Tài liệu Nghiên cứu phương pháp sản xuất và một số đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội tạng hải sâm (holothuroidea)

... ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA --------------------------------------- NGUYỄN THỊ ÁNH NGUYỄN THỊ ÁNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC C C NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ NỘI TẠNG HẢI SÂM (Holothuroidea) R L T. DU LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHOÁ K37 Đà Nẵng – Năm 2020 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA --------------------------------------- NGUYỄN THỊ ÁNH NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ ĐẶC TÍNH CỦA DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ NỘI TẠNG HẢI SÂM C C R L T. DU Chuyên ngành : Mã số: Công nghệ sinh học 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Tạ Ngọc Ly PGS.TS Đặng Minh Nhật Đà Nẵng – Năm 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn thạc sĩ này tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến thầy TS. Tạ Ngọc Ly và thầy PGS.TS Đặng Minh Nhật đã hướng dẫn cho tôi trong suốt thời gian qua. Nhờ sự tận tình chỉ dạy của thầy đã giúp tôi hoàn thành luận văn một cách tốt nhất. Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Công nghệ Sinh học nói riêng, cũng như thầy cô khoa Hóa nói chung tại trường Đại học Bách Khoa – Đại học Đà Nẵng đã tham gia giảng dạy và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này. Đà Nẵng, ngày 10 tháng 11 năm 2020 Học viên thực hiện C C DU R L T. Nguyễn Thị Ánh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu phương pháp sản xuất và một số đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm (Holothuroidea)” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người cam đoan Nguyễn Thị Ánh C C DU R L T. NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT VÀ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN TỪ NỘI TẠNG HẢI SÂM (Holothuroidea) Học viên: Nguyễn Thị Ánh Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201 Khóa: K37 Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN Tóm tắt – Nội tạng Hải sâm là phế phẩm chính của ngành chế biến Hải sâm. Phế phẩm này chứa nhiều protein, chất béo và khoáng chất nên nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng ứng dụng của phụ phẩm Hải sâm vào đời sống. Quy trình công nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm đã được nghiên cứu bằng cách bổ sung papain. Nội tạng Hải sâm xay nhuyễn được bổ sung nước/nguyên liệu theo tỷ lệ khác nhau, tốc độ khuấy và thời gian thủy phân cũng khác nhau. Kết quả cho thấy, mức độ thủy phân cao nhất đạt được khi tỷ lệ bổ sung nước/nguyên liệu: 1,5/1 (v/w); tốc độ khuấy: mức 1; thời gian thủy phân: 180 phút. Mô hình toán học về động học phản ứng của papain cũng đã được khảo sát để nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến tốc độ phản ứng của enzyme bằng mô hình Lineweaver-Burk. Các thông số động học Km và Vmax đã được tính toán lần lượt là 0,21 g/L và 1,69 mg/phút. Nghiên cứu còn chỉ ra papain thô từ mủ đu đủ có thể thay thế cho papain thương mại. Kết quả phân tích thành phần acid amin trong nội tạng Hải sâm chỉ ra nội tạng Hải sâm có thành phần dinh dưỡng cao khi phát hiện được 16/22 loại acid amin, trong đó có 8/9 acid amin thiết yếu. Acid amin chiếm thành phần cao nhất là Acid Glutamic (3,182 mg/g chất khô) và Alanine (1,925 mg/g chất khô). Khả năng bắt gốc tự do DPPH của dịch đạm thủy phân khá cao: 62,8% khi mức độ thủy phân 10 % tại 62oC. Từ các kết quả này cho thấy, dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm có khả năng ứng dụng cao vào việc sản xuất mỹ phẩm, dược phẩm, phân bón,… và cần được nghiên cứu rộng rãi hơn nhằm góp phần phát triền bền vững ngành chế biến thủy sản. C C R L T. DU Từ khóa – nội tạng Hải sâm; papain; điều kiện thủy phân; động học; DPPH. RESEARCH ON PRODUCTION METHOD AND CHARACTERISTICS OF HYDRAULIC PEPPER FROM SEA CUCUMBER INNARDS (Holothuroidea) Abstract – Sea cucumber innards is the main waste of the sea cucumber processing industry. This byproduct contains many proteins, fats and minerals so this study is to investigate the applicability of by-products of sea cucumber in life. The technological process of producing hydrolyzate from Sea cucumber innards have been studied by the addition of the papain. Sea cucumber innards are pureed, add water with different ratios, different stirring speed and hydrolysis time. The results show that the highest hydrolysis efficiency is achieved when the ratio of water/material addition: 1.5/1 (v/w); stirring speed: level 