Tài liệu Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp để thu nhận bioethanol

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Đỗ Hữu Nghị và PGS.TS. Tăng Thị Chính. Các số liệu và kết quả được nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Vũ Đình Giáp i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Hữu Nghị, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và PGS.TS. Tăng Thị Chính, Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận án và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành Bản luận án này. Tôi xin cảm ơn Phòng Đào tạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẻ những kinh nghiệm chuyên môn quý báu. Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Đề tài Hợp tác song phương Việt Nam - Bỉ (Mã số: FWO.104.2017.03) và Đề tài Nghị định thư Việt Nam - CHLB Đức (Mã số: NĐT.45.GER/18) do TS. Đỗ Hữu Nghị làm chủ nhiệm. Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Tác giả Vũ Đình Giáp ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………………...…I LỜI CẢM ƠN……………………………………………………………………………II MỤC LỤC.................................................................................................................... III DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... VII DANH MỤC HÌNH…...………………………………………………………………………VIII DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………..XI MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5 1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose .................................................... 5 1.1.1. Nguồn gốc và thành phần .................................................................................. 5 1.1.2. Nguồn nguyên liệu bã mía ............................................................................... 10 1.1.2.1. Nguồn gốc và hiện trạng sử dụng bã mía ở Việt Nam……………………...10 1.1.2.2. Các vấn đề môi trường từ bã mía ........................................................... 11 1.2. Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ................................................................. 12 1.2.1. Quá trình thủy phân vật liệu giàu lignocellulose .............................................. 12 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác sinh học...................................................... 15 1.2.3. Đa dạng nấm Việt Nam cho chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose ............... 18 1.2.4. Ứng dụng của enzyme trong quá trình thủy phân lignocellulose ...................... 20 1.2.5. Vai trò carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose............................. 23 1.2.5.1. Acetyl esterase từ nấm ........................................................................... 24 1.2.5.2. Feruloyl esterase từ nấm ........................................................................ 25 1.3. Tình hình sản xuất bioethanol ................................................................................. 28 1.3.1. Hiện trạng sản xuất và sử dụng bioethanol ....................................................... 28 1.3.2. Nguồn sinh khối cho sản xuất bioethanol ......................................................... 33 1.3.3. Lên men sản xuất bioethanol ........................................................................... 35 1.4. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong và ngoài nước ............................................ 38 1.4.1. Tình hình nghiên cứu bioethanol ngoài nước ................................................... 38 iii 1.4.2. Tình hình nghiên cứu bioethanol trong nước.................................................... 41 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 44 2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 44 2.1.1. Vật liệu giàu lignocellulose ............................................................................. 44 2.1.2. Vi sinh vật…………………………………………. …………..……………...44 2.1.3. Thiết bị, hóa chất ............................................................................................. 45 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 45 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật .................................................................................. 45 2.2.1.1. Phân lập nấm ......................................................................................... 45 2.2.1.2. Nuôi cấy và bảo quản nấm men .............................................................. 46 2.2.1.3. Lên men bioethanol ................................................................................ 47 2.2.2. Định danh nấm ............................................................................................... 48 2.2.2.1. Định danh nấm bằng phương pháp hình thái giải phẫu .......................... 48 2.2.2.2. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............................. 49 2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm ......................................... 50 2.2.3.1. Sàng lọc trên đĩa thạch.......................................................................... 50 2.2.3.2. Sàng lọc trên môi trường lên men bề mặt và dịch thể ............................ 50 2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt độ enzyme ........................................................... 51 2.2.4.1. Hoạt độ acetyl esterase .......................................................................... 51 2.2.4.2. Hoạt độ feruloyl esterase ....................................................................... 52 2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase ....................................... 52 2.2.5.1. Xác định nguồn nitơ và cơ chất giàu lignocellulose................................ 52 2.2.5.2. Xác định nhiệt độ, pH thích hợp...............................................................52 2.2.6. Tinh sạch protein enzyme ................................................................................ 53 2.2.6.1. Tách chiết, tinh sạch protein enzyme ...................................................... 