko và cộng sự, bột Extrelut (diatomaceous earth) được nhồi vào cột thủy tinh và thực hiện chiết lỏng lỏng vào hỗn hợp n-hexan:DCM (4:6). Tuy nhiên, độ thu hồi của các nitrosamin thu được rất khác nhau, tốt nhất là NPYR (90%) nhưng chỉ thu được 27% đối với NDEA [32], [33]. Kỹ thuật chiết lỏng lỏng này tuy có nhiều ưu điểm so với chiết lỏng lỏng truyền thống, nhưng vẫn sử dụng lượng lớn dung môi và không đạt hiệu quả cho tất cả các nitrosamin. 1.2.1.3. Vi chiết pha rắn (SPME) Kỹ thuật SPME cũng được một số tác giả nghiên cứu để xác định nitrosamin trên nền mẫu thực phẩm như bia, xúc xích [5], [25]. Một loại pha tĩnh được phủ lên bề mặt của sợi hấp phụ, sau đó được nhúng trực tiếp vào mẫu để hấp phụ nitrosamin. Tiếp theo, các nitrosamin được giải hấp và phân tích bằng sắc ký khí. Nhiều loại chất hấp phụ khác nhau đã được nghiên cứu như polydimethylsiloxane–divinylbenzene (PDMS–DVB), divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS). Perez và cộng sự đã sử dụng SPME với GC-MS để xác định NDMA trong bia[25]. Andrale và cộng sự đã ứng dụng SMPE để chiết NDMA, NDEA, NPIP và NPYR từ xúc xích[5]. 6 Kỹ thuật SPME đòi hỏi cần tối ưu tất cả các điều kiện để đảm bảo độ lặp lại cần thiết, bao gồm điều kiện về thời gian hấp phụ, giải hấp, nhiệt độ và loại muối tạo cân bằng giữa các pha. Thực tế, hiệu quả ứng dụng của kỹ thuật này để xác định nitrosamin không đáp ứng được yêu cầu phân tích hiện đại ngày nay. 1.2.1.4. Chiết pha rắn (SPE) Chiết pha rắn là kỹ thuật được ứng dụng rất phổ biến ngày nay trong phân tích hàm lượng vết do khả năng làm giàu và làm sạch mẫu rất tốt. Kỹ thuật này có thể phối hợp với các kỹ thuật chiết khác như chiết lỏng hoặc chưng cất trong quá trình chuẩn bị mẫu để xác định nitrosamin. Nhiều loại pha rắn đã được sử dụng để chiết và làm sạch mẫu khi xác định nitrosamin. Yurchenko và cộng sự nghiên cứu nhiều loại cột khác nhau như florisil, cyano, silicagel, aminopropyl, alumina cho thấy florisil cho hiệu quả tốt nhất khi phối hợp với chiết lỏng lỏng bằng cột extrelut. Phương pháp này sau đó được nhiều tác giả sử dụng trên các nền mẫu khác nhau như thịt cừu, rau, xúc xích và các sản phẩm thịt khác [18], [25], [27],[32], [33]. 1.2.1.5. Kỹ thuật QuEChERS Kỹ thuật QuEChERS (viết tắt của thuật ngữ Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) là kỹ thuật chuẩn bị mẫu hiện đại được thiết kế ban đầu cho phân tích thuốc bảo vệ thực vật trong nông sản sau đó được ứng dụng rộng rãi cho các mẫu khác nhờ vào tính ưu việt của nó. Phương pháp này tối thiểu hóa các bước chuẩn bị mẫu, giảm sử dụng dung môi hóa chất độc hại, đồng thời giảm chi phí thử nghiệm. Kỹ thuật QuEChERS hiện nay là cơ sở cho các phương pháp thử được thừa nhận rộng rãi trên thế giới như AOAC 2010 (2001.07), EN 15662 và đang được các PTN lớn, hiện đại ở nước ta áp dụng. ❖ Các bước trong quy trình xử lý mẫu QuEChERS ✓ Bước 1: Đồng nhất và lấy mẫu ✓ Bước 2: Thêm dung môi chiết ✓ Bước 3: Chiết lỏng ✓ Bước 4: Thêm đệm và làm khô ✓ Bước 5: Chiết ✓ Bước 6: Tách ✓ Bước 7: Tách cặn và làm sạch với d-SPE (dispersive SPE) 7 ✓ Bước 8: Tách lớp ✓ Bước 9: Hút lớp trên vào vial ✓ Bước 10: Bảo quản và phân tích ❖ Ứng dụng kỹ thuật QuEChERS trong xử lý mẫu Năm 2015, Lehotay và cộng sự sử dụng kỹ thuật QuEChERS để xác định các nitrosamin trong thịt hun khói. Các tác giả sử dụng acetonitril để