1; hydrolysis time: 180 minutes. The mathematical model of the papain enzyme reaction kinetics was also investigated to study the effects of factors on the enzyme reaction rate using the Lineweaver-Burk model. Kinematic parameters of Km and Vmax were calculated to be 0.21 g / L and 1.69 mg / min, respectively. Research has also show that papain from papaya latex can be a substitute for commercial papain. Results of analysis of amino acids in the intestine of sea cucumbers show that sea cucumbers have high nutritional components when detecting 16/22 amino acids, including 8/9 essential amino acids. Amino acids with the highest composition are Glutamic Acid (2.828 mg / g dry matter) and Alanine (1.711 mg / g dry matter). DPPH free radical capture ability of hydrolyzate is quite high: 62.8% when 10 % hydrolyzed efficiency is reached at 62oC. From these results show that, sea cucumber innards should be studied more extensively to contribute to the sustainable development of the seafood processing industry. Key words – sea cucumber innards; papain; hydrolysis conditions; kinetic; DPPH. MỤC LỤC MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................1 2. Mục đích nghiên cứu .............................................................................................1 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..............................................................2 a. Ý nghĩa khoa học ...............................................................................................2 b. Ý nghĩa thực tiễn ................................................................................................2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................3 1.1. Hải sâm ..............................................................................................................3 1.1.1. Khái niệm và phân bố .................................................................................3 1.1.2. Vai trò, giá trị của Hải sâm .........................................................................4 1.1.3. Tình hình khai thác Hải sâm .......................................................................5 1.2. Tình hình nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm nội tạng hải sản ..............7 1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới..............................................................................7 1.2.2. Nghiên cứu trong nước................................................................................7 1.3. Papain .................................................................................................................9 1.4. Hoạt tính chống oxy hóa ..................................................................................11 1.4.1. Khái niệm ..................................................................................................11 1.4.2. Các nghiên cứu hoạt tính chống oxy từ dịch đạm thủy phân ....................13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................14 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................15 2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................16 2.2.1. Phương pháp thủy phân bằng enzyme ......................................................16 2.2.2. Xác định hàm lượng N acid amin giải phóng bằng phương pháp Ninhydrin ................................................................................................................16 2.2.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng Hải sâm đến mức độ thủy phân .............................................................................................19 2.2.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến mức độ thủy phân ...................................................................................................................20 2.2.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến mức độ thủy phân.................................................................................................................21 2.2.6. Phương pháp xác định các thông số động học (Km, Vmax) của phản ứng .22 2.2.7. Xác định thành phần và tỷ lệ các acid amin ..............................................22 2.2.8. Xác định hoạt tính chống oxi hóa của dịch đạm thủy phân bằng 1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ........................................................................22 2.2.9. Phương pháp thu nhận papain thô từ mủ đu đủ ........................................24 2.2.10. Phân tích thống kê .....................................................................................24 C C DU R L T. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................................................................25 3.1. Động học của phản ứng thủy phân ..................................................................25 3.2. Hoàn thiện công nghệ sản xuất dịch đạm thủy phân .......................................27 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng Hải sâm đến mức độ thủy phân.................................................................................................................28 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến mức độ thủy phân .................29 3.2.3. Xác định sự thay đổi của mức độ thủy phân theo thời gian ......................30 3.2.4. Khả năng sử dụng papain thô thay thế papain thương mại .......................31 3.3. Đặc tính của dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm ........................................33 3.3.1. Thành phần acid amin của sản phẩm dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm ...................................................................................................................33 3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm........34 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN .............................................................................................36 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................37 PHỤ LỤC 1: SỐ LIỆU VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................46 PHỤ LỤC 2: CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ...........................47 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN ACID AMIN ........................51 C C DU R L T. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ BIẾT TẮT v/w : volume/weigh – Thể tích/khối lượng U : Unit – Đơn vị hoạt độ của enzyme TCA : Trichloroacetic acid OD :Optical density – Mật độ quang DH : Degree of Hydrolysis – Mức độ thủy phân C C DU R L T. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Tên bảng Số trang Bố trí thí nghiệm xác định Vmax, Km Hàm lượng N acid amin của các mẫu thử nghiệm động học Thành phần acid amin của sản phẩm dịch đạm thủy phân (mg/g chất khô) C C DU R L T. 22 25 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Số trang Hình 1.1 Hải sâm 3 Hình 1.2 9 12 Hình 2.1 Cấu trúc 3D của papain Quá trình chuyển từ đỏ tía sang vàng của phản ứng DPPH Sơ đồ thí nghiệm Hình 2.2 Nội tạng Hải sâm 15 Hình 2.3 Papain thương mại 15 Hình 2.4 Mẫu thủy phân trong tủ ấm ở 62oC Quá trình Ninhydrin kết hợp với acid amin để tạo thành phức chất màu xanh Dịch đạm thủy phân sau khi thêm thuốc thử Ninhydrin 16 18 Hình 2.11 Đường chuẩn Glycine Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bổ sung nước/nội tạng Hải sâm (v/w) trong quá trình thủy phân Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy trong quá trình thủy phân Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân trong quá trình thủy phân Mẫu đối chứng và mẫu thủy phân sau khi thêm DPPH Hình 2.12 Quy trình thu nhận papain thô từ mủ đu đủ 24 Hình 1.3 Hình 2.5 Hình 2.6 Hình 2.7 Hình 2.8 Hình 2.9 Hình 2.10 C C R L T. DU 14 17 17 19 20 21 23 Hình 3.4 Sự biến thiên nồng độ sản phẩm thủy phân theo thời gian Phương trình Lineweaer – Burk để tính Km, Vmax Ảnh hưởng tỷ lệ nước/nguyên liệu đến mức độ thủy phân Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến mức độ thủy phân Hình 3.5 Sự thay đổi mức độ thủy phân theo thời gian 31 Hình 3.6 Sơ đồ hoàn thiện quy trình thủy phần nội tạng Hải sâm Phần trăm bắt gốc tự do của dịch đạm thủy phân nội tạng Hải sâm 32 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.7 26 26 28 29 34 1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Hải sâm là loài hải sản có giá trị dinh dưỡng và y học cao. Ở Việt Nam, Hải sâm là một trong những nhóm nguồn lợi quan trọng, có mức độ phong phú về thành phần loài, trong đó có nhiều loài có giá trị thương mại cao (khoảng 9 loài) đã được khai thác với sản lượng lớn (trong những năm 90). Ước chừng nội tạng Hải sâm chiếm 40% trọng lượng cơ thể. Nhiều thành phần trong nội tạng của Hải sâm đã được nghiên cứu phát hiện ra như là EPA, DHA là các axit béo chiếm lần lượt là 13,09% và 6,88% , 8 loại axit amin thiết yếu chiếm 39,93% tổng axit amin toàn cơ thể [1]. Các cơ quan nội tạng cũng rất giàu khoáng chất như các nguyên tố Mg, Fe, Zn, V, Se [1], lectin [2] [3] [4]. Với hàm lượng chất dinh dưỡng, protein lớn như vậy, nội tạng Hải sâm cần được ứng dụng nhiều hơn vào các lĩnh lực như chế biến đồ hộp, sản