53 2.2.6.2. Xác định hàm lượng protein ................................................................... 53 2.2.6.3. Điện di trên gel polyacrylamide có SDS.....................................................54 2.2.6.4. Điện di điểm đẳng điện...............................................................................54 2.2.6.5. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme tinh sạch................................54 iv 2.2.6.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch ..................... 55 2.2.7. Phương pháp hóa sinh..................................................................................... 55 2.2.7.1. Sắc ký bản mỏng .................................................................................... 55 2.2.7.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao....................................................................... 55 2.2.7.3. Xác định peptide bằng phổ khối sử dụng nguồn ion hóa mẫu ESI-MS…...56 2.2.7.4. Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic ............... 57 2.2.7.5. Xử lý nguyên liệu……………..………………………………………………….58 2.2.7.6. Xác định hàm lượng bioethanol .............................................................. 59 2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose ........................... 60 2.2.9. Quy hoạch thực nghiệm ................................................................................... 61 2.2.10. Xử lý số liệu .................................................................................................. 63 2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu ................................................................................... 63 2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm ........ 63 2.3.2. Sơ đồ xử lý bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ....... 66 2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa ....................................... 68 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 70 3.1. Phân lập và sàng lọc nấm ....................................................................................... 70 3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota ...................................................................... 70 3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota ............................................................................. 70 3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm ........................................ 70 3.3. Định danh các chủng phân lập hoạt tính cao .......................................................... 75 3.3.1. Định danh chủng SP66 .................................................................................... 75 3.3.2. Định danh chủng A35 ...................................................................................... 78 3.4. Nghiên cứu sinh tổng hợp esterase .......................................................................... 81 3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35............... 81 3.4.2. Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66 ......... 86 3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm ....................................................... 91 3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35................... 91 3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase bởi nấm Alt. tenuissima SP66 .............. 95 v 3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch enzyme esterase từ nấm.................100 3.5.3.1. Acetyl esterase từ nấm X. polymorpha A35 ...........................................100 3.5.3.2. Feruloyl esterase từ nấm Alt. tenuissima SP66 …………………….…….103 3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa bằng xúc tác sinh học105 3.6.1. Sàng lọc cơ chất..............................................................................................105 3.6.2. Hàm lượng đường khử sau chuyển hóa sinh học .............................................106 3.7. Tối ưu hóa “enzyme cocktail” bằng mô hình quy hoạch thực nghiệm ....................107 3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa ............................................115 3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail” ............................115 3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”..............................117 3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail” ..........119 3.8.4. Hàm lượng các đường đơn sau chuyển hóa .....................................................121 3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol .............................................................................122 3.9.1. Ảnh hưởng thành phần môi trường .................................................................122 3.9.2. Ảnh hưởng thời gian lên men ..........................................................................124 3.9.3. Ảnh hưởng pH ................................................................................................127 3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ ........................................................................................128 3.9.5. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men ...............................................................................130 3.9.6. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .............................................133 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................136 KẾT LUẬN .................................................................................................................136 KIẾN NGHỊ ................................................................................................................137 DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..................138 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................139 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose ................................. 6 Bảng 1.2. Một số dự án sản xuất bioethanol nhiên liệu tại Việt Nam ............................. 