chiết nitrosamin từ nền mẫu thịt có bổ sung nước. Lớp acetonitril được tách khỏi nước bằng phân bố lỏng lỏng nhờ sự có mặt của MgSO4 và HCO2NH4. Dịch chiết acetonitril sau đó được làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) với hỗn hợp chất hấp phụ gồm MgSO4, PSA, C18 và bột Z-Sep [21]. Kỹ thuật chiết QuEChERS ngày càng được nhiều tác giả nghiên cứu để xác định nitrosamin trong các nền mẫu thực phẩm khác nhau [26], [34], [35]. Một số nghiên cứu chính được tóm tắt ở bảng 1.4. Bảng 1.4. So sánh một số nghiên cứu chiết nitrosamin bằng kỹ thuật QuEChERS Tác giả, Nền mẫu Dung môi Lehotay, Thịt hun H2O:ACN 2015 [25] khói (10:10) Zheng, Nước 2016 [17] tương năm Qui, 2017 [29] Zhao, 2017 [5] Cá muối Thịt chua Muối chiết HCO2NH4 EtOAc - d-SPE MgSO4, PSA, C18, Z-Sep PSA, C18, GCB H2O:ACN MgSO4:NaCl Na2SO4, C18, (10:15) (4:1) PSA ACN - C18, PSA Độ thu hồi 81-109% 80-112% 87-113% 80-115% Ứng dụng của QuEChERS để xác định nitrosamin hiện nay mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu nhưng đã thu được nhiều hiệu quả tốt. Việc kết hợp giữa QuEChERS với các phương pháp khối phổ hiện đại là xu hướng tương lai của việc xác định nitrosamin trong nền mẫu thực phẩm. 1.2.2. Phương pháp phân tích Sau khi chiết nitrosamin ra khỏi nền mẫu, cần phải sử dụng phương pháp phân tích phù hợp để xác định và định lượng hàm lượng của các nitrosamin này. Trong đó 8 sắc ký khí được sử dụng phổ biến do tính chất dễ bay hơi của các nitrosamin nghiên cứu trong khóa luận này. Bên cạnh đó, sắc ký lỏng cũng được sử dụng do độ nhạy cao và có tính chọn lọc. 1.2.2.1. Sắc ký lỏng Sắc ký lỏng với các detector thông thường ít được sử dụng để xác định nitrosamin do khó đáp ứng được yêu cầu về độ nhạy. Theo một nghiên cứu của Cardenes và cộng sự, nitrosamin được dẫn xuất dansyl hóa và xác định bằng sắc ký lỏng với detector huỳnh quang. Phương pháp đã được ứng dụng để xác định nitrosamin trong bia và khói thuốc lá, nhưng chỉ có thể xác định ở nồng độ khoảng từ 2,5 µg/kg trở lên. Một số nghiên cứu gần đây sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để xác định nitrosamin trong nước, bia, và sản phẩm thịt [10], [14], [20]. Bản thân các nitrosamin không đáp ứng tốt với nguồn ESI (ion hóa phun điện tử) cũng là yếu tố tạo nên sự khó khăn khi ứng dụng LC-MS hoặc LC-MS/MS. Các nghiên cứu đều sử dụng nguồn APCI (ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển). Aerola xác định 4 nitrosamin trong xúc xích sử dụng kỹ thuật LC-APCI-MS để tạo các ion có số khối [M+H]+ với LOD khá thấp dao động từ 0,2 đến 1,0 µg/kg tùy từng nitrosamin [10]. Herrmann cũng sử dụng LC-APCI-MS/MS để xác định đồng thời 14 nitrosamin trong sản phẩm thịt thu được kết quả khá tốt với LOD từ 0,2 đến 1,0 µg/kg. Các kết quả cũng cho thấy LOD có sự khác biệt trên nhiều đối tượng mẫu khác nhau, cho thấy ảnh hưởng của nền mẫu tới tín hiệu phân tích rất đáng kể. Mặc dù, phương pháp LC-MS/MS cũng thu được một số kết quả khá khả quan trong việc xác định nitrosamin nhưng việc sử dụng nguồn APCI tạo nên sự không thuận lợi cho các phòng thí nghiệm khi áp dụng trong thực tế do đòi hỏi về thiết bị cũng như kinh nghiệm sử dụng loại nguồn này. Ảnh hưởng nền khá lớn cũng là một yếu tố cần cân nhắc khi sử dụng phương pháp LC-MS/MS. 1.2.2.2. Sắc ký khí Do các nitrosamin có thành phần N nên có thể sử dụng GC-NPD (detector