xuất nước mắm, phân bón, ngoài ra còn có thể nghiên cứu cho lĩnh vực dược phẩm. Sự đánh giá ngày càng cao về Hải sâm ở các thị trường châu Á, châu Âu và sự công nhận của các nhà khoa học về hàm lượng dinh dưỡng của Hải sâm đã dẫn đến việc sức tiêu thụ Hải sâm ngày càng tăng trên thế giới, kéo theo lượng phụ phẩm của Hải sâm bị thải bỏ cũng tăng theo. Chính vì vậy, việc chế biến, xử lý các phụ phẩm Hải sâm nhằm thu được protein có giá trị thương mại cao hơn, đồng thời tránh các vấn đề về môi trường đang là những mục tiêu được quan tâm nghiên cứu. Hiện nay nhu cầu về thực phẩm chế biến sẵn ngày càng tăng cao trên toàn thế giới, nên protease đang là đối tượng được nghiên cứu rộng rãi trong lĩnh vực này vì chúng có khả năng phân giải làm mềm thịt, tạo ra dịch đạm thủy phân giàu dinh dưỡng. Do đó, việc thủy phân bằng protease để thu hồi protein từ phụ phẩm Hải sâm là một cách tiếp cận hiệu quả và nên được ứng dụng rộng rãi. Tuy nhiên vẫn chưa có một công trình nào công bố về việc nghiên cứu nội tạng Hải sâm để ứng dụng vào một lĩnh vực cụ thể. Do đó, trong nghiên cứu này, tôi tiến hành xác định điều kiện tối ưu hóa nội tạng Hải sâm, từ đó thu nhận dịch đạm thủy phân và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng, nhằm góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường góp phần xử lý chất thải một cách khoa học, giúp phát triển bền vững ngành khai thác, chế biến thủy - hải sản. 2. Mục đích nghiên cứu Đề tài hướng đến 3 mục đích nghiên cứu chính: - Xác định động học phản ứng enzyme. - Xác định các thông số công nghệ sản xuất và hoàn thiện quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm. - Xác định được một số đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm 1. C C DU R L T. 2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài a. Ý nghĩa khoa học - Thu được một quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm một cách tối ưu. - Từ những đặc tính của dịch đạm thủy phân từ nội tạng Hải sâm, có thể ứng dụng rộng rãi hơn trên các đối tượng khác và lĩnh vực khác. b. Ý nghĩa thực tiễn Công trình nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn như sau: Tận dụng được nguồn nguyên liệu bỏ đi là nội tạng Hải sâm để tạo nên sản phẩm thủy phân với hàm lượng dinh dưỡng cao, đồng thời góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường, hướng đến việc khai thác và chế biến Hải sâm bền vững. 3. C C DU R L T. 3 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hải sâm 1.1.1. Khái niệm và phân bố C C R L T. Hình 1.1. Hải sâm DU Hải sâm hay còn gọi là dưa biển, sâm biển, đỉa biển, là loài động vật không xương sống, thành viên lớp Holothuroidea, cùng ngành động vật da gai với sao biển, nhím biển,…Chúng thường sống dưới đáy biển từ vùng nước nhiệt đới ấm áp đến rãnh biển sâu lạnh. Hải sâm thường được tìm thấy ở các vịnh và những nơi có nhiều đá ngầm ở biển khơi. Thân có dạng ống dài như quả dưa, phình ra ở giữa và thon nhỏ ở hai đầu với những gai thịt nhỏ. Phía trước miệng có vành tua rõ rệt, phía sau là hậu môn. Dọc thân là các dãy chân ống. Da mềm có các phiến xương nằm rải rác dưới da. Hải sâm là động vật phân tính, trừ một số loài thuộc bộ Không chân (Apoda). Trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ. Chúng bò trên nên đáy, ở độ sâu khác nhau, chỉ có một số loài thuộc họ Pelagothuridae là bơi lội. Hải sâm phân bố ở nhiều nước trên thế giới và có nhiều loài [5], chúng có khả năng tái sinh rất cao và sức chịu đựng bền bỉ, ngư dân đánh bắt thường để chế biến các món ăn đặc sản, hoặc phơi sấy khô làm thực phẩm và thuốc. Theo GS Đỗ Tất Lợi (2001), Hải sâm bổ không kém gì nhân sâm nên được gọi là sâm biển và trong y học cổ truyền- Hải sâm được coi như là loại thuốc bổ thận, bổ âm, tráng dương ích tinh, nhuận táo, chữa lị, chữa viêm phế quản, thần kinh suy nhược, cầm máu, thành phần lipit của Hải sâm còn có tác dụng chữa xơ vữa động mạch, hen suyễn Hải sâm là một nhóm đa dạng và phong phú, chúng phân bố khắp đại dương trên thế giới với khoảng 2500 loài thuộc 25 họ khác nhau [6]. Chúng có thể được tìm thấy trong hầu hết các môi trường từ khu vực thủy triều nông đến tầng sâu nhất của các rãnh đại dương. Một trong những tài liệu sớm nhất được tìm thấy về Hải sâm là các hóa thạch của Hải sâm từ kỉ Silur từ 400 triệu năm trước [7]. Một nghiên cứu năm 2009 tại các rạn 4 san hô của Biển Đông, Biển Sulu và Biển Sulawesi đã được thực hiện. Kết quả tìm thấy 12 loài Hải sâm từ 4 họ và 9 chi khác nhau. Họ chiếm ưu thế nhất là Holothurridae (5 loài), tiếp theo là Stichopodidae (3 loài) và Synaptidae (3 loài) và Cucumarridae (1 loài) [8]. Năm 1991, cuộc