32 Bảng 2.1. Thành phần môi trường lên men.…………......................................................48 Bảng 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase và acetyl esterase của các chủng nấm.................. 71 Bảng 3. 2. Tinh sạch enzyme hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) ................................... 93 Bảng 3. 3. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66 .......... 96 Bảng 3. 4. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt. tenuissima SP66 xác định bằng thủy phân với trypsin và LC-ESI-MS/MS ............................................... 99 Bảng 3. 5. Hoạt tính đặc hiệu của “enzyme cocktail” trong chuyển hóa sinh học ......... 100 Bảng 3. 6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa ......................................... 108 Bảng 3. 7. Kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson ................................................... 111 Bảng 3. 8. Kết quả thí nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai Box – Wilson.............. 111 Bảng 3. 9. Ma trận kế hoạch và kết quả thực nghiệm ................................................... 112 Bảng 3. 10. Các hệ số hồi quy và giá trị T ................................................................... 113 Bảng 3. 11. Kết quả thực nghiệm so sánh với kế hoạch trực giao Box – Wilson .......... 114 Bảng 3. 12. Tổng đường khử sau quá trình thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail” ....................................................................................................... 120 Bảng 3. 13. Hàm lượng một số các đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa ......... 121 Bảng 3. 14. Hiệu suất quá trình lên men trên môi trường BM và BM+ ........................ 123 Bảng 3. 15. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men .............................................. 124 Bảng 3. 16. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men ...................................................... 127 Bảng 3. 17. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men .............................................. 128 Bảng 3. 18. Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men đến hiệu suất lên men ...................................... 130 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose .............................................................................. 6 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose ........................................................................ 7 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan............................................................................... 9 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin .............................................................................. 9 Hình 1.5. Hiện trạng sản xuất mía đường các vùng của Việt Nam ................................. 11 Hình 1.6. Vai trò tiền xử lý trong chuyển đổi sinh khối thành nhiên liệu........................ 15 Hình 1.7. Cấu trúc các enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa lignocellulose ......... 19 Hình 1.8. Hệ cellulase tham gia thủy phân mạch cellulose ............................................. 21 Hình 1.9. Cấu trúc xylan được tấn công bởi những enzyme thủy phân khác nhau ............ 23 Hình 1.10. Liên kết dạng cầu nối của axit ferulic và dimer với arabinoxylan và lignin ... 25 Hình 1.11. Nếp gấp đặc trưng α/β-hydrolase.................................................................. 27 Hình 1.12. Sản lượng nhiên liệu sinh học giai đoạn 2008 – 2022 ................................... 29 Hình 1.13. Sản lượng bioethanol tại một số quốc gia và khu vực trên thế giới ............... 30 Hình 1.14. Cấu trúc amylose ......................................................................................... 34 Hinh 2. 1. Đường chuẩn biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ ρ-Nitrophenol . 51 Hinh 2. 2 Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra Centrifugal ........ 53 Hinh 2. 3. Phương trình phản ứng giữa đường khử và axít dinitrosalicylic .................... 57 Hinh 2. 4. Đường chuẩn glucose biểu thị giữa mật độ quang và nồng độ glucose ......... 58 Hinh 2. 5. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mô hình tối ưu thực nghiệm....... 64 Hinh 2. 6. Sơ đồ xử lý bã mía theo phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail” ...... 66 Hinh 2. 7. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa.................................... 68 Hình 3. 1. Hoạt tính feruloyl esterase của chủng nấm phân lập Alt. tenuissima SP66 ..... 73 Hình 3. 2. Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% (A) và (B) Sản phẩm PCR của hai chủng nấm (SP66 và A35) ................................................................................. 75 Hình 3. 3. Mối quan hệ họ hàng của chủng SP66 với các loài/dưới loài trong cùng chi . 77 Hình 3. 4. Chủng Alt. tenuissima SP66 phát triển trên MT thạch và hình thái bào tử....78 Hình 3. 5. Mối quan hệ họ hàng của chủng nấm A35 với các loài/thứ trong cùng chi .... 80 viii Hình 3. 6. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên môi trường rắn ……………………………………………………………………………......80 Hình 3. 7. Sự phát triển của nấm X. polymorpha A35 trên MT lỏng ở ngày thứ 10 ........ 82 Hình 3. 8. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên các môi trường có bổ sung cơ chất ....................................................................................... 83 Hình 3. 9. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau bởi nấm X. polymorpha A35.. 84 Hình 3. 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên môi trường lỏng .......................................................................... 85 Hình 3. 11. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase ............................. 86 Hình 3. 12. Động học sinh tổng hợp feruloyl esterase (A) và hoạt tính enzyme cao nhất (B) trên các môi trường khác nhau ................................................................................. 