nitơphốtpho) để xác định các nitrosamin. Grebel đã thực hiện so sánh việc sử dụng GCNPD với GC-MS để xác định nitrosamin cho thấy không có sự khác biệt quá lớn về độ chính xác của kết quả. Giới hạn phát hiện của NDMA có thể đạt đến 4 µg/L (trên dịch 9 bơm mẫu). Phương pháp này cho thấy có thể được áp dụng, tuy nhiên cần bước làm giàu mẫu để đạt được độ nhạy yêu cầu [13]. GC-TEA là kỹ thuật rất được ưa thích trước đây để xác định nitrosamin do có độ nhạy và độ chọn lọc rất tốt. Thiết bị TEA gồm một lò đốt hoạt động ở nhiệt độ thích hợp để giải phóng gốc –NO trong khi vẫn duy trì cấu tạo còn lại của các nitrosamin. Gốc –NO được chuyển đến bộ phản ứng, tại đây được xử lý với O3 và tạo thành NO2. NO2 khi qua detector quang hóa sẽ phát năng lượng dưới dạng ánh sáng ở bước sóng đặc trưng. Ánh sáng này được đo, khuếch đại để phát hiện và định lượng nitrosamin. Phương pháp này được chấp nhận bởi AOAC [31] và USDA trong nghiên cứu đánh giá nguy cơ với nitrosamin [21]. Một số tác giả cũng sử dụng GC-TEA để xác định nitrosamin trong thực phẩm như nghiên cứu của Andrade kết hợp SPME và GC-TEA thu được LOD là 3 µg/kg [5]. TCVN 10069:2013 và TCVN 11602:2016 cũng sử dụng GC-TEA để xác định nitrosamin trong cao su [1] và thịt [2]. Ngày nay, phương pháp này ít được sử dụng do những ưu điểm của phương pháp GC-MS/MS. GC-MS và GC-MS/MS là nhóm các phương pháp được sử dụng phổ biến để xác định nitrosamin trong thực phẩm. Chất đầu tiên và quan trọng nhất trong nhóm nitrosamin là NDMA có khối lượng phân tử rất thấp (M=74) và các ion sản phẩm (m/z 42 và m/z 44) thường được tạo ra bởi nhiều chất khác. Kỹ thuật CI đã được EPA chấp nhận để xác định nitrosamin trong nước uống [11]. Kỹ thuật EI đã không được EPA chấp nhận do độ nhạy không đáp ứng để xác định nitrosamin trong nước. Ngoài yêu cầu về nguồn ion, EPA còn yêu cầu sử dụng bộ bơm mẫu thể tích lớn ví dụ như PTV để tăng giới hạn phát hiện của phương pháp [11]. Rất nhiều nghiên cứu đã sử dụng CI để xác định nitrosamin trong nhiều đối tượng thực phẩm khác nhau. Gần đây, nhiều nghiên cứu cố gắng cải thiện hiệu quả của nguồn EI trong việc xác định nitrosamin và cũng đã thu được một số kết quả tốt. Một số nghiên cứu sử dụng GC-MS(/MS) để xác nitrosamin trong thực phẩm được tóm tắt ở bảng 1.5. Giới hạn phát hiện của NDMA là tiêu chí quan trọng để đánh giá phương pháp do đây là chất quan trọng nhất trong nhóm nitrosamin và là chất kém nhạy nhất. 10 Bảng 1.5. Tóm tắt một số nghiên cứu xác định nitrosamin bằng GC-MS/MS Tác giả, năm Nền mẫu Campillo, Sản phẩm 2011 [8] thịt McDonald Nước , 2012 [22] uống Huang, Sản phẩm 2013 [16] thịt Sannino, Sản phẩm 2013 [28] thịt Lehotay, Thịt hun 2015 [21] khói Zheng, Nước 2016 [34] tương Qui, 2017 [26] Cá muối Kỹ thuật bơm mẫu Cột sắc ký Nguồn ion LODNDMA hóa (µg/kg) SSL, 3 µL HP5-MS UI EI, 70 eV 0,56 SSL, 1 µL DB1701P EI, 70 eV 0,9 PTV, 10 µL DB5-MS CI, methan 0,12 PTV, 9 µL ZB-5MSi PCI, amoniac 0,1 SSL, 3 µL, kỹ thuật thổi Rtx-624 EI, 70 eV 0,1 HP-Innowax EI, 70 eV 0,4 DB-Waxetr EI, 70 eV 0,03 ngược SSL, 1 µL, kỹ thuật thổi ngược SSL, 2 µL Kết luận: Các số liệu nêu trên cho thấy, việc sử dụng nguồn EI với phương pháp GC-MS/MS, kết hợp kỹ thuật QuEChERS hoàn toàn có thể thu được hiệu quả tốt nếu chọn được điều kiện thích hợp. Sỡ dĩ nguồn EI được ưu tiên hơn vì sự phổ biến của nó so với nguồn CI. 11