khảo sát thực địa về sự phân bố của một loại Hải sâm điển hình đó là Hải sâm đỏ ở vùng biển Đông Nam Alaska cho thấy mật độ Hải sâm đếm được trong các tuyến trung bình là 20,8 cá thể trên 1ha ở tầng trong; 70,9 cá thể ở tầng giữa và 103,7 cá thể ở tầng ngoài của vịnh. Hải sâm được tìm thấy ở hầu hết các độ sâu từ vùng triều đến độ sâu 183 m. Mật độ cao hơn được tìm thấy ở 2 vùng sâu rõ rệt: trên 60 m và từ 100 – 150 m [9]. Có 6 loại địa tầng đã bắt gặp được Hải sâm đó là bùn / cát, mảnh vụn, đá, vỏ sò, tường đá và tảo. Trong đó mật độ phận bố của Hải sâm dọc theo tường đá là cao nhất, lên đến 234 cá thể / 1 ha. Việc phân bố này chưa giải thích được nhưng cũng có giả thiết rằng Hải sâm có thể ưa thích các tường dốc, hoặc chúng chọn nơi đây để làm nơi sinh sản [9]. Trên nền địa chất phủ đầy đá, sỏi thì tốc độ di chuyển trung bình của Hải sâm là 3,9 m/ngày [10]. Hải sâm thu thập thức ăn bằng cách lấy thức ăn dưới dạng hạt từ đáy biển hoặc bằng cách nuốt một lượng lớn chất nền chưa đầy chất dinh dưỡng mà chúng đào bới được [11]. 1.1.2. Vai trò, giá trị của Hải sâm Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thịt Hải sâm để đánh giá các thành phần có giá trị cao và các hoạt chất sinh học từ Hải sâm cho các loại thực phẩm chức năng. Hải sâm là nguồn thức ăn của con người, đặc biệt một số vùng ở châu Á [12]. Về mặt dinh dưỡng, Hải sâm có các chất dinh dưỡng quý giá như Vitamin A, Vitamin B1 (thiamine), Vitamin B2 (riboflavin), Vitamin B3 (niacin) và các khoáng chất, đặc biệt là canxi, magiê, sắt và kẽm [13]. Ngoài ra, hàm lượng protein trong Hải sâm cao hơn và hàm lượng chất béo thấp hơn so với hầu hết các loại thực phẩm khác [14]. Thành cơ thể Hải sâm chứ nhiều collagen, được sử dụng như chất bổ sung dinh dưỡng cho quá trình tạo máu. Protein Hải sâm rất giàu lysine, arginine và tryptophan. Gelatin từ Hải sâm được coi là có giá trị hơn các gelatin khác vì thành phần axit amin đặc trưng của nó, đặc biệt là các axit amin thiết yếu [14]. Ở Đông Á, Hải sâm từ lâu đã được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để điều trị hen suyễn, tăng huyết áp, thấp khớp, thiếu máu và tắc nghẽn xoang [15]. Chúng cũng đã được báo cáo là có hiệu quả trong việc chữa lành các vết thương bên ngoài khác nhau, chẳng hạn như vết cắt và vết bỏng, cả những vết thương bên trong, đặc biệt là sau khi phẫu thuật lâm sàng, chấn thương [15]. Khả năng chữa lành các mô của Hải sâm được cho là có liên quan đến hàm lượng axit eicosapentaenoic (EPA) cao [15] [16]. Hải sâm được công nhận là một nguồn Chondrotin sulfate tốt, là một loại thuốc giảm đau khớp. Điều trị viêm khớp dạng thấp, viêm xương khớp và thoái hóa khớp mắt cá chân bằng Hải sâm đã được thử nghiệm thành công [14]. Hải sâm còn cho thấy một số chức năng khác như ức chế ung thư phổi và lalactophore trong tuyến vú [17]. Nghiên cứu chỉ ra rằng, Hải sâm có khả năng ức chế sự hình thành các gốc tự C C DU R L T. 5 do AAPH và DPPH, các mẫu có cơ quan nội tạng có khả năng ức chế các gốc oxy hóa cao hơn đáng kể so với các mẫu không có nội tạng, cho thấy các cơ quan nội tạng có hoạt chống oxy hóa cao hơn thành cơ thể của chúng [18]. Trong hệ sinh thái, Hải sâm giữ vai trò quan trọng như chúng là động vật ăn lọc, ăn mùn bã và cả con mồi. Trong các khu rừng tảo bẹ và rạn san hô, chúng tiêu thụ kết hợp cả vi khuẩn, tảo cát và mùn bã hữu cơ [19] [20]. Chức năng của chúng như một hệ thống treo hoặc bộ lọc có giá trị đáng kể dưới đáy biển. Là động vật ăn lọc, Hải sâm điều chỉnh chất lượng nước bằng cách làm thay đổi hàm lượng carbonate và độ pH của nước [21]. Hải sâm thay đổi kích thước của các hạt ăn vào và chuyển vào trầm tích thông qua các quá trình sinh học, nhờ đó thay đổi sự phân tầng, ổn định đáy bùn và cát [21]. Ví dụ, trên các rạn san hô, quần thể Hải sâm khỏe mạnh có thể làm xáo trộn toàn bộ trên 5 milimét trầm tích mỗi năm một lần, làm giảm đáng kể sinh khối vi khuẩn trong trầm tích [22] và đóng vai trò quan trọng trong việc tái chế các chất dinh dưỡng trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, khi đó các chất dinh dưỡng sẽ được giữ lại trong trầm tích [23]. Bruckner và cộng sự (2003) lưu ý rằng sự tuyệt chủng của họ Holothurian đã dẫn đến sự cứng lại của đáy biển, do đó loại bỏ môi trường sống tiềm năng của các sinh vật đáy khác [24]. Holothurian là con mồi quan trọng trong rạn san hô và lưới thức ăn ôn đới [25] [26] [27], cả ở vùng nước nông và nước sâu [28] [21], nơi chúng là nguồn thức ăn đặc biệt của cá, sao biển và động vật giáp xác [27]. Ngoài tầm quan trọng về sinh thái, Hải sâm còn có giá trị xã hội và kinh tế to lớn đối với các cộng đồng dân cư ven biển. Chẳng hạn, nghề khai thác Hải sâm là nguồn thu nhập chính của nhiều cộng đồng ven biển ở Quần đảo Solomon [29] và cho 4000 – 5000 gia đình ở Sri Lanka [30]. 