87 Hình 3. 13. Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau ……………………………89 Hình 3. 14. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase .................. 90 Hình 3. 15. Ảnh hưởng của pH đến sự sinh tổng hợp feruloyl esterase ......................... 91 Hình 3. 16. Tinh sạch enzyme XpoAE từ X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng 92 Hình 3. 17. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A) và IEF (B); (2,4) protein marker ............................................... 93 Hình 3. 18. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt độ (B) đến hoạt tính của XpoAE tinh sạch 94 Hình 3. 19. Độ bền của enzyme XpoAE tinh sạch bởi nấm X. polymorpha A35 (XpoAE) ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau ......................................................... 95 Hình 3. 20. Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt.tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi anion Q Sepharose® ....................................................................................................... 96 Hình 3. 21. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính AltFAE trên gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker .................................................................................................. 97 Hình 3. 22. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) đến hoạt tính enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 ...................................................................................................... 97 Hình 3. 23. Độ bền nhiệt của enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 ở nhiệt độ khác nhau (A) và giá trị pH (B) phụ thuộc vào thời gian ................................................ 98 ix Hình 3. 24. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt. tenuissima SP66 .............................................................................................. 99 Hình 3. 25. Quy trình chiết tách và tinh sạch protein enzyme hoạt tính acetyl esterase từ môi trường nuôi cấy nấm X. polymorpha A35 ............................................................. 102 Hình 3. 26. Quy trình chiết tách và tinh sạch enzyme hoạt tính feruloyl esterase từ môi trường lên men nấm Alt. tenuissima SP66.................................................................... 104 Hình 3. 27. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng ............................................ 105 Hình 3. 28. Hàm lượng đường khử tạo thành sau quá trình thủy phân bã mía bằng các đơn enzyme và “enzyme cocktail” ............................................................................... 107 Hình 3. 29. Đường khử sinh ra sau quá trình xử lý bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail” ...................................................................................................................... 116 Hình 3. 30. Đường khử sinh ra sau quá trình thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail” ...................................................................................................................... 118 Hình 3. 31. Ảnh hưởng thành phần môi trường đến hiệu suất lên men ......................... 124 Hình 3. 32. Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất lên men ............................................... 126 Hình 3. 33. Ảnh hưởng pH đến hiệu suất lên men........................................................ 128 Hình 3. 34. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất lên men ................................................ 129 Hình 3. 35. Ảnh hưởng tỷ lệ giống nấm men đến hiệu suất lên men............................. 131 Hình 3. 36. Quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía .................................................... 134 x DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt BLAST Basic local alignment search tool Công cụ so sánh các chuỗi sinh học bp Base pair Cặp bazơ nitơ M Marker Thang chuẩn CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton ĐC Đối chứng OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi tổng hợp SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE TLC Sodium dodecyl sulfate Điện di trên gel polyacrylamide gel electrophoresis polyacrylamide có SDS Thin Layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích DNS Acid dinitrosalicylic HPLC High performance liquid chromatography CE Carbohydrate esterase AE FAE rpm Enzyme acetyl esterase Enzyme Feruloy esterase Revolutions per minute Số vòng/phút Gram dry sustrate Nhiên liệu sinh học Gam cơ chất khô NLSH gds IEF CT Sắc ký lỏng hiệu năng cao Điểm đẳng điện Công thức Isoelectric focusing KXĐ Không xác định xi MỞ ĐẦU Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên thế giới. Trong số các nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Dựa vào nguyên liệu sản xuất, người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngô, sắn, mía đường), thế hệ II (từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các loài vi tảo) và thế hệ IV - nhiên liệu tiên tiến (dựa trên các chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt – hóa). Chúng phân thành ba nhóm là dầu sinh học (biodiesel), khí sinh học (biogas) và bioethanol (ethanol sinh học). Trong đó, bioethanol đang rất được quan tâm do từ ngày 01/01/2018 chính phủ ban hành quyết định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol) thay thế xăng RON 92 trên toàn quốc. Do vậy, nhu cầu sản xuất và tiêu thụ bioethanol ngày càng tăng cao. Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung và bioethanol theo thế hệ I từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía) rất phổ biến. Bên cạnh đó, bioethanol còn được sản xuất từ lignocellulose theo thế hệ thứ II. Nguồn nguyên liệu này chủ yếu bao gồm: gỗ, rơm lúa, bã mía, thân cây ngô…là các sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này sử dụng chưa hiệu quả mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống như làm cơ chất nuôi nấm, thức ăn gia súc, ủ làm phân bón, đốt... Do vậy, việc tận dụng nguồn cơ chất này để sản xuất bioethanol là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam. Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose rất phổ biến nhưng những khó khăn để có thể tận dụng hiệu quả nguồn sinh khối này cho sản xuất các sản phẩm có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa sinh học. Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm công - nông nghiệp một mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống, mặt khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốt hoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh 1 lượng thực quốc gia. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II. Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý (nghiền/nổ hơi). Tuy nhiên, một trong những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinh học (enzyme từ các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt lignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol. Nhìn chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp trên cơ chất thô và việc xúc tác chuyển hóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme có tác dụng hiệp đồng. Do vậy, mục đích của đề tài luận án “Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông nghiệp để thu nhận bioethanol” nhằm sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp để lên men thu nhận bioethanol. Mục tiêu nghiên cứu: Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose bằng các phương pháp truyền thống còn nhiều mặt hạn chế. Do vậy, mục tiêu của đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm công-nông nghiệp thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol. Đặc biệt, luận án sử dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học. Trong đó, nghiên cứu sử dụng carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn công mạch chính (cellulase/xylanase) và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose. Mục tiêu tiếp theo là đánh giá khả năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol. Nội dung nghiên cứu: Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện: - Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)]; 2 - Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ môi trường nuôi cấy nấm và xác định đặc tính của enzyme tinh sạch. - Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có khả năng lên men sử dụng đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng. - Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường chuyển hóa quy mô phòng thí nghiệm. Những đóng góp mới của luận án: - 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm (Basidiomycota) được phân lập và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase). - Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl esterase từ nấm Xylaria polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose. Trong đó, feruloyl esterase từ Alt. tenuissima (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg. Acetyl esterase từ X. polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc hiệu 13,1 U/mg. Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 450C và pH 5,0. - Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thô (vd. mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Trong đó, bã mía được chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C5/C6 (vd: glucose, xylose). - Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía bằng “enzyme cocktail” là ở 400C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g sinh khối khô. Khi đó, tổng các đường lên men là 251,86 mg/g. Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail” và axit H2SO4 loãng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất 49,8%. 3 - Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng lên men bioethanol (cồn sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía, đạt hiệu suất 79,8% so với lý thuyết. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án: Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía), bioethanol có thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại sinh khối (biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển. Sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam. Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm giàu lignocellulose là nguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môi trường do không được xử lý hay loại bỏ theo phương pháp truyền thống. Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, nhìn chung các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không qua tiền xử lý) trên cơ chất thô. Điều này có thể khắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp. Ngoài ra, sàng lọc enzyme bằng nuôi cấy vi sinh vật có vai trò quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy phân cao và các đặc tính hữu ích. Đề tài luận án không nhằm giải quyết được toàn bộ các bước từ chuyển hóa vật liệu sinh khối thô thành bioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa cho chuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng lên men. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II. 