1.1.3. Tình hình khai thác Hải sâm 1.1.3.1. Trên thế giới Vào những năm 1990, tổng sản lượng đánh bắt Hải sâm thương mại trên toàn thế giới đạt mức 30.000 tấn/năm, chủ yếu là do nhu cầu ngày càng tăng ở thị trường Trung Quốc. Mặc dù, Hải sâm có tầm quan trọng về mặt sinh thái và xã hội, việc đánh giá tình trạng toàn cầu của chúng là một thách thức: dữ liệu thiếu phong phú; thống kê đánh bắt, nhập khẩu và xuất khẩu thường không đầy đủ; và việc buôn bán Hải sâm rất phức tạp. Trong thế kỉ qua, chúng ta đã chứng kiến sự suy giảm của nhiều nghề khai thác cá truyền thống, cũng như sự mở rộng của nghề khai thác động vật không xương sống [31]. Sự gia tăng của nghề khai thác động vật không xương sống được cho là do nhu cầu tiêu thụ ngày càng tăng [32] [33], nhu cầu về nguồn hải sản mới để thu hoạch [34] [35] và sự gia tăng của động vật không xương sống ngày càng lớn. Mặc dù sự gia tăng toàn cầu của động vật không xương sống, nhiều nghề đánh bắt cá riêng lẻ cho thấy sự suy giảm nghiêm trọng hoặc thậm chí sụp đổ. Ví dụ, nghề khai thác nhím biển đã đi theo chu kì bùng nổ và suy thoái trên khắp thế giới [36] [33] [37], hàu đã bị cạn kiệt dọc theo bờ C C DU R L T. 6 biển của Hoa Kỳ và miền Đông của Australia [38], quần thể tôm, cua đã bị cạn kiệt ở Vịnh Greater Alaska [39]. Nghề khai thác Hải sâm đã mở rộng trên toàn thế giới về sản lượng và giá trị trong hai đến ba thập kỷ qua [40] [41] [42]. Các khu vực Ấn Độ - Thái Bình Dương đã thu hoạch và khai thác hơn một năm nay để cung cấp cho thị trường châu Á, chủ yếu là Trung Quốc [40], đặc biệt là khi Trung Quốc tái gia nhập thương mại thế giới trong những năm 1980. Tuy nhiên việc quản lý không đầy đủ nghề khai thác Hải sâm đã dẫn đến tình trạng đánh bắt nghiêm trọng tại nhiều quốc gia, do đó nguồn dự trữ thiên nhiên bị cạn kiệt ở hầu hết ở những nơi mà chúng phân bố. Quần thể Hải sâm dễ bị đánh bắt quá mức vì ít nhất hai lý do chính. Đầu tiên, người đánh bắt có thể dễ dàng thu hoạch được Hải sâm ở các vùng nước nông [43] [24]. Thứ hai, tuổi trưởng thành của chúng muộn, tăng trưởng chậm [43] [44], hơn nữa mật độ quần thể thấp, việc sinh sản của chúng có thể gây ra hiệu ứng Allee [45], dẫn đến sự suy thoái quần thể và ức chế sự phục hồi [46] [44]. Do các yếu tố này cùng với việc đánh bắt quá mức đã làm suy giảm nghiêm trọng số lượng của nhiều quần thể Hải sâm. Cho đến nay, dù việc khai thác Hải sâm đã dừng lại, trữ lượng Hải sâm phục hồi dường như rất chậm [47] [43], và sự phục hồi có khả năng diễn ra hàng thập kỷ [43]. 1.1.3.2. Ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đặc điểm phân bố của Hải sâm tại Việt Nam cho thấy, vùng biển ở nước ta có khoảng 60 loài Hải sâm, trong đó chủ yếu tập trung ở vùng biển Phú Yên, Khánh Hòa và các đảo xa bờ như Phú Quốc, Thổ Chu, Trường Sa, Côn Đảo… với nhiều loại như Hải sâm vú, Hải sâm mít, Hải sâm lựu, Hải sâm trắng, hải sâm đen, hải sâm gai [48]. Hải sâm vú (Holothuria fuscogilva) và Hải sâm lựu (Thelenota ananas) là hai loài đang có nguy cơ bị tuyệt chủng. Một nghiên cứu năm 2017 về nguồn lợi hai loài này đã được thực hiện tại vùng biển Khánh Hòa và Bình Thuận, đây là nơi có nguồn lợi thủy sản cao và phong phú bậc nhất cả nước. Tại huyện Phú Quý (Bình Thuận) sản lượng khai thác khoảng năm 2012 khoảng 15 tấn/chuyến. Sau đó sản lượng giảm dần qua các năm. Đến năm 2017, sản lượng còn 5 tấn/chuyến. Qua đó, có thể thấy nguồn lợi Hải sâm vú và Hải sâm lựu đã bị suy giảm nghiêm trọng. Tương tự tại vùng biển Nha Trang, sản lượng khai thác Hải sâm cũng suy giảm, cụ thể năm 2012 sản lượng khai thác là 5 tấn/chuyến, sau đó giảm dần qua các năm. Đến năm 2017, sản lượng khai thác chỉ còn 2 tấn/chuyến. Có chuyến không khai thác được Hải sâm vú, Hải sâm lựu [49]. 100% số người được phỏng vấn cho rằng nguyên nhân suy giảm nguồn lợi Hải sâm là sự khai thác quá mức của người dân vì Hải sâm là loài có giá trị kinh tế cao, đặc tính di chuyển chậm nên việc đánh bắt khá dễ dàng. Ngoài sản lượng khai thác từ tự nhiên, hiện nay Hải sâm được nuôi thương phẩm theo các mô hình nuôi bãi, nuôi lồng, nuôi biển rất phổ biến ở các tỉnh ven biển như Vân Đồn – Quảng Ninh, Khánh Hòa, Vũng Tàu…, ước tính nuôi trên 1.000 ha; năng suất C C DU R L T. 7 nuôi đạt 2,5 tấn/ha [50]. Mặt khác, để phục vụ nhu cầu xuất khẩu các sản phẩm từ Hải sâm thì nguồn nguyên liệu nhập khẩu tăng đáng kể, sản lượng nguyên liệu Hải sâm phải nhập khẩu hàng năm ước tính khoảng 80 nghìn tấn. Như vậy, tổng sản lượng nguyên liệu Hải sâm phải sử dụng trong chế biến là khá lớn, ước chừng khoảng trên 100 nghìn tấn mỗi năm. 1.2. Tình hình nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm nội tạng hải sản 1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới Hiện nay trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu trên thịt Hải sâm, nhưng vẫn chưa có nghiên cứu nào trên nội tạng của Hải sâm mặc dù lượng nội tạng Hải sâm bị thải bỏ là rất lớn. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu tương tự trên những phế phẩm thủy sản như vỏ đầu tôm, nội tạng cá ba sa, … chúng mang lại giá trị rất lớn về mặt kinh tế cũng như môi trường. Theo Shahidi và Synowiecki (1991), các phụ phẩm từ quy trình chế biến tôm đã được xác định là một nguồn protein lớn, đồng thời cũng là một nguồn quan trọng để sản xuất chitin và asthaxanthin [51]. Việc thu hồi một phần protein từ phụ phẩm tôm bằng enzyme thủy phân cũng đã được nghiên cứu rộng rãi [52] [53]. Đặc biệt, alcalase thường được sử dụng để thủy phân protein từ phụ phẩm tôm [54] [55]. Holanda and Netto (2006) nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme alcalase và pancreatin [56]. Bên cạnh vai trò dinh dưỡng, sản phẩm thủy phân protein còn là nguồn peptit có hoạt tính sinh học mang đến tiềm năng đáng kể trong dược phẩm như: khả năng chống oxy hóa, khả năng kiểm soát enzyme gây cao huyết áp [56] [57] [58], khả năng chống đột biến gen có khả năng gây ung thư [59] [60]. Các thành phần và chất lượng dinh dưỡng của các sản phẩm phụ chế biến (đầu, vỏ và đuôi) của tôm hồng Bắc và tôm đốm được đánh bắt gần Tongyeong, Hàn Quốc, đã được Min Soo Heu (2003) khảo sát. Hàm lượng protein thô nằm trong khoảng 9,31% và tổng lượng chất béo xấp xỉ 0,7%. Axit aspartic, axit glutamic, phenylalanine, lysine và arginine là các axit amin chiếm ưu thế trong phần protein. Hàm lượng canxi (3000 mg / 100 g) cao hơn so với phốt pho (400 mg / 100 g), natri (270 mg / 100 g) và magie (100 mg / 100 g). Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lượng nitơ phi protein giữa các phần ăn được và phụ phẩm chế biến của tôm. Tổng hàm lượng axit amin tự do của các sản phẩm phụ chế biến (2000 mg / 100 g) cao hơn 15% so với các phần ăn được (1700 mg / 100 g). Các axit amin tự do chính là taurine, threonine, leucine, tryrosine và phenylalanine [61]. Nghiên cứu của See và tập thể (2011) đã sử dụng enzyme thủy phân protein từ phụ phẩm từ cá hồi để tạo ra các peptit và các acid amin có giá trị dinh dưỡng cao. Sử dụng Alcalase 2.4 L để thủy phân protein từ da cá hồi ở nhiệt độ từ 55,3oC, pH 8,39 với tỷ lệ enzyme là 2,5% đã tìm được mức độ thủy phân cao nhất đạt 77,03% [62]. 1.2.2. Nghiên cứu trong nước C C DU R L T. 8 Ở Việt Nam, Bùi Thị Hồng Thạnh (2012) tiến hành nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ vỏ đầu tôm bằng enzyme alcalase cố định ở điều kiện nhiệt độ, pH môi trường, tỉ lệ enzyme và cơ chất, thời gian phản ứng enzyme lần lượt là 56 oC, tự nhiên, 0,42% và thời gian 8,8 giờ thu được hàm lượng DDPH bị khử 0,4794 mM/g [63]. Nguyễn Thị Ngọc Hoài và cộng sự (2013) sử dụng tối ưu hóa quá trình thủy phân protein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng alcalase theo phương pháp bề mặt đáp ứng, tuy nhiên lại cố định pH thủy phân của alcalase là 6,5 [64]. Võ Văn Song Toàn (2016) đã khảo sát được hàm lượng đạm amin và đạm ammoniac sinh ra lần lượt là 4,679 ± 0,101 mgN/mL và 0,256 mgN/mL khi thủy phân protein 2 gram cơ chất vỏ đầu tôm bằng bromelain (10,68 U.mg – 1) từ vỏ khóm trong môi trường dung dịch đệm phosphate pH 8, nhiệt độ 45 oC, trong 4 giờ là điều kiện thích hợp [65]. Trần Quốc Hiền và Lê Văn Việt Mẫn (2006) đã khảo sát quá trình tinh sạch protease từ ruột cá ba sa. Dịch chiết protease kiềm thu được tổng hoạt tính cao nhất là 15,79 UI/g (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35 oC; thời gian chiết 10 phút [66]. Kết quả nghiên cứu của Vương Bảo Thy (2014) về thành phần enzyme trong các cơ quan nội tạng của hệ tiêu hóa cá tra (Pangasius hypophthalmus) cho thấy là enzyme tập trung nhiều nhất ở gan tụy với hoạt độ lipase 337,01 U/g chất khô, protease 42,14 U/g và amylase 209,85 U/g chất khô [67]. Sau khi tiến hành thủy phân phụ phẩm từ cá tra bằng enzyme Alcalase, Cao Xuân Thủy và cộng sự đã tìm ra được thành phần hóa học của nội tạng cá tra protein 90,8%, tro 4,3%, chất béo 0,76% [68]. Một nghiên cứu khác cũng trên phụ phẩm cá Tra, kết quả hoạt độ chống oxy hóa của dịch đạm thủy phân cho thấy nồng độ ức chế 50% DPPH (IC50) của dịch đạm thủy phân đạt khoảng 6775 μg / mL cao hơn 1645 lần so với vitamin C và cao hơn 17 lần so với BHT ( Butylated Hydroxytoluene) với mức độ thủy phân (DH) của dịch đạm thủy phân là 14,6% khi thời gian thủy phân là 5h, tỷ lệ enzyme / cơ chất (E/S) là 30 U/g protein, nhiệt độ thủy phân là 55 oC, và pH là 7,5 [69]. Trần Thị Hồng Nghi và cộng sự (2009) đã tiến hành thủy phân phụ phẩm cá tra bằng protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis). Tác giả đã thu được dịch đạm thủy phân đạt chất lượng tương đối tốt cấp 1 theo tiêu chuẩn chất lượng nước mắm. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các điều kiện tối ưu cho hoạt động của protease từ Bacilus subtilis là ở nhiệt độ 50 oC; pH 7,6; hàm lượng nước 30%; nồng độ muối 2%, 50 UI enzyme và thời gian thủy phân 18 giờ [70]. Theo nghiên cứu của Trần Kiều Anh (2017), dịch đạm thủy phân thu được từ phụ phẩm các hồi có hàm lượng acid amin đạt 29,48 mg/ml và có hoạt tính chống ô xi hóa đo qua khả năng bắt gốc tự do DPPH (SC) là 70,34% [71]. C C DU R L T. 9 1.3. Papain 1.3.1. Cấu tạo của papain Papain dạng bột màu vàng nâu nhạt tùy thuộc vào phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan trong H2O hay glycerine. Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm -SH của cystein 25 và nitrogen bậc 3 của histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên kết hydrogen. Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các acid amin là: Lys-Asp-GluGly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys [74]. C C R L T. DU Hình 1.2. Cấu trúc 3D của papain 1.3.2. Hoạt tính của papain Papain là một chất endoprotease có chứa 16,1% N và 1,2% S. Khoảng pH thích hợp để papain hoạt động là 6,0 ÷ 8,0. Nhiệt độ tối thích để hoạt động tùy vào từng cơ chất khác nhau và có thể duy trì hoạt tính đến 60oC. Một điều cần lưu ý là khoảng pH và nhiệt độ tối thích của papain sẽ không cố định mà thay đổi tùy vào nguồn thu nhận, cơ chất phản ứng, cách thức trích ly và tinh chế papain. So với các protease có nguồn gốc từ động vật hoặc vi sinh vật, papain có khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó được dùng để thủy phân tiếp các liên kết peptide còn lại sau khi đã thủy phân bằng trypsin hay chymotrypsin. Khả năng thủy phân cơ chất của papain còn phụ thuộc vào trạng thái của cơ chất, tức là có biến tính hay không. Nếu cơ chất bị biến tính thì papain có khả năng thủy phân sâu hơn [74]. Papain thủy phân protein, đóng vai trò vừa là endopeptidase vừa là exopeptidase. Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành peptide. Trong đó: i + k = n 10 Các exopeptidase thủy phân protein chủ yếu tạo thành acid amin: Trong đó: i’ + k’ = n Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với protein và với glutamic acid có nhóm carboxyl tự do. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain - Nhiệt độ: + Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn 100oC thì nó sẽ bị mất hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch. Điều này là do ở dạng dung dịch khi tăng lên đến nhiệt độ lớn hơn 1000C thì cấu trúc tâm hoạt động của enzym bị phá hủy hoàn toàn. + Đáng chú ý khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt độ thấp hơn papain ở trong mủ nhựa, bởi lẽ trong mủ nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ nó, papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng, enzyme mất hoạt tính của nó mỗi ngày 1÷ 2% do sự tự phân hoặc oxy hóa. + Khi thủy phân protein tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ tối ưu cho papain cũng khác nhau, đối với cơ chất casein nhiệt độ tối ưu là 37oC, papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời gian 2h mà hoạt tính vẫn duy trì được 90%. - pH: + Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 ÷ 8,2 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH >12, khi phản ứng với các cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Chẳng hạn papain phản ứng với casein ở pH tối ưu là 7 ÷ 7,5 với albumin ở pH tối ưu 4,5 ÷ 7,1 và với gelatin lại có pH tối ưu 5,2 ÷ 6,4, điểm đẳng điện pI = 9. + Papain dạng ổn định tức là dạng mà cấu trúc không gian của enzym được ổn định, có thể chịu được các pH=1,5 và pH= 8,5 trong 90 phút. Người ta nhận thấy rằng, sự thay đổi pH có ảnh hưởng lớn đến trạng thái ion hóa của cả enzyme và cơ chất nên sẽ tác động đến quá trình hình thành phức hợp enzyme-cơ chất [ES], từ đó làm thay đổi vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác [74]. - Dung môi: + Papain cần nhóm sulfhyryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Chất hoạt hóa có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của protease thực vật nói chung hay papain nói C C DU R L T.