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phụ phẩm công - nông nghiệp giàu lignocellulose 1.1.1. Nguồn gốc và thành phần Phụ phẩm công-nông nghiệp là một dạng sinh khối có thành phần lignocellulose phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp của Việt Nam. Hiện nay, mỗi năm nguồn sinh khối này sản sinh ra hàng trăm triệu tấn từ quá trình sản xuất công-nông nghiệp như: rơm rạ, bã cà phê, mùn gỗ, thân cây ngô, vỏ trấu và hàng chục triệu tấn bã mía thường được sử dụng để đun nấu (lãng phí nhiệt trên 80%), cơ chất để trồng nấm, thức ăn gia súc và phần lớn được đốt bỏ thu tro làm phân bón [1]. Việc đốt này gây ra hiện tượng sương mù quang hóa rất độc hại là nguyên nhân gây nên một số bệnh về mắt, phổi. Nguy hiểm hơn, chúng gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng ở vùng ven các thành phố lớn và dọc các đường cao tốc làm giảm tầm nhìn dễ dẫn đến tai nạn giao thông. Đặc biệt, gây lãng phí lượng lớn chất hữu cơ có giá trị, trong khi đó nếu khai thác sử dụng hợp lý thì nguồn sinh khối này đem lại lợi ích vô cùng lớn [2,3]. Lignocellulose ngày càng có vai trò quan trọng về mặt kinh tế khi được sử dụng như vật liệu thô cho các ứng dụng trong công nghệ sinh học và công nghiệp, hơn nữa chúng chính là cơ sở để thúc đẩy việc nghiên cứu tận dụng sinh khối trong các mô hình sản xuất tinh chế và chiến lược cho sự phát triển bền vững [4]. Các polymer sinh học này có thể thấy ở tất cả các hệ sinh thái trên đất liền và đây là nguồn hợp chất hữu cơ tái tạo lớn nhất trong sinh quyển. Xét về nguồn gốc, thành phần và mức độ polymer hóa, có thể phân biệt các loại lignocellulose như: từ cây gỗ cứng, gỗ mềm cũng như từ cây trồng hàng năm (đặc biệt là cây lúa, ngũ cốc, các loại cỏ, cây mía…) và thân cây thảo [5,6]. Lignocellulose là một phức hợp polyme thành tế bào ở thực vật, chiếm 60% tổng sinh khối thực vật trên trái đất, bao gồm các thành phần chính là các polymer carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và một polymer thơm (lignin), trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 40% - 50%, còn hai hợp chất hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 - 40% và 20 - 35% khối 5 lượng khô của cơ thể thực vật (Bảng 1.1) [1]. Ngoài các thành phần này, Lilholt còn cho rằng pectin cũng là thành phần chính của lignocellulose thành tế bào, đặc biệt là ở các cấu trúc sợi thực vật không phải thành phần gỗ [7]. Bảng 1.1. Thành phần một số nguồn sinh khối giàu lignocellulose [1] Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thành phần khác (%) Gỗ cứng 45-47 25-40 20-25 0,8 Gỗ mềm 40-45 25-29 30-36 0,5 Cỏ 25-40 35-50 - - Bã mía 40 24 25 - Lõi ngô 45 35 15 Rơm rạ 35 25 12 Bột giấy 50-70 12-20 6-10 Rơm lúa mì 30 50 20 Phế thải nông nghiệp khác 37-50 35-50 5-15 12-16 Hình 1.1. Cấu trúc của lignocellulose [8] Lignocellulose là một vật liệu khó thủy phân do chúng có các liên kết polysaccharid (cellulose và hemicellulose), liên kết ester và ete (lignin) tạo nên cấu trúc rất bền vững có độ cứng và độ bền cơ học cao (Hình 1.1). Xét về thành phần lignocellulose bao gồm: 6 Cellulose: Cellulose là một polymer mạch thẳng, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n. Các đơn phân hoàn toàn cấu tạo từ đường D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4glucoside với số lượng lên tới hơn 10.000 đơn vị. Cấu trúc liên kết thẳng cho phép hình thành liên kết hydro trong và giữa phân tử tạo ra các vi sợi từ 36 chuỗi cellulose xếp song song, hay cấu trúc tinh thể của cellulose. Mức độ trùng hợp của cellulose tự nhiên có thể đạt 10.000-14.000 đơn vị glucose trên phân tử, khối lượng tương ứng là 1,5 triệu dalton với chiều dài phân tử có thể lớn hơn hoặc bằng 5µm [9]. Giữa các chuỗi cellulose có rất nhiều gốc -OH tạo nên rất nhiều liên kết hydro giúp ổn định sợi cellulose, làm cho sợi cellulose rất bền vững, khó thủy phân. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của cellulose [10] Sợi cellulose có thể kết hợp với nhau một cách chặt chẽ, có trật tự hình thành nên vùng có cấu trúc tinh thể (Hình 1.2). Bên cạnh đó cũng có một số sợi cellulose kết hợp một cách ngẫu nhiên hình thành nên vùng có cấu trúc vô định hình. Từ đó cho thấy các dung môi và các chất hóa học rất khó xâm nhập vào vùng tinh thể, nhưng lại dễ dàng xâm nhập vào vùng vô định hình [11]. Hemicellulose: Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 - 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm D-glucose, D-mannose, D-galactose và đường 5 gồm D-xylose và L-arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β-D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β-(1,4). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung bao gồm [12]: 7 Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β-(1,4), xylose là thành phần quan trọng nhất và nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl-O- liên kết với vị trí 2 hoặc 3. Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân. Tùy theo loại gỗ (gỗ cứng, gỗ mềm) mà chúng có đặc điểm hemicellulose khác nhau: Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose: Acetyl-4-O-methyglucuronoxylan, là một loại polymer có mạch chính gồm β-D xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D(1,4). Trong đó 70% các nhóm -OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-O-methyl-Dglucuronic. Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ lệ bằng nhau β-Dglucopyranose và β-D-mannopyranose. Loại thứ hai có mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại hemicellulose này tạo liên kết -O tại nhóm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose, β-Dgalactose hoặc acid β-D-glucoronic [13]. Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính: Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ lệ hai monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ. Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α-Larabinofuranose. Đối với cỏ, 20-40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này cấu tạo từ các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic. OH ở vị trí C3 sẽ tạo mạch nhánh với α-L-arabinofuranose. Cấu tạo phức tạp của hemicellulose tạo nên nhiều tính chất hóa sinh và lý sinh cho cây [13]. 8 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của xylan [8] Lignin: Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu transsinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p courmary. Lignin là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc vô định hình khác với cellulose, lignin có chứa các nhóm hydroxyl (-OH), nhóm methoxyl (-OCH3) và nhân benzen bao gồm các đơn vị cơ bản: coniferyl alcohol, sinapyl alcohol và p-coumaryl alcohol, tỉ lệ ba loại rượu này trong các loại thực vật khác nhau thì khác nhau (Hình 1.4). Lignin đặc biệt khó phân hủy do các phân tử được nối với nhau bởi liên kết este và liên kết carbon, tạo thành một mạng lưới liên kết ngang rộng rãi trong các tế bào [13]. Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của lignin [13] 9